Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ДРОЖЖЕЙ PHAFFIA RHODOZYMA ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ, СОДЕРЖАЩЕЙ АСТАКСАНТИН

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения белковой добавки, содержащей каротиноид астаксантин.

Из-за своей высокой антиоксидантной способности астаксантин сегодня называют «супер-антиоксидантом». Он сильнее витамина Е в 500 раз. Его используют для поддержания иммунитета человека, с/х животных, птиц, рыб, для окраса мяса рыб в красный цвет, окраса желтка куриных яиц.

На территории России в настоящее время нет способа получения астаксантина и белково-витаминной добавки с содержанием астаксантина в промышленных масштабах.

Известны способы получения каротиноида астаксантина синтетическим способом (патент США №7,247,752 В2).

Недостаток синтетического астаксантина заключается в том, что количество всасываемого препарата максимум 50% из-за присутствия не только L-, но и D-оптической формы астаксантина; в препарате из синтетического астаксантина присутствуют различные изомеры и другие продукты синтеза.

Известен способ получения астаксантина, описанный в патенте США №6,022,701 (2000 г.). В качестве продуцента астаксантина используется водоросль Haematococcus pluvialis.

Недостаток данного способа заключается в том, что для культивирования микроводоросли Haematococcus pluvialis необходима среда, содержащая дорогостоящие компоненты. Кроме этого для своей жизнедеятельности микроводоросли нуждаются в постоянном освещении, что увеличивает энергозатраты при искусственном культивировании. А скорость роста микроводоросли значительно ниже, чем у дрожжей.

Известен способ получения астаксантина, описанный в патенте США №6,413,736 В1, в котором предлагается использовать различные штаммы дрожжей Phaffia rhodozyma в качестве продуцентов каротиноида астаксантина.

Недостатком данного способа является использование в качестве источника углерода в питательных средах технической глюкозы, в качестве ростового фактора - дорогостоящих дрожжевого экстракта и/или пептона. В состав питательной среды включаются витамины и минералы. В процессе культивирования клеток дрожжей Ph. rhodozyma глюкоза в качестве источника углерода частично заменяется глицерином.

В патенте также предложено установить одно или несколько прозрачных отверстий для подачи через них энергии света в культуральную жидкость либо пропускать с помощью насоса культуральную жидкость через светопроницаемую трубу и возвращать в ферментер. К недостаткам данного способа относятся высокие затраты электроэнергии на освещение из-за низкой эффективности светоподвода.

Наиболее близким к предлагаемому способу культивирования является способ, описанный в патенте США №2005/0124032 А1, в котором предложен способ культивирования клеток дрожжей Phaffia rhodozyma с циклическим освещением в 6 часов (ультрафиолетовый свет/темнота). В состав питательной среды входит глюкоза (источник углерода), дрожжевой экстракт и мука семян хлопка (источники азота), витамины биотин, тиамин, пантотенат кальция, соли KH₂PO₄, K₂HPO₄, MgSO₄·7H₂O, (NH₄)₂SO₄, NaCl, CaCl₂, СаСО₃. Культивирование проводилось при температуре 17-20°С. Применялся цикл ультрафиолетовое освещение/темнота с периодичностью 6 часов.

Недостаток данного способа заключается в том, что предложенная периодичность не позволяет экономить значительное количество энергии на освещение.

Задачей настоящего изобретения является получение продукта высокого качества, содержащего астаксантин и белково-витаминный комплекс, путем культивирования биомассы дрожжей Phaffia rhodozyma (Xanthophyllomyces dendrorhous) с содержанием сырого протеина не менее 43% и астаксантина не менее 0,4 мг/г АСБ на основе питательных сред, содержащих ферментолизат крахмала, полученный дроблением некондиционного зерна с последующим разделением на фракции (патент №2410419) в качестве источника углерода, источник ростовых факторов, содержащий белок и аминокислоты (не менее 25%, например, кукурузный экстракт), в качестве источника органического азота и неорганический азот в виде аммония сернокислого с применением в качестве ферментера фотобиореактора с внутренним светоподводом (расположение осветительного устройства внутри ферментера), обеспечивающего интенсивный подвод световой энергии, воздуха, питательных веществ.

Поставленная задача достигается следующим путем:

- в качестве источника углеводов используется ферментолизат крахмала в количестве 5-8% по глюкозе;

- ферментолизат крахмала получают дроблением некондиционного зерна гидро-механоакустическим способом с последующим разделением на фракции и двухступенчатым ферментолизом выделенной крахмальной фракции;

- в качестве ростового фактора используется отход крахмалопаточного производства - кукурузный экстракт, содержащий белок и аминокислоты не менее 25%, в количестве 5-8%.

