СПОСОБ РЕГЕНЕРАЦИИ МИКРОПОБЕГОВ HYSSOPUS OFFICINALIS L. В УСЛОВИЯХ IN VITRO

Изобретение относится к биотехнологии получения посадочного материала и может быть использовано для быстрого размножения, селекции и генетических манипуляций иссопа (Hyssopus officinalis L.) в условиях in vitro.

Известен способ получения микропобегов H.officinalis в культуре in vitro с использованием вегетативных почек Lt C.L. Multiplication in vitro de I'Husope (Hyssopus officinalis L.) // Revue Suisse de Vitic. Arboric. Hortic. - 1987.-V.19, №6. - P. 363-367. Вегетативные почки иссопа, отобранные от материнских растений, после стерилизации гипохлоритом кальция помещают на питательную среду, которая содержит макро- и микроэлементы на основе Мурасиге и Скуга (1962) - МС, дополнена 3% сахарозой, 0,7 % агаром (Difco Bacto-Agar, Germany), 1,0 мг/л тиамином, 0,5 мг/л пиридоксином, 0,5 мг/л никотиновой кислотой, и используют 100 мг/л раствора: 4,44 мкМ 6-бензиламинопурина (БАП), 1 мкМ 3-индолилмасляной кислоты (ИМК) и 0,57 мкМ гибереловой кислоты (ГК). Среднее количество микропобегов на эксплант достигает 6±1,5 (при концентрации БАП - 4,44 мкМ и ИМК - 0,49 мкМ).

Недостатком способа является низкий коэффициент размножения микропобегов, использование морфогенетических потенций только одного экспланта (вегетативная почка).

Известен способ регенерации микропобегов из листовых эксплантов Actinidia deliciosa в культуре in vitro, который использовали как прототип (Заявка № 2002120668 от 27.12.2002 г.). Метод включает в себя отбор листовых эксплантов от растений, полученных в культуре in vitro, и культивирование высечек листа на питательной среде, которая содержит половинную концентрацию макро- и микросолей, витамины МС, дополненной фитогормонами - БАП и индолилуксусной кислотой (ИУК). Через 4 недели культивирования на листовых эксплантах формируются адвентивные почки и микропобеги. Культивирование происходит при температуре 25°С, 16-часовом фотопериоде и интенсивном освещении 2-3 клк.

При использовании данного способа, с целью получения микропобегов из листовой ткани иссопа, культивируя их на питательной среде с БАП и ИУК, не удавалось добиться массового образования адвентивных почек из листовых эксплантов.

В основу изобретения поставлена задача: усовершенствовать способ регенерации растений из листовой ткани в условиях in vitro за счет подбора условий культивирования листовых дисков H.officinalis с целью максимального выхода генетически однородного растительного материала.

Поставленная задача решается тем, что в способе прямой регенерации микропобегов H.officinalis, которая состоит из отделения листовых эксплантов от растений, полученных в культуре in vitro, и культивирования эксплантов на питательной среде, которая содержит половинную концентрацию макро- и микросолей, витамины на основе МС и фитогормоны, в соответствии с изобретением на питательную среду в качестве фитогормона вводят вещество цитокининового типа действия, листовые экспланты иссопа отделяют от микропобегов после 4-5 пассажа в культуре in vitro и их культивирование проводят при низкой интенсивности освещения.

Существенные признаки заявленного способа имеют причинно-следственную связь с достигнутым результатом. В случае использования высечек листа с микропобегами иссопа, после первых трех субкультивирований на листовых эксплантах формировался каллус или единичные адвентивные почки, которые в дальнейшем не образовывали микропобеги. В случае использования высечек листа с микропобегами иссопа после 4-5 пассажей в культуре in vitro интенсивность образования адвентивных почек и регенерация микропобегов достигали 90%. В случае использования высечек листа с микропобегами иссопа после 6-8 пассажей наблюдали массовую регенерацию микропобегов, однако основная их часть была витрифицирована (обезвожена) и не способна для дальнейшего размножения.

Частота побегообразования увеличивалась при снижении интенсивности освещения до 1-1,5 клк и достигала 90%. Повышение интенсивности освещения до 2-3 клк (стандартные параметры для большинства растительных объектов) снижало частоту регенерации микропобегов до 50-60%.

В качестве вещества цитокининового типа действия, которое индуцирует образование и развитие меристем, а также регенерацию микропобегов в питательной среде, использовали тидиазурон (TDZ) - C₉H₈N₄OS.

