СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСНОГО АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕГО ПРЕПАРАТА

Изобретение относится к ветеринарии и касается способов получения комплексных препаратов, обладающих иммуномодулирующими и антисептическими свойствами.

Известен способ получения препарата «янтарный биостимулятор» для повышения резистентности организма животных (патент РФ №2303979, 2007 г.), который дает возможность получить биологически активный препарат в виде водного раствора, включающий в своем составе 1% янтарной кислоты, 4% антисептика стимулятора Дорогова второй фракции (АСД-2), 0,25% новокаина, pH 6,9-7,0. Способ получения комплексного препарата повышает устойчивость организма животных к неблагоприятным факторам внешней среды, нормализует обменные процессы в клетках при различного рода иммунодефицитах, нарушениях обмена веществ, экзо- и эндогенных интоксикациях. Однако препарат не обладает достаточным антибактериальным действием.

Известен способ получения комплексного иммунотропного антисептического препарата для лечения и профилактики инфекционных заболеваний животных, имеющего в своем составе дополнительно к вышеописанному формалин, обладающий антисептическими свойствами (патент РФ №2361579, 2009 г.), однако его действие не обладает выраженным иммуномодулирующим эффектом.

Задачей изобретения является получение инъекционной формы препарата с широким спектром биологического действия, обладающего целенаправленным воздействием на клеточную систему иммунитета и антибактериальными свойствами.

Поставленная задача достигается включением в комплексный препарат янтарной кислоты, левамизола и формалина при следующем соотношении компонентов, масс.%:

Левамизол - 3,0%-3,5%;

Янтарная кислота - 2,0%-2,5%;

Формалин - 0,3%-0,5%;

Дистиллированная вода - остальное.

Важным отличительным признаком изобретения является наличие левамизола, который является высокоэффективным иммуностимулятором, преимущественно клеточной системы иммунитета.

При изучении биологического действия левамизола было установлено, что он повышает общую сопротивляемость организма и может быть использован как средство для иммунотерапии. Опыты на изолированных клетках и наблюдения за здоровыми и больными людьми показали, что препарат способен восстановить измененные функции Т-лимфоцитов и фагоцитов и вследствие своего тимомиметического эффекта может регулировать клеточные механизмы иммунологической системы. Более подробные исследования продемонстрировали, что левамизол, избирательно стимулируя регуляторную функцию Т-лимфоцитов, может выполнять функции иммуномодулятора, способного усиливать слабую реакцию клеточного иммунитета, ослаблять сильную и не действовать на нормальную.

В связи с этими свойствами левамизол был предложен для лечения различных заболеваний, в патогенезе которых придают значение расстройствам иммуногенеза: первичные и вторичные иммунодефицитные состояния, аутоиммунные болезни, хронические и рецидивирующие инфекции, опухоли и др.

Однако левамизол обладает выраженным побочным, преимущественно судорожным действием на организм, вместе с тем известен способ снижения побочного действия левамизола за счет включения в состав препарата янтарной кислоты (патент РФ №2411944, 2011 г.).

В состав комплексного препарата, помимо янтарной кислоты и левамизола, в качестве антибактериального компонента входит витамин формалин.

Включение формалина в состав комплексного препарата обусловлено его исключительно высокой антисептической активностью. Так, в концентрации 1:6000 он прекращает рост тифозных бацилл, а в абсолютно низкой концентрации 1:30000 останавливает гниение бульона (Мозгов И.Е. Фармакология. Москва - «Колос», 1979, с.303).

Известно, что внутримышечное (парентеральное) введение формалина в концентрации 0,1-0,2% позволяет обеспечить снижение вирулентности возбудителя вирусного трансмиссивного гастроэнтерита свиней непосредственно в организме животных и одновременно стимулировать специфическую иммунную защиту (Ласкавый В.Н. Способ профилактики трансмиссивного гастроэнтерита свиней. Патент РФ №2028804 от 20.02.1995).

Пример осуществления способа

Для приготовления комплексного препарата использовали 940,0 мл дистиллированной воды, в которой последовательно растворили 20,0 г янтарной кислоты, что соответствовало ее 2% концентрации; 30,0 г левамизола. Добавление 10 мл формалина (30%) позволило получить оптимальную среду для действия левамизола в пределах pH 4,5-5,0,

Полученный комплексный иммунометаболический препарат представляет собой прозрачный стерильный раствор. Качественный и количественный состав предлагаемого препарата по сравнению со стандартным раствором левамизола и прототипом позволяет выраженно снизить токсичность антгельминтика-иммуностимулятора левамизола, обеспечить высокий гепатопротекторный и иммунометаболический эффект. Качественный и количественный состав предлагаемого препарата обеспечивает достижение синергетического эффекта, что иллюстрируется примерами его экспериментального испытания.

Определение оптимальной концентрации формалина провели по результатам изучения безвредности и бактериальной активности опытных образцов комплексного препарата. С этой целью были изготовлены экспериментальные образцы препарата, содержащего 0,2%; 0,3%; 0,4%» и 0,5% формалина.

Бактерицидную активность определили в опыте in vitro, стандартным методом, по тесту задержки роста микроорганизмов вокруг бумажных дисков, пропитанных вышеуказанными растворами комплексного препарата. В качестве тест-объекта использовали культуру золотистого стафилококка, засеянного в бактериологические чашки на мясопептонный агар. После 24-часовой выдержки в термостате при 37°C диаметры зон задержки роста микроорганизмов составили: вокруг дисков, пропитанных комплексным препаратом, содержащим формалина 0,2% - 5-7 мм; 0,3% - 10-12 мм; 0,4% - 15-17 мм; 0,5% - 20-22 мм. Диаметр зон задержки 15 мм и более свидетельствовал о высокой бактерицидной активности.

