СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ОБЩЕЙ ВЫЖИВАЕМОСТИ У БОЛЬНЫХ С МЕТАСТАЗАМИ КОЛОРЕКТАЛЬНОГО РАКА В ПЕЧЕНИ ПОСЛЕ ЕЕ РЕЗЕКЦИИ

Изобретение относится к области медицины, а именно к исследованию биологического материала с помощью физических и химически методов исследования, и может быть использовано в хирургии и онкологии для прогнозирования общей выживаемости пациентов после резекции печени по поводу метастатического колоректального рака (КРР) на основе особенностей микроокружения опухоли.

Колоректальный рак занимает одно из ведущих мест в структуре онкологической заболеваемости в России и в мире. Ежегодно в мире регистрируют свыше 1,2 млн. новых случаев заболевания колоректальным раком и более 500 тыс. человек погибают от данного заболевания [Wogelsang H., Haas S., Hierholzer С. et al. Factors influencing survival after resection of pulmonary metastases from colorectal cancer // Br J Surg. - 2004. - Aug 91 (8). - p.1066-1071].

В странах Европы и США данная патология на 2-3 месте в структуре онкологической заболеваемости, уступая лишь раку легкого у мужчин и раку молочной железы у женщин. Заболеваемость колоректальным раком в России прочно занимает 4-ое место и за последнее десятилетие увеличилась более чем на 30%, что составило 58546 новых случаев в 2010 г [Чиссов В.И., Старинский В.В., Петрова Г.В. Злокачественные новообразования в России в 2010 году (заболеваемость и смертность). - М.: ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена» Минздравсоцразвития России. 2012. ил. 260].

Несмотря на совершенствование ранней диагностики и использование скрининговых программ, уже на этапе постановки диагноза у 20% больных колоректальным раком выявляют отдаленные метастазы, а у 25-30% их обнаруживают при последующем динамическом наблюдении после лечения [Goldberg R.M. Advances in the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer // The Oncologist - 2005. - 10 (suppl 3). - p.40-48]. Наиболее частой локализацией метастазов при раке толстой кишки является печень (более 50%), реже - легкие (10-25%), брюшина (10-13%), яичники (3-8% женщин) [Rena О., Casadio С., et al. Pulmonary Resection for Metastases from Colorectal Cance: factors influencing Prognosis. Twenty-year Experience. European Journal of Cardio-thoracic Surgery 21: 906-912, 2002].

На сегодняшний день проведены многочисленные исследования различных систем оценки прогноза для пациентов с диссеминированным колоректальным раком (КРР), перенесших резекцию печени по поводу метастазов печени. Большинство предложенных систем оценки прогноза из европейских институтов: Великобритании, Франции, Италии и Германии, затем из азиатских стран: Японии, Южной Кореи и из Северной Америки. Количество пациентов, включенных в эти исследования, варьировало от 81 до 1568, период наблюдения составил от 16 до 52 месяцев. Все исследования были ретроспективными. Nordlinger с соавторами [Nordlinger В, Guiguet M, Vaillant JC, Balladur P, Boudjema К, Bachellier P, Jaeck D. Surgical resection of colorectal carcinoma metastases to the liver. A prognostic scoring system to improve case selection, based on 1568 patients. Association Française de Chirurgie. Cancer. 1996 Apr 1; 77(7): 1254-62] первыми сообщили о системе прогностической оценки, которая была основана на анализе 1568 пациентов, пролеченных в 85 учреждениях Франции в течении 22 лет (1968-1990). Средний период наблюдения в этом исследовании составил 19 месяцев (диапазон 9-30), большая часть операций выполнена после 1987 г. Многофакторный анализ позволил выявить семь независимых прогностических факторов, которые включали: возраст - старше 60 лет, прорастание первичной опухолью серозного слоя толстой кишки, наличие метастазов в региональных лимфоузлах первичной опухоли, появление метастазов в печени в течение 24 месяцев после удаления первичной опухоли, размер метастазов (более 5 см), расстояние менее 1 см от края резекции до опухоли печени и более 4-х метастазов в печени. Используя свою систему оценки прогноза, всех пациентов разделили на три группы: группа высокого риска (от 5 до 7 прогностических признаков), промежуточного (от 3 до 4) и низкого риска (от 0 до 2). Двухлетняя выживаемость в этих группах составила 43%, 60%, 79% соответственно.

