Результат интеллектуальной деятельности: РЕАГЕНТЫ И СПОСОБЫ ВВЕДЕНИЯ РАДИОАКТИВНОЙ МЕТКИ

Настоящее изобретение относится к реагентам и способам [¹⁸F]-фторирования биомолекул, в частности пептидов. Полученные соединения, меченные ¹⁸F, полезны в качестве радиофармацевтических препаратов, особенно для применения в позитронной эмиссионной томографии (ПЭТ).

Применение меченных радиоактивным изотопом биоактивных пептидов для диагностической визуализации приобретает все большее значение в ядерной медицине. Биологически активные молекулы, которые избирательно взаимодействуют с определенными типами клеток, полезны для доставки радиоактивности к тканям-мишеням. Например, меченные радиоактивным изотопом пептиды обладают значительным потенциалом для доставки радионуклидов к опухолям, инфарктным и инфицированным тканям с целью диагностической визуализации и радиотерапии. ¹⁸F, имеющий период полураспада 110 минут, является предпочтительным позитрон-излучающим нуклидом во многих исследованиях рецепторной визуализации. Таким образом, ¹⁸F-меченные биоактивные пептиды вследствие своей полезности в ПЭТ в отношении количественного обнаружения и определения широкого круга заболеваний имеют большой клинический потенциал.

Одна из проблем приготовления ¹⁸F-меченных пептидов заключается в том, что получение существующих реагентов для ¹⁸F-мечения является трудоемким. Эффективное мечение пептидов и белков фтором ¹⁸F достигается только путем использования подходящих простетических групп. Несколько таких простетических групп предложено в литературе, в том числе N-сукцинимидил-4-[¹⁸F]фторбензоатная, м-малеимидо-N-(n-[¹⁸F]фторбензил)-бензамидная, N-(n-[¹⁸F]фторфенил)малеимидная и 4-[¹⁸F]фторфенацил-бромидная. Почти во всех используемых в настоящее время способах ¹⁸F-мечения пептидов и белков применяют активные сложные эфиры. Наиболее широко применяемым реагентом для ¹⁸F-мечения является N-сукцинимидил-4-[¹⁸F]фторбензоат (SFB). Недостаток SFB заключается в том, что его получение включает 3 синтетические стадии (фторирование, гидролиз и образование активного сложного эфира) с последующей трудоемкой стадией очистки с помощью ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография); таким образом, получение SFB является трудным для автоматизации. Более того, присутствие фенильного кольца в реагенте для мечения существенно повышает гидрофобность ¹⁸F-меченного продукта, что может неблагоприятно повлиять на его профиль биораспределения. Следовательно, все еще существует потребность в альтернативных реагентах и способах ¹⁸F-мечения, которые делают возможным быстрое хемоселективное введение ¹⁸F, в частности в пептиды, в мягких условиях с получением ¹⁸F-меченных продуктов. Кроме того, существует потребность в таких способах, которые поддаются автоматизации с целью облегчения получения радиофармацевтических препаратов в клинических условиях.

Согласно первому аспекту изобретения предложено соединение формулы (I):

В одном из аспектов ¹⁸F-метка присоединена в орто-положении к пиридильному азоту, так что соединение формулы (I) имеет формулу (Ia):

Соединения формулы (I) и (Ia) должны добавить ¹⁸F-мечению биомолекул существенные преимущества. Соединения формулы (I) и (Ia) можно метить фтором ¹⁸F за одну стадию, мечение происходит быстро при почти комнатной температуре, очистку можно осуществить с помощью системы на основе картриджа (например, колонки Oasis МСХ), что делает автоматизацию более доступной. Также известно, что пиридиновая система более гидрофильна, чем бензильный аналог, и поэтому ожидается, что будет добавлено положительное воздействие на профиль биораспределения ¹⁸F-продукта. Как показано ниже, было обнаружено, что сложный тетрафторфениловый эфир более стабилен во время ¹⁸F-мечения, чем другие активные сложные эфиры.

