СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ОБЩЕЙ ВЫЖИВАЕМОСТИ У БОЛЬНЫХ С МЕТАСТАЗАМИ КОЛОРЕКТАЛЬНОГО РАКА В ПЕЧЕНИ ПОСЛЕ ЕЕ РЕЗЕКЦИИ

Изобретение относится к области медицины, а именно к исследованию биологического материала с помощью физических и химических методов исследования и может быть использовано в хирургии и онкологии для прогнозирования общей выживаемости пациентов после резекции печени по поводу метастатического колоректального рака на основе особенностей микроокружения опухоли.

Колоректальный рак (КРР) занимает одно из ведущих мест в структуре онкологической заболеваемости в России и в мире. Ежегодно в мире регистрируют свыше 1,2 млн новых случаев заболевания КРР и более 500 тыс. человек погибают от данного заболевания [Wogelsang H., Haas S., Hierholzer C. et al. Factors influencing survival after resection of pulmonary metastases from colorectal cancer // Br J Surg. - 2004. - Aug 91 (8). - p.1066-1071].

В странах Европы и США данная патология на 2-3 месте в структуре онкологической заболеваемости, уступая лишь раку легкого у мужчин и раку молочной железы у женщин. Заболеваемость колоректальным раком в России прочно занимает 4-е место и за последнее десятилетие увеличилась более чем на 30%, что составило 58546 новых случаев в 2010 г. [Чиссов В.И., Старинский В.В., Петрова Г.В. Злокачественные новообразования в России в 2010 году (заболеваемость и смертность). - М.: ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена» Минздравсоцразвития России. 2012. ил. 260 с.].

Несмотря на совершенствование ранней диагностики и использование скрининговых программ, уже на этапе постановки диагноза у 20% больных КРР выявляют отдаленные метастазы, а у 25-30% их обнаруживают при последующем динамическом наблюдении после лечения [Goldberg R.M. Advances in the Treatment of Metastatic Colorectal, Cancer // The Oncologist - 2005. - 10 (suppl 3). - p.40-48]. Наиболее частой локализацией метастазов при раке толстой кишки является печень (более 50%), реже - легкие (10-25%), брюшина (10-13%), яичники (3-8% женщин) [Rena O., Casadio C., et al. Pulmonary Resection for Metastases from Colorectal Cance: factors influencing Prognosis. Twenty-year Experience. European Journal of Cardio-thoracic Surgery 21:906-912, 2002.].

На сегодняшний день проведены многочисленные исследования различных систем оценки прогноза для пациентов с диссеминированным колоректальным раком, перенесших резекцию печени по поводу метастазов печени. Большинство предложенных систем оценки прогноза из европейских институтов: Великобритании, Франции, Италии и Германии, затем из азиатских стран: Японии, Южной Кореи и из Северной Америки. Количество пациентов, включенных в эти исследования, варьировало от 81 до 1568, период наблюдения составил от 16 до 52 месяцев. Все исследования были ретроспективными.

Nordlinger с соавторами [Nordlinger В, Guiguet M, Vaillant JC, Balladur P, Boudjema K, Bachellier P, Jaeck D. Surgical resection of colorectal carcinoma metastases to the liver. A prognostic scoring system to improve case selection, based on 1568 patients. Association Francaise de Chirurgie. Cancer. 1996 Apr 1; 77(7): 1254-62] первыми сообщили о системе прогностической оценки, которая была основана на анализе 1568 пациентов, пролеченных в 85 учреждениях Франции в течение 22 лет (1968-1990). Средний период наблюдения в этом исследовании составил 19 месяцев (диапазон 9-30), большая часть операций выполнена после 1987 г. Многофакторный анализ позволил выявить семь независимых прогностических факторов, которые включали: возраст - старше 60 лет, прорастание первичной опухолью серозного слоя толстой кишки, наличие метастазов в региональных лимфоузлах первичной опухоли, появление метастазов в печени в течение 24 месяцев после удаления первичной опухоли, размер метастазов (более 5 см), расстояние менее 1 см от края резекции до опухоли печени и более 4 метастазов в печени. Используя свою систему оценки прогноза, всех пациентов разделили на три группы: группа высокого риска (от 5 до 7 прогностических признаков), промежуточного (от 3 до 4) и низкого риска (от 0 до 2). Двухлетняя выживаемость в этих группах составила 43%, 60%, 79% соответственно.

