АНТИДЕПРЕССИВНОЕ СРЕДСТВО

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии.

Изобретение касается синтетического биологически активного соединения-гидрохлорида 2-(диэтиламино)-этилового эфира 9-гидрокси-9Н-флуоренкарбоновой кислоты, являющегося производным М-холиноблокатора амизила, которое расширяет арсенал фармакологических средств, используемых в качестве терапии депрессии. Данное производное амизила ранее не было описано ни в одном медицинском источнике. Заявляемое соединение обладает низкой токсичностью, синтез его прост и доступен.

На различных экспериментальных моделях авторами заявки установлено, что гидрохлорид 2-(диэтиламино)-этилового эфира 9-гидрокси-9Н-флуоренкарбоновой кислоты проявляет выраженную антидепрессивную активность и противотревожное действие, обладает седативным, а в более высоких дозах и снотворным эффектами, а также положительно влияет на исследовательскую способность и память. Кроме того, установлено, что заявляемое фармакологическое средство по выраженности антидепрессивных свойств превосходит широко применяемый трициклический антидепрессант амитриптилин. Полученные данные позволяют рекомендовать данное производное амизила в качестве антидепрессивного средства для лечения депрессии и тревожных расстройств.

Известно, что депрессия является тяжелым заболеванием, распространяющимся более, чем на 12% населения экономически развитых стран [Депрессивноподобное состояние и сон у лабораторных мышей. Журнал высшей нервной деятельности, 2008, том 58, №6, с.728-737].

Несмотря на то, что эффективные методы лечения депрессии существуют уже много лет, лишь половина больных отвечает объективным улучшением своего состояния в ответ на применение имеющихся антидепрессантов. Большая часть ранее разработанных групп лекарственных препаратов вызывает серьезные или неприятные побочные действия [Как улучшить коэффициент риска и пользы антидепрессантов? Международная клиническая психофармакология 1993; 8: 237-41].

Прототипом изобретения явился трициклический антидепрессант амитриптилин, обладающий выраженным антидепрессивным действием.

Однако известно, что амитриптилин, используемый авторами в качестве препарата сравнения, обладает выраженными периферическими холинолитическими эффектами, такими как сухость во рту, расширение зрачков, нарушение аккомодоции, задержка мочеиспускания, а также рядом серьезных побочных действий: головная боль, атаксия, сонливость или бессонница, нарушение концентрации внимания, дизартрия, галлюцинации, тремор, парестезии, экстрапирамидные расстройства, судороги, дезориентация и многие другие со стороны различных систем органов. Как препарат с выраженной холинолитической активностью, амитриптилин противопоказан при глаукоме, гипертрофии предстательной железы, атонии мочевого пузыря. Его не следует назначать одновременно с ингибиторами моноаминоксидазы [Машковский М.Д. Лекарственные средства. Издание 13, том 1, 1998, стр.99].

Кроме того, препарат является кардиотоксичным, может вызывать синдром отмены и повышает риск суицидального поведения. В связи с этим сохраняется потребность в получении новых антидепрессивных лекарственных средств, характеризующихся более высокой эффективностью и переносимостью.

Авторами было решено испытать биологическую активность гидрохлорида 2-(диэтиламино)-этилового эфира 9-гидрокси-9Н-флуоренкарбоновой кислоты, химического соединения, близкого по строению к амизилу. Вещество было получено по схеме:

Трехстадийный синтез гидрохлорида 2-(диэтиламино)-этилового эфира 9-гидрокси-9Н-флуоренкарбоновой кислоты осуществляли по схеме (см.выше).