В 1980 году German L., Former J.G. разработали две системы оценки прогноза [Gennari L., Doci R., Bozzetti F., Bignami P. Proposal for staging liver metastases. Recent Results Cancer Res 1986; 10080-84. Former J.G., Silva J.S., Golbey R.B., Сох Е.В., Maclean B.J. Multivariate analysis of a personal series of 247 consecutive patients with liver metastases from colorectal cancer, I: treatment by hepatic resection. Ann Surg 1984; 199306-316]. Эти системы были основаны на степени опухолевой распространенности, а не на признаках, которые относятся к первичной опухоли толстой кишки.

Gayowski [Gayowski T.J., Iwatsuki S., Madariaga J.R. et al. Experience in hepatic resection for metastatic colorectal cancer: analysis of clinical and pathologic risk factors. Surgery 1994; 116703-710] - предложили модифицированную TNM систему стадирования, основанную на следующих факторах: монолобарное или билобарное поражение, единичные или множественные метастазы в печени, менее или более 2 см размер метастаза и сосудистая и протоковая инвазия опухоли. В этой системе билобарное поражение рассматривается как распространение Т4. Худший прогноз ассоциирован с множественным билобарным поражением. Хотя, другие исследователи показали, что прогноз для пациентов с множественными метастазами не зависит от моно- или билобарного поражения [Surgical indications in the treatment of liver metastases from colorectal cancer: long-term results. Ann Surg 2000; 231487-499].

Система прогноза Fong с соавторами [Fong Y., Former J., Sun R.L., Brennan M.F., Blumgart L.H. Clinical score for predicting recurrence after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: analysis of 1001 consecutive cases. Ann Surg. 1999; 230: 309-318], представляющего Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, пожалуй, самая хорошо известная прогностическая балльная система. В свое исследование они включили 1001 пациента в период с 1985 по 1998 г. Эта работа позволила идентифицировать семь прогностических переменных, полученных с помощью многофакторного анализа: наличие метастазов в лимфоузлах от первичной опухоли, безрецидивный интервал менее или равный 12 месяцам, более 4 метастазов в печени, размер метастаза более чем 5 см, уровень раково-эмбрионального антигена более чем 200 нг\мл, наличие опухоли по краю резекции и наличие экстрапеченочных метастазов. Из вышеперечисленных признаков последний наиболее показательный, и авторы утверждают, что внепеченочное распространение должно быть противопоказанием к выполнению резекции печени. Используя свою предоперационную балльную систему, Fong с соавторами исключили пациентов с экстрапеченочными метастазами. Вышеуказанная балльная система прогноза позволяет вычислить безрецидивную выживаемость. Пятилетняя безрецидивная выживаемость снижается с 60% до 14% у пациентов без независимых факторов прогноза и наличием пяти соответственно.

Во всех известных исследованиях были использованы критерии исключения. Представленные работы ретроспективные, и множество серий включило пациентов, оперированных в 70-ые, 80-ые годы. Отбор пациентов для резекции печени тогда был более строгим, поскольку послеоперационные осложнения и смертность были значительными. Кроме того, точность методов диагностики для предоперационного стадирования метастатического процесса была ограничена.

В течение последних лет произошел качественный скачек в печеночной хирургии, не только в хирургической технике, но и в анестезиологии и периоперационном ведении таких больных (2-х этапные операции, эмболизация ветвей воротной вены, неоадъювантная терапия, методы локальной деструкции), что не могло не отразиться на ближайших и отдаленных результатах.

Ряд факторов прогноза были определены как важнейшие предиктивные маркеры плохого прогноза после резекции печени: количество и размер печеночных метастазов, наличие внепеченочных отдаленных метастазов, высокий уровень РЭА, синхронный колоректальный рак с метастазами в печени, наличие метастазов в лимфоузлы первичной опухоли, наличие опухоли по краю резекции. Тем не менее, опубликованные исследования были непоследовательны в определении этих величин в качестве независимых предикторов выживаемости на многих переменных в анализе различных наборов данных, что позволяет предположить, что некоторые переменные прогностически могут быть более значительными в определенных группах пациентов.