В 1980 году German L, Former JG разработали две системы оценки прогноза [Gennari L, Doci R, Bozzetti F, Bignami P. Proposal for staging liver metastases. Recent Results Cancer Res 1986; 10080- 84. Former JG, Silva JS, Golbey RB, Сох ЕВ, Maclean BJ. Multivariate analysis of a personal series of 247 consecutive patients with liver metastases from colorectal cancer, I: treatment by hepatic resection. Ann Surg 1984; 199306-316]. Эти системы были основаны на степени опухолевой распространенности, а не на признаках, которые относятся к первичной опухоли толстой кишки.

Gayowski [Gayowski TJ, Iwatsuki S, Madariaga JR. et al. Experience in hepatic resection for metastatic colorectal cancer: analysis of clinical and pathologic risk factors. Surgery 1994; 116703-710] предложили модифицированную TNM систему стадирования, основанную на следующих факторах: монолобарное или билобарное поражение, единичные или множественные метастазы в печени, менее или более 2 см размер метастаза и сосудистая и протоковая инвазия опухоли. В этой системе, билобарное поражение рассматривается как распространение Т4. Худший прогноз ассоциирован с множественным билобарным поражением. Хотя другие исследователи показали, что прогноз для пациентов с множественными метастазами не зависит от моно или билобарного поражения [Surgical indications in the treatment of liver metastases from colorectal cancer: long-term results. Ann Surg 2000; 231487-499].

Система прогноза Fong с соавторами [Fong Y, Former J, Sun RL, Brennan MF, Blumgart LH. Clinical score for predicting recurrence after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: analysis of 1001 consecutive cases. Ann Surg. 1999; 230:309-318.], представляющего Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, пожалуй, самая хорошо известная прогностическая балльная система. В свое исследование они включили 1001 пациента в период с 1985 по 1998 г. Эта работа позволила идентифицировать семь прогностических переменных, полученных с помощью многофакторного анализа: наличие метастазов в лимфоузлах от первичной опухоли, безрецидивный интервал менее или равный 12 месяцам, более 4 метастазов в печени, размер метастаза более чем 5 см, уровень раково-эмбрионального антигена более чем 200 нг/мл, наличие опухоли по краю резекции и наличие экстрапеченочных метастазов. Из вышеперечисленных признаков последний наиболее показательный, и авторы утверждают, что внепеченочное распространение должно быть противопоказанием к выполнению резекции печени. Используя свою предоперационную балльную систему, Fong с соавторами исключили пациентов с экстрапеченочными метастазами. Вышеуказанная балльная система прогноза позволяет вычислить безрецидивную выживаемость. Пятилетняя безрецидивная выживаемость снижается с 60% до 14% у пациентов без независимых факторов прогноза и наличием пяти соответственно.

Во всех известных исследованиях были использованы критерии исключения. Представленные работы ретроспективные, и множество серий включали пациентов, оперированных в 70-е, 80-е годы. Отбор пациентов для резекции печени тогда был более строгим, поскольку послеоперационные осложнения и смертность были значительными. Кроме того, точность методов диагностики для предоперационного стадирования метастатического процесса была ограничена.

В течение последних лет произошел качественный скачок в печеночной хирургии, не только в хирургической технике, но и в анестезиологии и периоперационном ведении таких больных (2-этапные операции, эмболизация ветвей воротной вены, неоадъювантная терапия, методы локальной деструкции), что не могло не отразиться на ближайших и отдаленных результатах.

Ряд факторов прогноза был определен как важнейшие предиктивные маркеры плохого прогноза после резекции печени: количество и размер печеночных метастазов, наличие внепеченочных отдаленных метастазов, высокий уровень РЭА, синхронный колоректальный рак с метастазами в печени, наличие метастазов в лимфоузлы первичной опухоли, наличие опухоли по краю резекции. Тем не менее, опубликованные исследования были непоследовательны в определении этих величин в качестве независимых предикторов выживаемости на многих переменных в анализе различных наборов данных, что позволяет предположить, что некоторые переменные прогностически могут быть более значительными в определенных группах пациентов.