Предложенный способ выполняется таким образом: приготавливают питательную среду согласно существующей методике. Состав питательных сред представлен в таблице 1.

Состав питательной среды для размножения растений иссопа

Таблица 1

Сегмент микропобега иссопа с латеральной почкой помещают на питательную среду для культивирования вегетативных почек. Интенсивность освещения составляет 2,5-3 клк, температура 25±1°С, фотопериод 16 часов. Через пять суток наблюдают образование микропобегов. Нормально сформированные микропобеги без морфологических изменений через 2 недели культивирования удлиняются до 3-4 см. Их микрочеренкуют на сегменты с латеральной почкой и снова помещают на исходную среду №1 (табл.1). Микрочеренкование производят через 2-3 недели культивирования. Вначале коэффициент размножения не превышает 1:2, но после 4-5 пассажа достигает 1:4. У листьев микропобегов после 4-5 субкультивирования вырезают диски, которые помещают на питательную среду №2 (табл.1), которая содержит половинную концентрацию макроэлементов, полный набор микроэлементов и витаминов по МС, дополненную цитокинином - тидиазуроном в концентрации 4,0-7,0 мкМ (табл.2). Из данных таблицы видно, что максимальное количество адвентивных почек и микропобегов образуется на листовых эксплантатах после 8 недель при оптимальной концентратции тидиазурона. Через 8 недель культивирования листовых эксплантов происходит активное формирование адвентивных почек (16-20 шт./эксплант), при концентрации тидиазурона 9,0 мкМ листовые экспланты формируют каллус.

Влияние количества пассажей микропобегов на регенеративную способность листовых дисков подтверждается данными таблицы 3. Из данных таблицы видно, что листовые экспланты, взятые с микропобегов иссопа после 3-х субкультивирований в условиях in vitro, образуют каллус; адвентивные почки и микропобеги отсутствуют. Максимальное количество адвентивных почек и побегов образуется на эксплантах, отобранных с листовых микропобегов иссопа, после 4-5 субкультивирований в условиях in vitro. После 6-8 пассажей на листовых эксплантах образуется масса обезвоженных и в дальнейшем нежизнеспособных микропобегов иссопа.

Таблица 2

Влияние концентрации тидиазурона на частоту регенерации микропобегов иссопа из листовых эксплантов условиях in vitro

(*)форма 80882 - иссоп с синим окрашиванием венчика цветка; форма 38285 - иссоп с розовым окрашиванием венчика цветка.

Таблица 3

Влияние количества субкультивирований микропобегов на регенерационную

способность листовых эксплантов иссопа в условиях in vitro

Снижение интенсивности освещения до 1-1,5 клк стимулирует образование микропобегов иссопа в условиях in vitro. Это подтверждается данными таблицы 4.

Таблица 4

Влияние интенсивности освещения на частоту регенерации микропобегов иссопа у листовых эксплантов в условиях in vitro

(*)форма 80882 - иссоп с синим окрашиванием венчика цветка; форма 38285 - иссоп с розовым окрашиванием венчика цветка.

Из данных таблицы видно, что при отсутствии освещения не происходит образование адвентивных почек и побегов. Оптимальный уровень интенсивности освещения для инициации побегообразования и пролиферации микропобегов иссопа составил 1,5 клк. Частота регенерации и количество микропобегов на листовой диск значительно уменьшились при интенсивности освещения 2 клк, а при интенсивности освещения 3 клк только низкий процент листовых дисков был способен к регенерации и чаще всего экспланты погибали.

Следует отметить, что адаксиальное размещение листовых дисков иссопа на питательной среде повышает частоту регенерации микропобегов иссопа до 90%. В течение года из листовых дисков от одного растения иссопа можно получить около 10000 микропобегов, которые отделяют и в дальнейшем укореняют.

Укоренение микропобегов проводят на питательной среде №3 (табл.1), которая содержит 8,0-11,0 мкМ ИМК. Культуральные сосуды выставляют на стеллажи. Интенсивность освещения составляет около 2 клк, температура 21±1°С, фотопериод 14 часов. Через 2-2,5 недели наблюдается образование максимального количества корешков длиной 5-6 см. Число укорененных побегов иссопа в условиях in vitro составляет 63-72 % (в зависимости от формы иссопа). Полученные растения готовы к высадке в субстрат и адаптации in vivo.