Несмотря на то, что некоторые исследования включали значительное количество пациентов, некоторые группы и подгруппы в них были немногочисленными, что могло повлиять на достоверность в определение значимого прогностического признака. Разные периоды наблюдения в представленных исследованиях являются еще одной причиной выявления значимых прогностических переменных. Некоторые прогностические факторы, которые имеют важное значение в исследованиях с коротким периодом наблюдения, как правило, менее точны в предсказании общей и безрецидивной выживаемости. Таким образом, прогностические модели с коротким периодом наблюдения, являются неточными для прогнозирования длительной выживаемости. Еще одной причиной в диагностике разных значимых прогностических факторов между исследованиями могут быть разные критерии включения и исключения. Например, общепризнанные прогностические факторы, такие как количество метастазов в печени, были сгруппированы по-разному различными исследованиями. Nordlinger и др. отметил, что наличие более четыре метастазов в печени является важным неблагоприятным прогностическим фактором, в то время как Gayowski и др. сообщили о наличии более чем одного метастаза в печени как неблагоприятной прогностической переменной. Следует также отметить, что не во всех исследованиях была та же конечная точка при анализе этих прогностических переменных. Большинством авторов проанализированы переменные общей выживаемости пациентов в качестве конечной точки, за исключением Fong с соавторами. Критерии включения и исключения для всех перечисленных исследований не были стандартизированы. Fong с соавторами не включали больных с наличием опухоли по краю резекции и внепеченочными метастазами.

За прототип предлагаемого изобретения выбран известный способ прогнозирования выживаемости у больных с метастазами колоректального рака в печени после ее резекции, включающий определение клинико-патологических (морфологических), гистохимических и молекулярных факторов прогноза (RU патент №2454176, МПК А61В 5/103, G01N 1/2S, публ. 27.06.201).

Известный способ осуществляют следующим образом.

После резекции печени проводят исследование опухолевых биоптатов печени: определяют максимальный размер и количество метастазов, наличие билобарного поражения, синхронность метастазов с первичной опухолью - выявление метастазов одновременно с первичной опухолью или в течение трех месяцев после нее. Далее, для прогнозирования безрецидивной выживаемости определяют уровень значимости указанных выше факторов по таблице и находят соответствующее значению клинико-патологического фактора число баллов и полученные баллы суммируют. Затем определяют экспрессию СК 20, β-cat, Ki 67 Max, причем для β-cat определяют экспрессию в ядре, а для Ki 67 Max - индекс пролиферации <30% или >30%, затем в зависимости от степени дифференцировки метастаза находят уровень значимости молекулярных факторов и соответствующее значению фактора число баллов, полученные баллы суммируют. Расчет прогноза безрецидивной выживаемости проводят по клинико-патологическим и молекулярным факторам. В зависимости от количества полученных баллов известный способ позволяет осуществить прогнозирование рецидива заболевания после резекции печени по поводу метастатического колоректального рака.

Однако способ, выбранный в качестве прототипа, обладает следующими недостатками:

- в рассматриваемые клинико-морфологические факторы не включены важнейшие показатели, которые могут оказывать влияние на прогноз: пол, возраст, онкомаркеры до и после операции, объем оперативного лечения;

- недостаточное количество молекулярных маркеров (три), способных описать важнейшие биологические особенности метастатической опухоли;

- при оценке экспрессии СК 20, B-cat используют не конкретные значения, а плюсы или минусы, что не позволяет объективно определить степень выраженности иммуногистохимической реакции;

- сложная четырехэтапная балльная оценка прогноза;

- клинико-морфологические и молекулярные факторы прогноза рассматриваются отдельно и последние рассчитываются по степени дифференцировки метастаза: высоко-умеренную, умеренно-низкую. Однако известно, что деление степени дифференцировки на высоко-умеренную или умеренно-низкую субъективно и не входит в общепризнанную патоморфологическую классификацию.

Задачей предлагаемого изобретения является создание способа прогнозирования общей выживаемости после резекции печени по поводу метастатического колоректального рака, лишенного недостатков прототипа.

Поставленная задача решается тем, что в известном способе прогнозирования общей выживаемости у больных с метастазами колоректального рака в печени после ее резекции, включающем определение клинико-патологических (морфологических), гистологичесих и молекулярных факторов прогноза, с помощью иммуногистохимического метода проводят исследование молекулярных характеристик микроокружения опухоли, а именно наличие и количество сосудов с гладкомышечным актином в их стенке в опухолевой строме, в трех молях зрения микроскопа, при этом поля зрения выбирают по максимально выраженной иммуногистохимической реакции с каждого среза биоптата печени с метастатической опухолью и при наличии в каждом из трех полей зрения сосудов с наличием гладкомышечного актина в их стенке пациента определяют в группу благоприятного прогноза (дожитие после резекции печени три года и, более), при отсутствии сосудов с наличием в стенке гладкой мускулатуры во всех трех полях зрения пациента включают в группу неблагоприятного прогноза (с продолжительностью жизни меньше двух лет).