- процесс выращивания культуры, начиная с твердой питательной среды на скошенном агаре, посевного материала и культивирования дрожжей ведется с периодическим освещением 3-10 минут каждые 2-5 часов;

- в качестве ферментера для культивирования используется аппарат фотобиореактор с внутренним светоподводом (например, описанный в статье Suh I.S. & Lee S.В. Cultivation of a cyanobacterium in an internally radiating air-lift photobioreactor / Journal of Applied Phycology 13, 2001 стр.383, или в статье Carvalho A.P., Meireles L.А., Malcata F.X. Microalgal reactors: a review of enclosed system designs and performances / Biotechnol. Prog. 2006, 22 стр.1496, или в автореферате Гладышева П.А. Разработка фотобиореакторов для замкнутых экологических систем жизнеобеспечения стр.4 и другие), который позволяет минимизировать расход электроэнергии за счет эффективного светоподвода, а также обеспечивает требуемые культуре аэрацию, рН, температуру, концентрацию питательных веществ.

Сущность изобретения подтверждается, но не исчерпывается приведенными ниже примерами.

Пример 1

Ферментацию проводят в ферментере емкостью 3 л, снабженном системами регулирования температуры, аэрации, перемешивания, рН, парциального давления растворенного кислорода. Процесс периодический.

Начальные условия перемешивания и аэрации обеспечивают скорость массопередачи кислорода 5-6 г O₂/л*час.

Штамм клеток дрожжей Phaffia rhodozyma ВКПМ Y-2228, выращенный на агаризованной среде, содержащей ферментолизат крахмала, кукурузный экстракт и соли, при 20°С в течение четырех суток, переносят в посевные колбы со стерильной питательной средой следующего состава (г/л):

Ферментолизат крахмала по глюкозе - 20

Кукурузный экстракт - 30

Аммоний сернокислый - 1

Натрий хлористый - 0,5

Магний сернокислый 7-водный - 0,5

Калий фосфорнокислый двузамещенный - 0,5

При температуре 20°С выращивают на качалке в колбах в течение 44-48 часов. Посевной материал из колб в количестве 10% от начального объема ферментационной среды переносят в подготовленный соответствующим образом рабочий фотобиореактор, емкостью 3 л, предварительно заполненный 2,5 л стерильной питательной среды следующего состава (г/л):

Ферментолизат крахмала по глюкозе - 80

Кукурузный экстракт - 50

Аммоний сернокислый - 2

Натрий хлористый - 1

Магний сернокислый 7-водный - 1

Калий фосфорнокислый двузамещенный - 1

Пеногаситель Пропинол Б-400 - 0,1

Засев аппарата производят при начальном значении рН 4,5-4,7.

Культивирование в основном аппарате ведется в течение 66-72 часов. Используется циклическое освещение с периодичностью 2 часа и длительностью освещения культуральной жидкости (КЖ) 3 минуты за цикл.

Общий слив за 66-72 часа - 2,4 л с концентрацией биомассы 26,0 г/л, содержащей 44,6% сырого протеина (в пересчете на абсолютно сухое вещество), и астаксантина 30,5 мг/л.

Пример 2

Ферментацию проводят в ферментере емкостью 3 л, снабженном системами регулирования температуры, аэрации, перемешивания, рН, парциального давления растворенного кислорода. Процесс периодический.

Начальные условия перемешивания и аэрации обеспечивают скорость массопередачи кислорода 5-6 г O₂/л*час.

Штамм клеток дрожжей Phaffia rhodozyma ВКПМ Y-2228, выращенный на агаризованной среде, содержащей ферментолизат крахмала, кукурузный экстракт и соли, при 20°С в течение четырех суток, переносят в посевные колбы со стерильной питательной средой следующего состава (г/л):

Ферментолизат крахмала по глюкозе - 20

Кукурузный экстракт - 30

Аммоний сернокислый - 1

Натрий хлористый - 0,5

Магний сернокислый 7-водный - 0,5

Калий фосфорнокислый двузамещенный - 0,5

При температуре 20°С выращивают на качалке в колбах в течение 44-48 часов. Посевной материал из колб в количестве 10% от начального объема ферментационной среды переносят в подготовленный соответствующим образом рабочий фотобиореактор, емкостью 3 л, предварительно заполненный 2,5 л стерильной питательной среды следующего состава (г/л):

Ферментолизат крахмала по глюкозе - 50

Кукурузный экстракт - 80

Аммоний сернокислый - 16

Натрий хлористый - 1

Магний сернокислый 7-водный - 1

Калий фосфорнокислый двузамещенный - 1

Пеногаситель Пропинол Б-400 - 0,1

Засев аппарата производят при начальном значении рН 4,5-4,7.

Культивирование в основном аппарате ведется в течение 66-72 часов. Используется циклическое освещение с периодичностью 5 часов и длительностью освещения культуральной жидкости (КЖ) 10 минуты за цикл.

Общий слив за 66-72 часа - 2,4 л с концентрацией биомассы 34,3 г/л, содержащей 58,3% сырого протеина (в пересчете на абсолютно сухое вещество), и астаксантина 19,3 мг/л.

Пример 3

Ферментацию проводят в фотобиореакторе емкостью 3 л, снабженном системами регулирования температуры, аэрации, перемешивания, рН, парциального давления растворенного кислорода. Процесс периодический.