Исходную 9-гидрокси-флуоренкарбоновую кислоту (I) обрабатывали хлористым тионилом в бензоле при Т=85°С в течение 4 часов. Образовавшийся хлорангидрид (II) без выделения вводили в реакцию с диэтиламиноэтаном. Полученное основание 2-(диэтиламино)-этилового эфира 9-гидрокси-9Н-флуоренкарбоновой кислоты (III) обрабатывали бензолом, насыщенным хлористым водородом, и получали с высоким выходом гидрохлорид 2-(диэтиламино)-этилового эфира 9-гидрокси-9Н-флуоренкарбоновой кислоты (IV). Тпл.=205-207°С. ТСХ в системе: этанол:вода:аммиак (25:3:4). Rf=0,44, что отличается от Rf исходного вещества (т.е. Rf=0) и совпадает со свидетелем, полученным по методике [Burtner R.R., Cusic J.W., J. Am. Chem. Soc, 1943, 65 (8), p.1582-1585)]. Спектр ЯМР ¹H, 5, м.д. (ДМСО-d₆) 10.6 (bs, 1H, H-Cl); 7.82 (d,J=7.5 Гц, 2H); 7.56 (d,J=7.5 Гц, 2H); 7.44 (t,J=7.5 Гц, 2H); 7.33 (t,J=7.5 Гц, 2H); 6.87 (s,1H); 4.33 (m, 2H); 3.16 (m, 2H); 2.77 (m, 4H); 0.97 (t,J=7.3 Гц). Элементарный анализ соответствует формуле C₂₀H₂₄ClNO₃.

В основе патогенеза депрессивного расстройства лежат нарушения синаптической передачи. Согласно моноаминовой гипотезе главную роль в возникновении и развитии заболевания играет дефицит норадреналина и серотонина. Поэтому важным звеном в механизме действия антидепрессантов считают вызываемое ими накопление в мозге серотонина и норадреналина [Регистр лекарственных средств России (РЛС). Энциклопедия лекарств. - 15-й вып./ Гл. Ред. Г.Л. Вышковский. - М., 2007, стр.1160].

Достаточно часто депрессия сопровождается выраженным тревожным расстройством больного, и в клинике используется комплексное лечение депрессии сочетанием антидепрессантов и транквилизаторов. Часто используемыми транквилизаторами, обладающими выраженным противотревожным действием, являются бензодиазепины (диазепам, клоназепам, феназепам). Однако бензодиазепинам присущи и выраженные побочные эффекты, такие как нарушение дыхания и функции сердечнососудистой системы, угнетение центральной нервной системы, парадоксальные реакции, суицидальные попытки, физическая зависимость, привыкание, синдром последействия, а также врожденные пороки у детей, матери которых принимали препараты данного ряда во время беременности [Регистр лекарственных средств России (РЛС). Энциклопедия лекарств. - 15-й вып./ Гл. Ред. Г.Л.Вышковский. - М., 2007, стр.1156-1159].

В свою очередь, амитриптилину, выбранному авторами в качестве прототипа заявляемого вещества, присуще как антидепрессивное, так и противотревожное действие.

Поэтому, получив гидрохлорид 2-(диэтиламино)-этилового эфира 9-гидрокси-9Н-флуоренкарбоновой кислоты (производное холиноблокатора амизила, ранее занесенного в группу транквилизаторов), авторами было решено опробировать вновь синтезированное вещество на модели депрессии, а также оценить его противотревожные свойства, влияние на двигательную, исследовательскую активность, память и сон.

Гидрохлорид 2-(диэтиламино)-этилового эфира 9-гидрокси-9Н-флуоренкарбоновой кислоты - химическая формула;

Благодаря своему строению оказался замечательным новым биологически активным соединением. Эффект от его применения превзошел ожидание, после чего препарат подвергли более подробному исследованию с использованием комплекса поведенческих методик и методов, позволяющих подтвердить отсутствие у него побочных эффектов, характерных для большинства имеющихся в настоящее время антидепрессантов.

Поведенческие тесты

Перед проведением экспериментов все крысы были предварительно протестированы в «открытом поле». Поведенческие тесты проводили с использованием животных, имеющих средний уровень спонтанной двигательной активности.

Все поведенческие методики проводились на крысах-самцах породы Вистар массой 180-200 г. В каждом тесте специфическую активность или совокупность поведенческих показателей изучали на 40 животных, которых делили на 4 группы (по 10 животных в каждой группе). Первую группу составляли интактные животные. Крысам второй группы ежедневно в течение 30 дней внутрибрюшинно вводили физиологический раствор. Третья группа также внутрибрюшинно ежедневно получала гидрохлорид 2-(диэтиламино)-этилового эфира 9-гидрокси-9Н-флуоренкарбоновой кислоты (именуемый в представленных далее таблицах как вещество «А») в дозе 15 мг/кг (¹/₁₀ ЛД50). Животным четвертой группы внутрибрюшинно вводили препарат сравнения амитриптилин. На 30-й, 31-й дни проводили тест. Для полученных данных вычисляли среднюю арифметическую и среднюю стандартную ошибку (М±m). Статистическую обработку проводили методом однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с использованием программ «Origin» и «Statistica 6».