Испытание безвредности провели на белых мышах. Ежедневное, на протяжении 5 дней внутрибрюшинное введение в объеме 0,5 мл испытуемых образцов препарата, содержащего 0,2%, 0,3% и 0,4% формалина, не сопровождалось угнетением общего состояния подопытных животных. Введение препарата, содержащего 0,5% формалина, на 5 сутки привело к снижению активности животных, тем не менее гибели их не наблюдалось.

Таким образом, по результатам экспериментальных опытов установлено, что для обеспечения антисептической активности комплексного препарата наиболее оптимальной является концентрация формалина не ниже 0,3%, но и не выше 0,5%.

Изучение антибактериальной активности

Опыт провели на коровах с клиническими признаками мастита по окончании лактационного периода. Подопытные животные были разделены по принципу аналогов на две группы. Коровам первой группы (n=3) с 7-ю больными долями молочной железы внутрицистернально в объеме 5 мл ввели препарат, содержащий 0,4% формалина. Животным второй группы (n=3) с 5 больными долями внутрицистернально был введен янтарный биостимулятор (патент РФ №2303979) в аналогичном объеме. Контроль антибактериальной активности препаратов при лечении мастита провели в день их введения и спустя 5 и 10 дней после введения. Результаты проведенного опыта представлены в таблице 1.

Результаты исследований свидетельствуют о том, что включение в состав препарата формалина обусловило ускоренный процесс обезвреживания микрофлоры в больных маститом долях молочной железы.

Изучение иммуностимулирующей активности заявляемого препарата на поросятах-сосунах

Для опыта были подобраны две группы свиноматок, по три головы в каждой, у которых на подсосе находились по 10 голов поросят-сосунов.

В 4-х суточном возрасте поросятам опытной группы (n=30) внутримышечно инъецировали испытуемый препарат в дозе 1,5 мл, а поросятам контрольной группы (n=30) суиферровит. Контрольные исследования и их результаты приведены в таблице 2.

При сопоставлении результатов исследований, проведенных на 7-е сутки, с фоновыми показателями установлено, что у поросят опытной и контрольной групп были выявлены определенные различия. Так, уровень содержания эритроцитов у поросят опытной группы увеличился на 5%, на 4% возросла насыщенность эритроцитов гемоглобином. Показатель состояния резервной щелочности увеличился до нижней границы физиологической нормы, что указывает на устранение алиментарного ацидоза. Это обусловлено тем, что янтарная кислота в сочетании с левамизолом является наиболее эффективным препаратом в устранении алиментарного ацидоза. Улучшение кислотно-щелочного баланса крови указывало и на нормализацию нарушенных обменных процессов. Особенно выраженные изменения произошли в белковом и минеральном обменах. Уровень белка и содержание в крови общего кальция у поросят опытной группы на 7 сутки достигли физиологической нормы. Уровень лимфоцитов в крови поросят опытной группы на 7-е сутки на 7,4% был больше, чем у особей из контрольной группы, что свидетельствовало об улучшении их иммунного статуса. На это же указывала выраженная тенденция роста БАСК и ФАЛ.

Изучение активности клеточного иммунитета на телятах-молочниках

Для опыта сформировали две группы телят аналогов по живой массе и возрастным параметрам. Контрольной группе телят вводили стандартный раствор левамизола 7,5% в дозе 2,5 мл, опытной группе - испытуемый вариант препарата в дозе 2,5 мл.

Полученные результаты (табл.3) позволяют отметить, что на 20-й день количество эритроцитов у телят опытной группы было выше на 12,4% (p<0,05), чем у животных контрольной группы, гематокрит в 10-дневном возрасте был выше на 9,7% (p<0,05). При этом отмечается тенденция к увеличению и уровня гемоглобина в крови телят опытной группы.

У телят опытной группы до первой выпойки молозива количество лейкоцитов было на 24,2% (p<0,05), а в 30-дневном возрасте на 14,6% (p<0,05) выше, чем у животных контрольной группы, что свидетельствует об активизации клеточных факторов иммунитета, при этом наблюдается положительная тенденция к повышению гемоглобина в крови телят.

Результаты исследования эффективности полученного препарата показали, что препарат обладает выраженным антибактериальным действием и эффективно воздействует на иммунную систему животных, что позволяет эффективно лечить инфекционные заболевания и иммунодефицитные состояния животных различной этиологии.

Таблица 1. Антимикробная эффективность заявляемого препарата и янтарного биостимулятора при лечении клинического мастита у коров

Таблица 2. Влияние препарата на гематологические и иммунобиохимические показатели крови поросят, n=10

Показатели Периоды исследований, сут Фоновые показатели 7 14 21 28 Эритроциты, 1012/л Гемоглобин, г/л Белок, г/л Общий кальций, ммоль/л Неорганический фосфор, ммоль Резервная щелочность, об.% CO2 Лейкоциты, 109/л Лимфоциты, % БАСК, % ФАЛ, % Примечание: верхняя строка - показатели поросят опытной группы; нижняя строка - показатели поросят контрольной группы; p<0,05-0,01*

Таблица 3. Влияние препарата на гематологические показатели новорожденных телят, n=10