Несмотря на то что некоторые исследования включали значительное количество пациентов, некоторые группы и подгруппы в них были немногочисленными, что могло повлиять на достоверность в определении значимого прогностического признака. Разные периоды наблюдения в представленных исследованиях могут являться еще одной причиной выявления значимых прогностических переменных. Некоторые прогностические факторы, которые имеют важное значение в исследованиях с коротким периодом наблюдения, как правило, менее точны в предсказании общей и безрецидивной выживаемости. Таким образом, прогностические модели с коротким периодом наблюдения могут быть неточными в прогнозировании длительной выживаемости. Еще одной причиной в диагностике разных значимых прогностических факторов между исследованиями могут быть разные критерии включения и исключения. Например, общепризнанные прогностические факторы, такие как количество метастазов в печени, были сгруппированы по-разному различными исследованиями. Nordlinger и др. отметил, что наличие более чем четырех метастазов в печени является важным неблагоприятным прогностическим фактором, в то время как Gayowski и др. сообщили о наличии более чем одного метастаза в печени как неблагоприятной прогностической переменной. Следует также отметить, что не во всех исследованиях была та же конечная точка при анализе этих прогностических переменных. Большинством авторов проанализированы переменные общей выживаемости пациентов в качестве конечной точки, за исключением Fong с соавторами. Критерии включения и исключения для всех перечисленных исследований не были стандартизированы. Fong с соавторами не включали больных с наличием опухоли по краю резекции и внепеченочными метастазами.

За прототип предлагаемого изобретения выбран известный способ прогнозирования общей выживаемости у больных с метастазами колоректального рака в печени после ее резекции, включающий исследование опухолевых биоптатов печени после ее резекции и определение клинико-патологических и молекулярных факторов, позволяющих рассчитать прогноз безрецидивной выживаемости (RU патент №2454176, МПК A61B 5/103, G01N 1/28, публ. 27.06.201).

Известный способ осуществляют следующим образом.

После резекции печени проводят исследование опухолевых биоптатов печени: определяют максимальный размер и количество метастазов, наличие билобарного поражения, синхронность метастазов с первичной опухолью - выявление метастазов одновременно с первичной опухолью или в течение трех месяцев после нее. Далее, для прогнозирования безрецидивной выживаемости определяют уровень значимости указанных выше факторов по таблице и находят соответствующее значению клинико-патологического фактора число баллов и полученные баллы суммируют. Затем определяют экспрессию СК 20, β-cat, Ki 67 Max, причем для β-cat определяют экспрессию в ядре, а для Ki 67 Max - индекс пролиферации ≤30% или >30%, затем в зависимости от степени дифференцировки метастаза находят уровень значимости молекулярных факторов и соответствующее значению фактора число баллов, полученные баллы суммируют. Расчет прогноза безрецидивной выживаемости проводят по клинико-патологическим и молекулярным факторам. В зависимости от количества полученных баллов известный способ позволяет осуществить прогнозирование рецидива заболевания после резекции печени по поводу метастатического колоректального рака.

Однако способ, выбранный в качестве прототипа, обладает следующими недостатками:

- в рассматриваемые клинико-морфологические факторы не включены важнейшие показатели, которые могут оказывать влияние на прогноз: пол, возраст, онкомаркеры до и после операции, объем оперативного лечения;

- недостаточное количество молекулярных маркеров (три), способных описать важнейшие биологические особенности метастатической опухоли;

- при оценке экспрессии СК 20, B-cat используют не конкретные значения, а плюсы или минусы, что не позволяет объективно определить степень выраженности иммуногистохимической реакции;

- сложная четырехэтапная балльная оценка прогноза безрецидивной выживаемости;

- клинико-морфологические и молекулярные факторы прогноза рассматриваются отдельно и последние рассчитываются по степени дифференцировки метастаза: высоко-умеренная, умеренно-низкая. Однако известно, что деление степени дифференцировки на высоко-умеренную или умеренно-низкую субъективно и не входит в общепризнанную патоморфологическую классификацию.