Влияние гидрохлорида 2-(диэтиламино)-этилового эфира 9-гидрокси-9Н-флуоренкарбоновой кислоты на депрессивноподобное поведение крыс в тесте Порсолта.

Опыты проводили в соответствии с Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, 2000.

Материалы и методы.

Суть метода состоит в том, что крысу помещают в сосуд 30-40 см в диаметре и глубиной 60 см, который заполнен водой с температурой 25 градусов. Крысы при плавании в ограниченном пространстве, из которого невозможно выбраться, после начального периода активных попыток резко снижают свою активность и зависают в воде в характерной позе. Стадия неподвижности (иммобильности) в тесте интерпретируется как депрессивноподобное состояние.

Тест проводили в два этапа. В первый день эксперимента животное помещали в сосуд с водой, где оно плавало в течение 15 мин, после чего животное удаляли, высушивали, а затем помещали в домашние клетки. Через 24 часа проводили тестирование выраженности депрессивноподобного состояния. Крысу снова помещали в сосуд с водой и в течение 5 мин регистрировали время иммобильности (т.е. полного отсутствия плавательных движений при пассивном удержании животного на воде).

Результаты (табл.1) показали, что гидрохлорид 2-(диэтиламино)-этилового эфира 9-гидрокси-9Н-флуоренкарбоновой кислоты оказывает выраженное антидепрессивное действие в тесте Порсолта, имея достоверно более низкое количество замираний и меньшую длительность иммобильности по сравнению с интактными и контрольными животными. Амитриптилин также имеет достоверно более низкие анализируемые величины по сравнению с интактной и контрольной группой, однако количество и суммарная длительность неподвижных состояний у него достоверно больше, чем у заявляемого вещества. Из этого сделано заключение, что гидрохлорид 2-(диэтиламино)-этилового эфира 9-гидрокси-9Н-флуоренкарбоновой кислоты не только ярко проявляет себя как антидепрессивное средство, но и превосходит по основному эффекту широко применяемый трициклический антидепрессант.

Сравнительный анализ транквилизирующей активности гидрохлорида 2-(диэтиламино)-этилового эфира 9-гидрокси-9Н-флуоренкарбоновой кислоты и амитриптилина в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт».

Материалы и методы

«Приподнятый крестообразный лабиринт» является одной из наиболее чувствительных моделей тревожности, основанной на баллансе между естественным страхом животного перед открытым пространством, высотой и новизной и одновременным стремлением исследовать незнакомые условия. При этом уровень тревожности традиционно оценивается по степени подавления исследовательской активности.

В работе был использован лабиринт, состоящий из двух открытых и двух закрытых рукавов, расположенных крестообразно и приподнятых над полом на 50 см. Ширина рукавов составляла 10 см, высота стенок в закрытых рукавах - 45 см. Сверху все рукава были открыты. В месте перпендикулярного пересечения рукавов находилась площадка размером 10×10 см, на которую сажали тестируемую крысу. Поведение животных регистрировали в течение 5 мин и оценивали следующие параметры: количество заходов в открытые и закрытые рукава, время нахождения в открытых и закрытых рукавах. Анксиолитический эффект препарата оценивался по увеличению числа заходов в светлые рукава и времени нахождения в них без увеличения общего числа заходов [Воронина Т.А., Середенин С.Б. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических средств, 2000, стр.127-128].

Результаты (табл.2) показали, что гидрохлорид 2-(диэтиламино)-этилового эфира 9-гидрокси-9Н-флуоренкарбоновой кислоты и амитриптилин достоверно увеличивают число заходов и время, проведенное в открытых рукавах, и уменьшают аналогичные показатели в закрытых рукавах по сравнению с контрольной группой. Изучаемые показатели заявляемого вещества близки по своим абсолютным величинам к таковым у препарата сравнения. Отсюда следует заключить, что гидрохлорид 2-(диэтиламино)-этилового эфира 9-гидрокси-9Н-флуоренкарбоновой кислоты оказывает противотревожное (транквилизирующее) действие, приближающееся к таковому у амитриптилина.