Соединения формулы (I) и (Ia) могут быть получены из соответствующего соединения формулы (II):

или его соли, где L представляет собой уходящую группу, выбранную из хлоро, бромо, йодо, нитро и три(C_1-6алкил)аммония (например, триметиламмония). Такие соединения формулы (II) являются новыми и поэтому образуют дополнительный аспект изобретения.

В одном из аспектов L в соединении формулы (II) представляет собой три(C_1-6алкил)аммоний (например, триметиламмоний) с соответствующим противоионом, выбранным из противоионов, полученных из неорганических кислот, например соляной, бромистоводородной, фосфорной, метафосфорной, хлорной, азотной и серной кислот, и противоионов, полученных из органических кислот, например винной, трифторуксусной, лимонной, яблочной, молочной, фумаровой, бензойной, гликолевой, глюконовой, янтарной, метансульфоновой, трифторметансульфоновой и лара-толуолсульфоновой кислот; с подходящим, выбранным из хлорида, бромида, перхлората, сульфоната, нитрата, фосфата и трифторметансульфоната; с более подходящим трифторметансульфонатным противоионом.

В одном из аспектов соединение формулы (II) представляет собой:

где X^- представляет собой противоион, как он определен выше, и предпочтительно является трифторметансульфонатом.

Получение соединения формулы (I) из соответствующего соединения формулы (II) или его соли может быть осуществлено стандартными способами ¹⁸F-мечения. [¹⁸F]фторид легко получают из ¹⁸O-обогащенной воды с использованием (p, n)-ядерной реакции (Guillaume et al, Appl. Radiat. Isot. 42 (1991) 749-762) и обычно выделяют в виде соли, такой как Na¹⁸F, K¹⁸F, Cs¹⁸F, [¹⁸F]фторид тетраалкиламмония или ¹⁸F-фторид тетраалкилфосфония. Для увеличения реакционной способности [¹⁸F]фторида можно добавить катализатор фазового переноса, такой как аминополиэфир или краун-эфир, например 4,7,13,16,21,24-гексаокса-1,10-диазабицикло[8,8,8]гексакозан (Kryptofix 2.2.2); реакцию проводят в подходящем растворителе. В этих условиях получают реакционноспособные фторидные ионы. Возможно, для улучшения выходов фторидных продуктов можно использовать ловушку свободных радикалов, как описано в WO 2005/061415. Термин "ловушка свободных радикалов" определен как любой агент, который взаимодействует со свободными радикалами и инактивирует их. Подходящая для этой цели ловушка свободных радикалов может быть выбрана из 2,2,6,6-тетраметилпиперидин-N-оксида (TEMPO), 1,2-дифенилэтилена (DPE), аскорбата, парааминобензойной кислоты (РАВА), α-токоферола, гидрохинона, ди-трет-бутилфенола, β-каротина и гентизиновой кислоты.

Обработку соединения формулы (II) [¹⁸F]фторидом можно проводить в присутствии подходящего органического растворителя, такого как ацетонитрил, диметилформамид, диметилсульфоксид, диметилацетамид, тетрагидрофуран, диоксан, 1,2-диметоксиэтан, сульфолан, N-метилпирролидинон, или в ионной жидкости, такой как имидазолиевое производное (например, гексафторфосфат 1-этил-3-метилимидазолия), пиридиниевое производное (например, тетрафторборат 1-бутил-4-метилпиридиния), фосфониевое соединение или тетраалкиламмониевое соединение, при непредельной температуре, например от 15°C до 50°C, предпочтительно примерно при температуре окружающей среды, такой как от 15°C до 30°C, например от 18°C до 25°C.