Задачей предлагаемого изобретения является создание способа прогнозирования общей выживаемости после резекции печени по поводу метастатического колоректального рака, лишенного недостатков прототипа.

Поставленная задача решается тем, что в известном способе прогнозирования общей выживаемости у больных с метастазами колоректального рака в печени после ее резекции, включающем исследование опухолевых биоптатов печени и определение клинико-патологических и молекулярных факторов, позволяющих рассчитать прогноз выживаемости, исследуют характеристики микроокружения опухоли, а именно наличие и величину площади лимфоцитарной инфильтрации в строме метастаза печени в трех полях зрения микроскопа, при этом поля зрения выбирают по максимально выраженной иммун9 гистохимической реакции с каждого среза биоптата печени с опухолью и в зависимости от наличия и величины площади лимфоцитарной инфильтрации определяют прогноз общей выживаемости, при этом, при наличии и величине площади лимфоцитарной инфильтрации 50% и более от опухолевой стромы в каждом из трех полей зрения, пациента определяют в группу благоприятного прогноза (дожитие после резекции печени три года и более), при отсутствии лимфоидной инфильтрации или величины площади лимфоцитарной инфильтрации составляющей менее 10% от опухолевой стромы в каждом из трех полей зрения пациента определяют в группу неблагоприятного прогноза (с продолжительностью жизни меньше двух лет).

Предлагаемое изобретение отвечает критерию изобретения «новизна» и «изобретательский уровень», так как проведенные патентно-информационные исследования не выявили источников патентной и научно-технической документации, которые бы порочили новизну предлагаемого способа, равно как и технических решений с существенными признаками предлагаемого изобретения.

Предлагаемый способ позволяет при его использовании получить следующий технический эффект.

С помощью нового критерия - величина площади лимфоцитарной инфильтрации в строме метастаза печени и возможности его количественного определения предлагаемый способ повышает точность прогноза общей выживаемости после резекции печени по поводу метастатического колоректального рака и делает возможным прогнозирование общей выживаемости, используя один фактор прогноза - лимфоцитарную инфильтрацию опухолевой стромы (табл.1).

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

После резекции печени проводят исследование опухолевых биоптатов печени: определяют максимальный размер и количество метастазов, наличие билобарного поражения, синхронность метастазов с первичной опухолью - выявление метастазов одновременно с первичной опухолью или в течение трех месяцев после нее. Проводят гистологическое и иммуногистохимическое исследование биоптатов ткани печени с метастатической опухолью. Предварительно образцы биоптатов ткани печени с метастатической опухолью фиксируют в 10% забуференном формалине (pH 7,0-7,4), обезвоживают в спиртах восходящей концентрации, заливают в парафиновые блоки, из которых готовят срезы толщиной 4 мкм с последующим окрашиванием гематоксилином и эозином, трихромом по Массону с анилиновым синим и проведением PAS-реакции. Иммуногистохимическое исследование (ИГХИ) проводят модифицированным непрямым иммунопероксидазным методом (Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. /Под ред. С.В. Петрова и Н.Т. Райхлина. 3-е изд, дополненное и переработанное. - Казань: Изд-во "Титул", 2004. - 456) с восстановлением антигенной специфичности путем воздействия на ткань нагреванием на водяной бане. Иммуногистохимическую реакцию для изучаемого моноклонального антитела оценивают по трем полям зрения с каждого патоморфологического блока, используя микроскоп с возможностью увеличения поля зрения до 100 мкм. Поля зрения выбирают по максимальной выраженной иммуногистохимической реакции с каждого среза биоптата печени с опухолью. Для ИГХИ используют моноклональные антитела: CD45 клон 2B11+PD7/26 (Dako), CD4 (Dako) и CD8 (Dako). Иммуногистохимически определяют степень выраженности и характер лимфоцитарной инфильтрации по экспрессии CD45, CD4, CD8. Измеряют площадь лимфоцитарной ифильтрации по экспрессии CD45, используя лицензионную компьютерную программу. При наличии в каждом из трех полей зрения лимфоидной инфильтрации площадью 50% и более от опухолевой стромы, пациента определяют в группу благоприятного прогноза. При отсутствии или величины площади лимфоцитарной инфильтрации менее 10% от опухолевой стромы во всех трех полях зрения пациента включают в группу неблагоприятного прогноза.