Начальные условия перемешивания и аэрации обеспечивают скорость массопередачи кислорода 5-6 г O₂/л*час.

Штамм клеток дрожжей Phqffia rhodozyma ВКПМ Y-2238, выращенный на агаризованной среде, содержащей ферментолизат крахмала, кукурузный экстракт и соли, при 20°С в течение семи суток, переносят в посевные колбы со стерильной питательной средой следующего состава (г/л):

Ферментолизат крахмала по глюкозе - 20

Кукурузный экстракт - 30

Аммоний сернокислый - 1

Натрий хлористый - 0,5

Магний сернокислый 7-водный - 0,5

Калий фосфорнокислый двузамещенный - 0,5

При температуре 20°С выращивают на качалке в колбах в течение 44-48 часов. Посевной материал из колб в количестве 10% от начального объема ферментационной среды переносят в подготовленный соответствующим образом рабочий фотобиореактор, емкостью 5 л, предварительно заполненный 2,7 л стерильной питательной среды следующего состава (г/л):

Ферментолизат крахмала по глюкозе - 50

Кукурузный экстракт - 80

Аммоний сернокислый - 16

Натрий хлористый - 1

Магний сернокислый 7-водный - 1

Калий фосфорнокислый двузамещенный - 1

Пеногаситель Пропинол Б-400 - 0,1

Засев аппарата производят при начальном значении рН 4,5-4,7.

Культивирование в основном аппарате ведется в течение 66-72 часов. Используется циклическое освещение с периодичностью 5 часов и длительностью освещения культуральной жидкости (КЖ) 10 минут за цикл.

Общий слив за 66-72 часа - 2,4 л с концентрацией биомассы 36,7 г/л, содержащей 56,4% сырого протеина (в пересчете на абсолютно сухое вещество), и астаксантина 22,0 мг/л.

Пример 4

Ферментацию проводят в ферментере емкостью 3 л, снабженном системами регулирования температуры, аэрации, перемешивания, рН, парциального давления растворенного кислорода. Процесс периодический.

Начальные условия перемешивания и аэрации обеспечивают скорость массопередачи кислорода 5-6 г O₂/л*час.

Штамм клеток дрожжей Phaffia rhodozyma ВКПМ Y-2342, выращенный на агаризованной среде, содержащей ферментолизат крахмала, кукурузный экстракт и соли, при 20°С в течение семи суток, переносят в посевные колбы со стерильной питательной средой следующего состава (г/л):

Ферментолизат крахмала по глюкозе - 20

Кукурузный экстракт - 30

Аммоний сернокислый - 1

Натрий хлористый - 0,5

Магний сернокислый 7-водный - 0,5

Калий фосфорнокислый двузамещенный - 0,5

При температуре 20°С выращивают на качалке в колбах в течение 44-48 часов. Посевной материал из колб в количестве 10% от начального объема ферментационной среды переносят в подготовленный соответствующим образом рабочий фотобиореактор, емкостью 5 л, предварительно заполненный 2,7 л стерильной питательной среды следующего состава (г/л):

Ферментолизат крахмала по глюкозе - 80

Кукурузный экстракт - 50

Аммоний сернокислый - 2

Натрий хлористый - 1

Магний сернокислый 7-водный - 1

Калий фосфорнокислый двузамещенный - 1

Пеногаситель Пропинол Б-400 - 0,1

Засев аппарата производят при начальном значении рН 4,5-4,7.

Культивирование в основном аппарате ведется в течение 66-72 часов. Используется циклическое освещение с периодичностью 2 часов часа и длительностью освещения культуральной жидкости (КЖ) 3 минуты за цикл.

Общий слив за 66-72 часа - 2,4 л с концентрацией биомассы 28,7 г/л, содержащей 43,0% сырого протеина (в пересчете на абсолютно сухое вещество), и астаксантина 55,2 мг/л.

Предлагаемый способ культивирования позволяет: решить проблему утилизации некондиционного зерна и получить ценный продукт, по качеству не уступающий зарубежным образцам; сократить время культивирования микроорганизмов по сравнению с существующими способами; снизить затраты на компоненты питательной среды за счет использования в качестве источника углеводов ферментолизата крахмала в количестве 5-8% по глюкозе и в качестве ростового фактора отхода крахмалопаточного производства - кукурузный экстракт в количестве 5-8%; ферментолизат крахмала получают дроблением некондиционного зерна гидромехано-акустическим способом с последующим разделением на фракции и двухступенчатым ферментолизом выделенной крахмальной фракции.

Предлагаемый способ позволяет сократить время подачи световой энергии в процессе выращивания культуры, начиная с твердой питательной среды на скошенном агаре, посевного материала и культивирования дрожжей ведется с периодическим освещением 3-10 минут каждые 2-5 часов.

Использование в качестве ферментера для культивирования фотобиореактора с внутренним светоподводом позволяет повысить эффективность использования световой энергии и снизить энергозатраты на освещение культуральной жидкости. Аппарат обеспечивает требуемые культуре аэрацию, рН, температуру, концентрацию питательных веществ.