Соединения формулы (II) и их соли могут быть получены из имеющихся в продаже исходных веществ, таких как 6-хлорникотиновая кислота. Выходы для всего процесса в целом являются хорошими (больше 50%). Стадии включали этерификацию с тетрафторфенолом, активируемую, например, дициклогексилкарбодиимидом (DCC), образование триметиламмониевой соли путем обработки активного сложного эфира 6-хлорникотиновой кислоты насыщенным раствором триметиламина в тетрагидрофуране (THF) и образование трифторметансульфонатной (трифлатной) соли с помощью трифлата серебра.

После получения соединения формулы (I) его можно очистить стандартными способами, обычно с использованием твердофазной экстракции, например, на колонке Oasis МСХ™, из которой соединение формулы (I) можно элюировать с хорошей чистотой, используя подходящую смесь органического растворителя и воды.

Согласно следующему аспекту изобретения предложен способ ¹⁸F-фторирования, включающий взаимодействие соединения формулы (I) с соединением формулы (III):

с образованием ¹⁸F-продукта формулы (IV):

Взаимодействие соединения формулы (I) с соединением формулы (III) можно осуществлять в подходящем растворителе, например в водном буфере, при pH в диапазоне от 2 до 11, например от 3 до 11, и при непредельной температуре от 5 до 70°C, предпочтительно при температуре окружающей среды.

В формулах (III) и (IV) подходящие для мечения биомолекулы представляют собой пептиды, которые могут включать аналоги соматостатина, такие как октреотид, бомбезин, вазоактивный интестинальный пептид, аналоги хемотаксического пептида, α-меланоцитостимулирующий гормон, нейротензин, пептид Arg-Gly-Asp и его аналоги, проинсулинсвязывающий пептид человека, эндотелии, ангиотензин и формил-норлейцил-лейцил-фенилаланил-норлейцил-тирозил-лизин. Предпочтительными пептидами для мечения являются пептид Arg-Gly-Asp и его аналоги, такие как описанные в WO 01/77415 и WO 03/006491. Предпочтительные пептиды содержат фрагмент:

В одном конкретном аспекте биомолекула в формуле (III) или (IV) представляет собой пептид формулы (A):

где X⁷ представляет собой либо -NH₂, либо

где a является целым числом от 1 до 10; предпочтительно a равно 1.

Специалисту будет очевидно, что способы по изобретению также можно применять для ¹⁸F-фторирования других биомолекул, таких как белки, гормоны, олигонуклеотиды и фрагменты антител, а также небольших лекарствоподобных молекул, с целью обеспечения множества ПЭТ индикаторов.

Соединения формулы (III) могут быть получены стандартными способами пептидного синтеза, например твердофазным пептидным синтезом, например, как описано в Atherton, Е. and Sheppard, R.C.; "Solid Phase Synthesis"; IRL Press: Oxford, 1989. Введение первичной аминной группы в соединение формулы (III) можно осуществлять путем взаимодействия с N- или C-концом пептида или с некоторыми другими функциональными группами, содержащимися в пептидной последовательности, модификация которых не влияет на характеристики вектора в отношении связывания. Первичную аминную группу предпочтительно вводят путем образования стабильной амидной связи в результате взаимодействия пептидной аминной функциональной группы с активированной кислотой и вводят либо во время, либо после пептидного синтеза. Если предшественником является кислота, то первичный амин можно ввести с использованием активирующих in situ агентов, таких как гексафторфосфат 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония (HBTU) или N-оксид гексафторфосфата N-[(диметиламино)-1Н-1,2,3-триазоло[4,5-b]пиридин-1-илметилен]-N-метилметанаминия (HATU).

