×
27.06.2014
216.012.d93b

СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ РАКА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Вид РИД

Изобретение

Юридическая информация Свернуть Развернуть
Краткое описание РИД Свернуть Развернуть
Аннотация: Изобретение относится к области медицины и предназначено для дифференциальной диагностики рака предстательной железы. В клетках периферической крови пациента методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени измеряют экспрессию генов Тр53, GSTP1 и IL10 относительно референтного гена β-актина (АСТВ). При величинах относительной экспрессии генов Тр53 больше 3,68×10, GSTP1 больше 3,73×10 и IL10 меньше величины 4,32×10 диагностируют рак предстательной железы. При величинах относительной экспрессии генов Тр53 меньше 3,68×10, GSTP1 меньше 3,73×10 и IL10 больше 4,32×10 диагностируют доброкачественную гиперплазию предстательной железы. Изобретение позволяет эффективно диагностировать рак предстательной железы и доброкачественную гиперплазию предстательной железы в том числе при низких значениях простатоспецифического антигена, что позволяет начать своевременную и адекватную терапию. 5 табл., 4 пр.
Основные результаты: Способ дифференциальной диагностики рака предстательной железы путем исследования биологической жидкости больного, отличающийся тем, что в клетках периферической крови пациента методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени измеряют экспрессию генов Тр53, GSTP1 и IL10 относительно референтного гена β-актина (АСТВ) в клетках мононуклеарной фракции периферической крови и при величинах относительной экспрессии генов Тр53 больше 3,68×10, GSTP1 больше 3,73×10 и IL10 меньше величины 4,32×10 диагностируют рак предстательной железы, если величина относительной экспрессии гена Тр53 меньше 3,68×10, GSTP1 меньше 3,73×10 и IL10 больше 4,32×10 - диагностируют доброкачественную гиперплазию предстательной железы.
Реферат Свернуть Развернуть

Изобретение относится к области медицины и найдет применение в урологии, в частности при дифференциальной диагностике рака предстательной железы и доброкачественной гиперплазии предстательной железы.

Рак предстательной железы относится к одному из наиболее распространенных онкологических заболеваний мужчин среднего и пожилого возрастов в развитых странах. По количеству летальных исходов среди онкологических заболеваний рак предстательной железы /РПЖ/ уступает лишь раку легких [Jemal A., Siegel R. et al. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 2010 Sep-Oct; 60(5):277-300]. Осложненное течение заболевания и летальность при РПЖ происходят вследствие метастазирования [Plate K. From angiogenesis to lymphangiogenesis. Nature Medicine 2001; 7:151-152.]. До настоящего времени не обнаружены маркеры, дифференцирующие «малый» РПЖ от доброкачественной гиперплазии предстательной железы /ДГПЖ/. Такие диагностические возможности чрезвычайно актуальны: согласно статистике, в течение пяти лет после диагностирования и своевременного лечения локального РПЖ, выживает 88% пациентов, тогда как доля выживших пациентов с болезнью, диагностированной в метастатическую фазу, составляет только 29% [Coffey D. Prostate cancer. An overview of an increasing dilemma. Cancer 1993. 71(3):880-886.]. Использование простатоспецифического антигена /ПСА/ сыворотки крови для диагностики РПЖ до сих пор является «золотым стандартом». Однако высокий уровень ложноотрицательных и ложноположительных результатов при его использовании, широкое разнообразие изоформ ПСА являются трудной проблемой диагностики РПЖ, требующей решения [Stamey Т., Johnstone I. et al. Preoperative serum prostate specific antigen levels between 2 and 22 ng/ml correlate poorly with post-radical prostatectomy cancer morphology: prostate specific antigen cure rates appear constant between 2 and 9 ng/ml. J. Urol. 2002;167: 103-111; Carling P., Elliott D et al. Targeting alternative splicing in prostate oncology. Discov Med. 2009; 8(41):74-80.]. В настоящее время наблюдается рост количества публикаций с использованием подхода полимеразная цепная реакция в реальном времени /РВ-ПЦР/ для выявления предполагаемых онкомаркеров предстательной железы.

Скрининг пациентов на содержание ПСА в плазме периферической крови остается «золотым стандартом» при диагностике РПЖ. Однако применение этого маркера ограничивается его малой специфичностью, особенно, это касается дифференцировки ДГПЖ и ранних стадий РПЖ.