Влияние гидрохлорида 2-(диэтиламино)-этилового эфира 9-гидрокси-9Н-флуоренкарбоновой кислоты и амитриптилина на поведение крыс в тесте «открытое поле».

Материалы и методы.

В основе поведения животного в данном тесте лежит баланс мотиваций - стремление исследовать новую обстановку и страх перед ней. От того, в какую сторону сдвинут этот баланс, зависит результирующее поведение животного [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, 2000].

«Открытое поле» в модификации «Real Timer», используемое нами, представляло собой круглую площадку (арену). Пол площадки был расчерчен на три ряда секторов одинаковой площади, поэтому за единицу перемещения принимали один пересеченный сектор (при условии пересечения его всеми четырьмя лапами животного). На пересечении секторов имелись небольшие округлые отверстия. Регистрировали горизонтальную двигательную активность на периферии, в ²/₃ и в центре арены; вертикальную двигательную активность (представлена двумя видами стоек: с опорой передними лапами на стенку и без нее); груминг; обследование (обнюхивание) отверстий (норок), т.е. погружение в них головы крысы «по глаза», как показатель исследовательсой способности, и уровень дефекации, который считается индексом эмоциональности животного [CS. Holl. Emotional behavior in rat. III. The relationship between emotionality and ambulatory activity. 1936. J. сотр. Psychol, vol.22, pp.345-352. Я. Буреш, О. Бурешова, Д.П. Хьюстон. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. 1991. Москва. «Высшая школа», стр.119-122]. Отдельно отмечали наличие замираний животного как показатель крайней степени тревожности и эмоционального напряжения.

Результаты (табл.3) показали, что в целом двигательная активность при применении гидрохлорида 2-(диэтиламино)-этилового эфира 9-гидрокси-9Н-флуоренкарбоновой кислоты у животных снижается, о чем свидетельствует достоверное уменьшение числа пересеченных квадратов в наружном секторе поля. Данный результат говорит о наличии у заявляемого препарата седативного действия, что перспективно в случае использования его для снятия депрессивных и тревожных эпизодов. В случае же препарата сравнения двигательная активность приближается по показателям к контролю. Необходимо отметить, что в случае обоих исследуемых препаратов отсутсвуют замирания, имеющиеся у животных контрольной и интактной групп, что расценивается как наличие у них антидепрессивной и транквилизирующей активности. Положительное влияние на эмоциональную сферу животных также подтверждает достоверное уменьшение количества актов дефекации по сравнению с контролем, а также достоверное снижение в случае гидрохлорида 2-(диэтиламино)-этилового эфира 9-гидрокси-9Н-флуоренкарбоновой кислоты числа груминговых реакций, являющихся признаком повышенной тревожности. Показатели исследовательской способности, как правило, увеличивающиеся при низком уровне тревожности, такие как число вертикальных стоек и пересечение секторов в центре арены, также выше у обоих препаратов, чем у контрольной группы, хотя и не имеют достоверных различий. Отдельно следует отметить достоверное увеличение количества обнюхивания норок у животных, получавших гидрохлорид 2-(диэтиламино)-этилового эфира 9-гидрокси-9Н-флуоренкарбоновой кислоты по сравнению с контролем (при том, что у амитриптилина эти показатели близки к контрольным). Это свидетельствует о высокой исследовательской способности животных, получавших вновь синтезированный препарат. Данный факт обнаруживает дополнительное преимущество заявляемого вещества в сравнении с широко применяемым трициклическим антидепрессантом, т.к. обладая выраженным антидепрессивным, противотревожным и седативным эффектами, он еще положительно влияет на исследовательскую способность.

Влияние гидрохлорида 2-(диэтиламино)-этилового эфира 9-гидрокси-9Н-флуоренкарбоновой кислоты и амитриптилина на память крыс. Условная реакция пассивного избегания (УРГДТ).

Материалы и методы

Модель УРПИ характеризуется тем, что животное обучается избегать действия болевого стимула путем подавления специфического биологического поведения [Я. Буреш, О. Бурешова, Д.П. Хьюстон. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. 1991. Москва. «Высшая школа»].