Морфометрический метод. Подсчет степени выраженности лимфоцитарной инфильтрации проводили при помощи автоматизированной системы и микроскопа. Результат выражали в единицах.

Примеры конкретного выполнения способа.

Пример 1. Гистологическое исследование №19964/79 Пациентка И., 50 лет.

Анамнез: пациентке в феврале 2009 г. в одной из городских больниц Н.Новгорода выполнена резекция сигмовидной кишки по поводу рака. Интраоперационно диагностированы метастазы в печени. Через 2 месяца после удаления первичной опухоли выполнена парамедианная резекция печени. При иммуногистохимическом исследовании среза биоптата печени с метастаза колоректального рака у данной пациентки диагностирована лимфоцитарная инфильтрация, площадь которой составляла более 50% от площади опухолевой стромы для каждого поля зрения. Пациентка имеет благоприятный прогноз для своего онкологического заболевания. В настоящее время (2013 г.) пациентка жива без признаков прогрессирования заболевания и общая выживаемость для нее составляет более 4 лет.

Пример 2. Гистологическое исследование №3203/07. Пациентка С., 48 лет.

Анамнез: пациентке С. 48 лет в 2003 г. выполнена брюшно-анальная резекция прямой кишки по поводу колоректального рака. Через 11 месяцев возник рецидив заболевания: по данным МРТ и УЗИ органов брюшной полости диагностированы множественные метастазы в печени. Далее получила 15 курсов ПХТ по разным схемам. В сентябре 2006 выполнена правосторонняя расширенная гемигепатэктомия. В настоящее время (2013 г.) пациентка жива без признаков прогрессирования и общая выживаемость для нее составила более трех лет. При иммуногистохимическом исследовании среза биоптата печени метастаза колоректального рака у данной пациентки диагностирована лимфоцитарная инфильтрация, которая занимала площадь более 50% от площади опухолевой стромы для каждого поля зрения. Пациентка имеет благоприятный прогноз для своего онкологического заболевания. Общая выживаемость после резекции печени для нее составляет более шести лет.

Пример 3. Гистологическое исследование №5854/12. Пациентка Т., 61 год.

Анамнез: пациентке Т. 61 года в ноябре 2003 г. выполнена передняя резекция прямой кишки по поводу колоректального рака. Через 6 лет возник рецидив заболевания: по данным МРТ и УЗИ органов брюшной полости диагностированы множественные монолобарные метастазы в печени. В июне 2006 г выполнена правосторонняя портальная гемигепатэктомия. В послеоперационном периоде получала системные курсы ПХТ. При иммуногистохимическом исследовании среза биоптата печени с метастаза колоректального рака у данной пациентки во всех трех полях зрения стромы метастаза КРР лимфоцитарной инфильтрации не было. Пациентка имеет неблагоприятный прогноз для своего онкологического заболевания. Пациентка погибла через 10 месяцев после резекции печени от прогрессирования основного заболевания.

Пример 4. Гистологическое исследование №5876/89. Пациентка Н., 63 года.

Анамнез: пациентке П. 63 лет в ноябре 2005 г выполнена резекция поперечно-ободочной кишки по поводу колоректального рака. Через 8 месяцев возник рецидив заболевания: по данным МРТ и УЗИ органов брюшной полости диагностированы множественные монолобарные метастазы в печени. В июне 2006 г. выполнена правосторонняя портальная гемигепатэктомия. При иммуногистохимическом исследовании среза биоптата печени метастаза колоректального рака у данной пациентки во всех трех полях зрения в опухолевой строме метастаза КРР отсутствовала лимфоцитарная инфильтрация. У больной неблагоприятный прогноз для своего онкологического заболевания. Пациентка погибла через 7 месяцев после резекции печени от прогрессирования основного заболевания.