Предлагаемое изобретение отвечает критерию изобретения «новизна», так как проведенные патентно-информацимонные исследования не выявили источников патентной и научно-технической информации, порочащие новизну предлагаемого изобретения.

Предлагаемое изобретение отвечает критерию «изобретательский уровень», так как не обнаружены технические решения с существенными отличиями предлагаемого способа.

Для иммуногистохимического (ИГХ) исследования использовали ретроспективный послеоперационный материал 26 больных КРР из архива отделения патологической анатомии опухолей человека ФБУЗ «ПОМЦ ФМБА России». ИГХ-исследование выполнено на серийных парафиновых срезах ткани опухолей с антителами к гладкомышечному актину SM actin клон 1А4 (Dako).

Предлагаемое изобретение позволяет получить следующий технический эффект.

Предлагаемый способ позволяет повысить точность прогнозирования общей выживаемости, так как в качестве критерия используют такой показатель, как наличие и количество сосудов с полноценно развитой стенкой сосуда на одно поле зрения в строме метастаза печени. Это позволяет включить пациентов в группу благоприятного (прогноз дожития до 3-х лет и более) или неблагоприятного прогноза (с продолжительностью жизни меньше двух лет).

Благодаря простоте способа возможно прогнозирование общей выживаемости данной группы больных только на основе одного фактора прогноза, относящегося к важнейшей особенности микроокружения опухоли - ее кровоснабжения, учитывая степень развитости стенки сосуда стромы опухоли.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

После резекции печени проводят исследование опухолевых биоптатов печени: определяют максимальный размер и количество метастазов, наличие билобарного поражения, синхронность метастазов с первичной опухолью - выявление метастазов одновременно с первичной опухолью или в течение трех месяцев после нее. Далее проводят гистологическое и иммуногистохимическое исследование биоптатов ткани печени с метастатической опухолью.

Гистологические методы. Образцы биоптатов ткани печени с метастатической опухолью фиксируют в 10% забуференном формалине (рН 7,0-7,4), обезвоживают в спиртах восходящей концентрации, заливают в парафиновые блоки, из которых готовят срезы толщиной 4 мкм с последующим окрашиванием гематоксилином и эозином, трихромом по Массону с анилиновым синим и проведением PAS-реакции.

Иммуногистохимический метод. Иммуногистохимическое исследование (ИГХИ) проводят модифицированным непрямым иммунопероксидазным методом (Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. Под ред. С.В. Петрова и Н.Т. Райхлина. 3-е изд., дополненное и переработанное. - Казань: Изд-во "Титул", 2004. - 456)с восстановлением антигенной специфичности путем воздействия на ткань нагреванием на водяной бане. Для ИГХИ используют моноклональные антитела: SM-actin клон 1А4 (Dako). Иммуногистохимическую реакцию оценивают по трем полям зрения для каждого среза, используя микроскоп с возможностью увеличения поля зрения до 100 мкм. Поля зрения выбирают по максимально выраженной иммуногистохимической реакции с каждого среза биоптата печени с опухолью. Определяют степень выраженности гладкой мускулатуры в стенке сосудов - по экспрессии SM-actin. Проводят подсчет сосудов для опухолевой стромы с наличием гладкомышечного актина в их стенке. Подсчет количества сосудов и степени выраженности гладкомышечной ткани в стенке сосудов проводят при помощи автоматизированной системы и микроскопа. Результат выражали в единицах. При наличии в каждом из трех полей зрения сосудов с наличием гладкомышечного актина в их стенке пациента определяют в группу благоприятного прогноза. При отсутствии сосудов с наличием в стенке гладкой мускулатуры во всех трех полях зрения пациента включают в группу неблагоприятного прогноза. Ниже приведена таблица по определению группы прогноза общей выживаемости по количеству сосудов с SM-actin в строме метастазов КРР.

Изучая биоптаты метастазов колоректального рака в печени с помощью гистологического и иммуногистохимического метода, выявлены достоверные отличия в микроокружении опухолевых клеток для пациентов из групп благоприятного и неблагоприятного прогноза. В частности, статистически достоверная разница в количестве сосудов с наличием гладкой мускулатуры в строме метастазов печени из разных групп.

Примеры конкретного выполнения способа.

Пример 1: Гистологическое исследование №9158/70. Пациентка Р., 58 лет.