УРПИ вырабатывали на основе однократного электрокожного подкрепления в установке, состоящей из двух камер - большой (освещенной) и малой (темной) с электрифицированным полом, сообщающихся между собой круглым отверстием. При обучении крысу помещали на 3 мин в середину освещенной камеры хвостом к отверстию в темную. Животное исследовало камеру, находило отверстие в темную и проникало в нее. Вследствие своих биологических особенностей (врожденное предпочтение темных участков пространства у грызунов) крыса предпочитала находиться в темном помещении. Регистрировали латентный период захождения животного в темную камеру. В конце третьей минуты на электродный пол темной камеры подавали электрический ток (50 Гц, 6 мА), заставлявший крысу перебежать в освещенную камеру, откуда ее удаляли. Считали, что у такого животного условный рефлекс пассивного избегания выработан. Воспроизведение УРПИ определяли через 24 часа. Для этого крысу помещали в установку на 3 мин. Регистрировали тот же параметр, что и при обучении. Незахождение в темную камеру расценивали как воспроизведение навыка пассивного избегания, а укорочение времени нахождения в освещенной камере - как амнезию навыка.

Результаты (табл.4) показали, что гидрохлорид 2-(диэтиламино)-этилового эфира 9-гидрокси-9Н-флуоренкарбоновой кислоты положительно влияет на память животных. У всех 100% животных, участвовавших в тесте, было достигнуто воспроизведение навыка пассивного избегания. Анализ воздействия на память амитриптилина показал, что под его влиянием память животных не изменяется, т.е. показатели близки к контрольным (9 из 10 крыс воспроизводят навык пассивного избегания).

Хорошо известен тот факт, что, обладая периферической М-холиноблокирующей активностью, амитриптилин вызывает ряд побочных эффектов: сухость во рту, задержка мочеиспускания, запор, нарушение зрения, аккомодации, усиленное потоотделение [Регистр лекарственных средств России (РЛС). Энциклопедия лекарств. - 15-й вып. / Гл. Ред. Г.Л.Вышковский - М., 2007, стр.92]. Исходя из того, что гидрохлорид 2-(диэтиламино)-этилового эфира 9-гидрокси-9Н-флуоренкарбоновой кислоты является производным хорошо известного М-холиноблокатора амизила, авторами было решено тщательно проанализировать и сопоставить холинотропные свойства амизила, как предшественника заявляемого препарата и амитриптилина для того, чтобы всесторонне оценить их побочные эффекты. Использовалась модель ареколинового гиперкинеза. Результаты исследования показали, что М-холинолитические свойства у амитриптилина выражены в значительно меньшей степени, чем таковые у амизила, что вполне закономерно. Однако имеет интерес тот факт, что блокада периферических мускариновых рецепторов в случае амитриптилина наступает гораздо раньше, чем блокада центральных. Данные свидетельствует о превалировании у амитриптилина периферического М-холинолитического эффекта над центральным, что повышает вероятность развития побочного действия при его применении. В отличие от амитриптилина амизил проявил равную М-холинолитическую активность в отношении центральных и периферических рецепторов, что в значительной мере снижает вероятность развития периферических побочных эффектов при применении его производных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. На модели депрессии (тест Порсолта) и ряде поведенческих методик («приподнятый крестообразный лабиринт», «открытое поле», условная реакция пассивного избегания) гидрохлорид 2-(диэтиламино)-этилового эфира 9-гидрокси-9Н-флуоренкарбоновой кислоты проявил себя как вещество, обладающее выраженной антидепрессивной активностью, превосходящей таковую у широко применяемого препарата амитриптилина, и отчетливыми транквилизирующими свойствами (сопоставимые с амитриптилином). Выявлено также наличие у препарата седативного эффекта в комплексе с положительным влиянием на исследовательскую способность и память. Все вышеперечисленное делает гидрохлорид 2-(диэтиламино)-этилового эфира 9-гидрокси-9Н-флуоренкарбоновой кислоты в значительной мере перспективным в отношении терапии депрессивных и тревожных расстройств.

Меньшая выраженность периферических побочных эффектов у вновь синтезированного производного амизила по сравнению с имеющимися антидепрессантами (показанная в экспериментах с ареколиновым гиперкинезом) выгодно выделяет заявляемый препарат на фоне используемых в настоящее время фармакологических средств.