Далее изобретение проиллюстрировано примерами.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Синтез 2,3,5,6-тетрафторфенилового эфира 6-фторникотиновой кислоты

Активный сложный эфир 2,3,5,6-тетрафторфенола (Tfp) и 2-триметиламмоний-никотиновой кислоты синтезировали в три стадии, начиная с 6-хлорникотиновой кислоты (Sigma-Aldrich). Этерификация 6-хлорникотиновой кислоты (3 г, 19 ммоль) 2,3,5,6-тетрафторфенолом (3,25 мг, 19 ммоль), активируемая дициклогексилкарбодиимидом (DCC) (3,96 мг, 19 ммоль), в 50 мл диоксана с последующей кристаллизацией из гексана привела к Tfp эфиру 6-хлорникотиновой кислоты с выходом 73%. Образование триметиламмониевой соли путем обработки активного Tfp-эфира 6-хлорникотиновой кислоты (1 г, 3,27 ммоль) в насыщенном растворе триметиламина (непрерывное барботирование в течение двух часов) в тетрагидрофуране (THF) (15 мл) привело к получению триметиламмониевой соли с хлоридом в качестве противоиона с выходом 45%. Так как в тетрагидрофурановом растворе происходит осаждение соли, непрореагировавшее вещество можно было отфильтровать. Образования трифлатной соли можно добиться двумя путями: либо обработкой соответствующей хлоридной соли трифлатом серебра при молярном избытке 1,2 в ацетонитриле, либо обработкой триметилсилил-трифторметансульфонатом. Последний путь является предпочтительным, так как обработка является более простой и не требуется никакой препаративной хроматографии. Оба способа являются почти количественными.

Синтезированный предшественник (9,2 мг) сначала метили фтором ¹⁹F с помощью К222 (10 мг) и KF (1,1 мг) в ацетонитриле (0,7 мл). Реакцию ¹⁹F с Tfp эфиром изучали с помощью 1Н-ЯМР в ацетонитриле-d6 при 27°C для анализа кинетики реакции и образовавшихся примесей.

Сравнительный пример

N-гидроксисукцинимидный (NHS) эфир 2-триметиламмоний-никотиновой кислоты синтезировали из 6-хлорникотиновой кислоты и метили фтором ¹⁹F аналогично вышеописанным способам.

Результаты

Оба эфира синтезировали с хорошими выходами (больше 30% исходя из 6-хлорникотиновой кислоты), и они быстро реагировали с фторидом в ацетонитриле при комнатной температуре. NHS-эфир был более подвержен гидролизу, чем Tfp-эфир, и поэтому его далее не оценивали. Исследования взаимодействия Tfp-эфира с помощью 1Н ЯМР в течение 30 минут показали быстрое введение фторида при комнатной температуре, через 2,5 минуты 32% исходного вещества превратилось в желаемый фторированный продукт. В одной серии экспериментов 70% фторированного продукта получили менее чем за 20 минут. Вместе с желаемым продуктом были идентифицированы два производных никотиновой кислоты в качестве побочных продуктов.

Пример 2: Взаимодействие 2,3.5.6-тетрафторфенилового эфира 6-фторникотиновой кислоты с функционализированным RGD пептидом

В результате взаимодействия фторированного продукта Примера 1 (1 мг) с соответствующим образом функционализированным RGD пептидом (5 мг, получен, как описано в WO 01/77415 и WO 03/006491) в растворе (1:1) ацетонитрила и 0,1 М фосфата натрия с рН 9 (всего 3 мл) получали желаемый продукт, который был проанализирован с помощью ЖХ-МС (жидкостная хроматография - масс-спектрометрия). Условия ЖХ-МС: Phenomenex Luna С18(2), 3 мкм, 2×50 мм, подвижная фаза А: вода/0,1% трифторуксусная кислота (TFA), подвижная фаза Б: ацетонитрил/0,1% TFA, поток 0,6 мл/мин, 10-30% Б за 5 мин. Время удерживания (Rt)=3,42 мин, М+Н⁺ (ожидаемое значение 1381,5; обнаруженное 1381,6).