Анамнез: пациентке Р. в 2001 г. выполнена резекция сигмовидной кишки по поводу колоректального рака. Через 18 месяцев возник рецидив заболевания: по данным МРТ и УЗИ органов брюшной полости диагностированы единичные метастазы в печени. Проведено 11 курсов ПХТ по схеме Мейо. Отмечено прогрессирование заболевания. В 2005 г. по поводу множественного билобарного поражения печени выполнена правосторонняя портальная гемигепатэктомия, атипичная резекция второго сегмента печени. В последующем курсы ПХТ не повторялись. При иммуногистохимическом исследовании среза биоптата печени с метастаза колоректального рака у данной пациентки диагностированы сосуды в каждом из трех полей зрения в строме метастаза КРР с наличием гладкой мускулатуры в стенке сосудов. Пациентка включена в группу с благоприятным прогнозом. В настоящее время (март 2013 г.) пациентка жива без признаков прогрессирования болезни. Время наблюдения после резекции печени составил более восьми лет.

Пример 2: Гистологическое исследование №142/40. Пациент Б., 59 лет.

Анамнез: пациенту Б., 59 лет, в 2005 г. выполнена резекция сигмовидной кишки по поводу колоректального рака. Через 36 месяцев возник рецидив заболевания: по данным МРТ и УЗИ органов брюшной полости диагностированы множественные билобарные метастазы в печени. На момент обращения пациента в ФБУЗ «ПОМЦ ФМБА России» в (06.2008 г.) метастазы в печени расценивались, как условно резектабельные. Первым этапом выполнена перевязка правой ветви воротной вены и СВЧ-абляция метастазов левой доли. Через месяц после этой операции выполнена правосторонняя портальная гемигепатэктомия. В настоящее время (2013 г.) пациент жив без признаков прогрессирования заболевания, и общая выживаемость для него составила более трех лет. При иммуногистохимическом исследовании среза биоптата печени с метастаза колоректального рака у данного пациента диагностированы сосуды в каждом из трех полей зрения в строме метастаза КРР с наличием гладкой мускулатуры в стенке сосудов, что позволило включить ее в группу с благоприятным прогнозом.

Пример 3: Гистологическое исследование №5856/59. Пациентка П., 63 года.

Анамнез: пациентке Н., 63 года, в ноябре 2005 г. выполнена резекция поперечно-ободочной кишки по поводу колоректального рака. Через 7 месяцев возник рецидив заболевания: по данным МРТ и УЗИ органов брюшной полости диагностированы множественные монолобарные метастазы в печени. В июне 2006 г. выполнена правосторонняя портальная гемигепатэктомия. В послеоперационном периоде получала системные курсы ПХТ. При иммуногистохимическом исследовании среза биоптата печени с метастаза колоректального рака у данной пациентки во всех трех полях зрения стромы метастаза КРР сосудов с наличием гладкой мускулатуры не выявлено. Пациентку включают в группу неблагоприятного прогноза. Пациентка погибла через 7 месяцев после резекции печени от прогрессирования основного заболевания.

Пример 4: Гистологическое исследование №№6847/76. Пациент Т., 61 год.

Анамнез: пациентке Т., 61 года, в ноябре 2003 г. выполнена передняя резекция прямой кишки по поводу колоректального рака. Через 6 лет возник рецидив заболевания: по данным МРТ и УЗИ органов брюшной полости диагностированы множественные билобарные метастазы в печени. В июне 2009 г. выполнена правосторонняя портальная гемигепатэктомия, аблация очага в третьем сегменте печени. При иммуногистохимическом исследовании среза биоптата печени с метастаза колоректального рака у данной пациентки во всех трех полях зрения стромы метастаза КРР сосудов с наличием гладкой мускулатуры не выявлено, включена в группу неблагоприятного прогноза. Пациентка погибла через 8 месяцев после резекции печени от прогрессирования основного заболевания.

Пример 4: Гистологическое исследование №5876/89. Пациентка Н., 63 года.

Анамнез: пациентке П., 63 года, в ноябре 2005 г. выполнена резекция поперечно-ободочной кишки по поводу колоректального рака. Через 7 месяцев возник рецидив заболевания: по данным МРТ и УЗИ органов брюшной полости диагностированы множественные монолобарные метастазы в печени. В июне 2006 г. выполнена правосторонняя портальная гемигепатэктомия. В послеоперационном периоде получала системные курсы ПХТ. При иммуногистохимическом исследовании среза биоптата печени с метастаза колоректального рака у данной пациентки во всех трех полях зрения стромы метастаза КРР сосудов с наличием гладкой мускулатуры не выявлено. Включена в группу неблагоприятного прогноза. Погибла через 10 месяцев после резекции печени от прогрессирования заболевания.