Пример 3: Радиохимический синтез 2.3.5.6-тетрафторфенилового эфира 6-[¹⁸F]фторникотиновой кислоты

Водный [¹⁸F]фторид (до 150 МБк) азеотропно сушили в присутствии 15 мг Krytptofix 222 и 3 мг бикарбоната калия (КНСО₃) при нагревании под N2 до 100°С в течение 9 минут. За этот период времени добавляли и выпаривали 2x1 мл ацетонитрила. После охлаждения до 40°С добавляли раствор метансульфоната триметил-[5-(2,3,5,6-тетрафторфеноксикарбонил)-пиридин-2-ил]аммония (7 мг в 1 мл ацетонитрила). Для осуществления мечения реакционный сосуд нагревали до 40°С в течение 10 минут. Неочищенную реакционную смесь подвергали радио-ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) и радио-ТСХ (тонкослойная хроматография) с совместной инжекцией нерадиоактивного стандартного образца для подтверждения образования целевого F-соединения. Выходы продукта включения обычно составляли от 50 до 80% при анализе радио-ТСХ (n=3).

Радио-ТСХ: Предварительно покрытые силикагелевые пластины 60 F254 (Merck). Градиент: н-гексан/этилацетат 50:50. Для измерения распределения радиоактивности на пластинах ТСХ использовали устройство для быстрой визуализации Instant Imager (Packard Bioscience). Rf: 0,65.

Радио-ВЭЖХ: Аналитическую радио-ВЭЖХ осуществляли на системе Agilent (1100 series), оборудованной УФ детектором, последовательно соединенным с γ-детектором (Bioscan Flow-Count). Колонка Phenomenex Luna С18(2) (150 х 4,6 мм, 5 мкм), поток 1,0 мл/м с градиентом 20-80% Б за 20 мин (УФ детектирование при 214 и 254 нм объединяли с γ-детектором). Rt 14,4 мин.

Очистка

Неочищенную реакционную смесь, содержащую 2,3,5,6-тетрафторфениловый эфир -[¹⁸F]фторникотиновой кислоты в 2 мл ацетонитрила, разбавляли дистиллированной водой до 30% ацетонитрила. Водный раствор пропускали через картридж Oasis МСХ plus (подготовленный согласно рекомендациям производителей). Затем картридж ополаскивали 5 мл дистиллированной воды. После этого очищенный продукт элюировали из колонки 100% ацетонитрила с радиохимической чистотой выше 90%. Все остатки непрореагировавшего предшественника, представляющего собой метансульфонат триметил-[5-(2,3,5,6-тетрафторфеноксикарбонил)-пиридин-2-ил]аммония, оставались на картридже.

Пример 4: Конъюгация 2.3.5.6-тетраaторфенилового эфира 6-[¹⁸F]aторникотиновой кислоты с циклическим RGD-пептидом, имеющим свободную функциональную группу амино

К раствору очищенного 2,3,5,6-тетрафторфенилового эфира 6-[¹⁸F]фторникотиновой кислоты в 1,5 мл раствора (1:1) ацетонитрил/вода добавляли 3 мг соответствующим образом функционализированного RGD пептида (молекулярная масса: 1258,47), растворенного в 1 мл раствора (1:1) ацетонитрила и 0,1 М NaHPO₄. Полученную смесь с рН 9 нагревали до 40°C. Через 30 минут небольшую аликвоту смеси анализировали с помощью радио-ВЭЖХ. Радиохроматограмма показала превращение в желаемый продукт с выходом больше 65%. Продукт элюировали совместно с его ¹⁹F-стандартным образцом.

Радио-ВЭЖХ: Аналитическую радио-ВЭЖХ осуществляли на системе Agilent (1100 series), оборудованной УФ детектором, последовательно соединенным с γ-детектором (Bioscan Flow-Count). Колонка Phenomenex Luna С18(2) (150×4,6 мм, 5 мкм), поток 1,0 мл/м с градиентом 0-40% Б за 20 мин (УФ детектирование при 214 и 254 нм объединяли с γ-детектором). Rt 10,0 мин.