В качестве объекта исследования для диагностики онкологических заболеваний в последнее время все чаще используется мононуклеарная фракция клеток (МНФ) периферической крови. МНФ включает в себя лимфоциты, моноциты, макрофаги, базофилы и дендритные клетки. Эти клетки являются одними из важнейших компонентов иммунной системы в борьбе с инфекциями и онкотрансформированными клетками. [Delves P. et al. Roitt′s Essential Immunology, 11 th Ed.] МНФ клеток периферической крови предоставляет для анализа легкодоступный субстрат иммунной системы для поиска новых биомаркеров в качестве биосенсоров для диагностики различных патологических процессов [Novelli G., et al. May-Aug Genetic tests and genomic biomarkers: regulation, qualification and validation. Clin Cases Miner Bone Metab. 2008; 5(2):149-154].

Исследование паттерна экспрессии генетических локусов МИФ клеток периферической крови эффективно используется в отдельных медицинских центрах для постановки диагноза и оценки эффективности лечебных мероприятий у больных раком предстательной железы. В частности, в работе Komatsu et al. [Komatsu N., Matsueda S. et al. Gene expression profiles in peripheral blood as a biomarker in cancer patients receiving peptide vaccination. Cancer 2012 Jun 15; 118(12):3208-3221] анализ экспрессии генетических локусов в МНФ периферической крови, позволил эффективно (с точностью 92%) разделить группы больных РПЖ с разными сроками выживаемости.

В работе Novelli et al. [Novelli G., et al. Genetic tests and genomic biomarkers: regulation, qualification and validation. Clin Cases Miner Bone Metab. 2008 May-Aug; 5(2): 149-154.] был разработан олиго-чип низкой плотности ("AndroChip 2") для анализа 190 генетических локусов, отобранных на основе их доказанной или возможной роли в канцерогенезе предстательной железы по механизму андрогенной сигнализации.

В качестве маркеров циркулирующих в крови малигнизированных клеток предстательной железы в некоторых работах предлагается использовать уровень транскрипционной активности генетического локуса ПСА и простатспецифичного мембранного антигена (ПСМА) [Grasso Y. et al.. Combined Nested RT-PCR assay for prostate-specific antigen and prostate-specific membrane antigen in prostate cancer patients: correlation with pathological stage. Cancer Research 1998; 58:1456-1459], антигена эпителиальных клеток CK-19 [Machado M. et al. CK-19 expression by RT-PCR in the peripheral blood of prostate cancer patients. Journal of Clinical Oncology 2005; 23:248-252], CD44-рецептора, отвечающего за адгезию клеток к элементам внеклеточного матрикса [Paradis V. et al. De novo expression of CD44 in prostate carcinoma is correlated with systemic dissemination of prostate cancer. Clin Pathol 1998; 51: 798-802], ткане- и онкоспецифичных генов p503s, p504s и p510s [Xu J. et al.. Identification of differentially expressed genes in human prostate cancer using subtraction and microarray. Can. Res 2000; 60:1677-1682] и т.д. В качестве потенциальных онкомаркеров объектом исследований часто становятся супрессоры опухолей и регуляторы клеточного цикла, изменение транскрипционной активности которых может отражать прогресс онкотрансформации.

Однако полученные результаты не всегда подтверждаются в повторных исследованиях.

Известен способ контроля за лечением опухолей предстательной железы по патенту РФ№2079132, (10.05.1997), включающий предварительное выявление заболевания путем определения содержания ДНК в опухолевых клетках биологического материала, отличающийся тем, что в качестве биологического материала используют утреннюю мочу до и после пальцевого обследования предстательной железы и при обнаружении в ней после пальцевого обследования увеличения количества клеток с содержанием ДНК больше, чем тетраплоидное и/или более 5 7 количества клеток с содержанием ДНК больше, чем у нормальных диплоидных, по сравнению с пробой мочи до пальцевого обследования, судят о наличии в ней опухолевых клеток из предстательной железы, а контроль за последующим лечением осуществляют по изменению этих показателей, при этом по уменьшению их значений судят о правильности выбранной тактики лечения.

Недостаток способа: состоит в ускорении выявления опухолевых клеток и снижении травматичности процедуры, но применим только в онкологии. Как указывают сами авторы, сравнительный анализ процентного содержания клеток, находящихся в G0+G1 фазах цикла и элементов с плоидностью менее 20, показывает, что по этим показателям группы больных, страдающих аденомами и раком предстательной железы, мало отличаются друг от друга, хотя и отличаются от контроля (р<0,05).

Известен способ дифференциальной диагностики доброкачественной гиперплазии и рака предстательной железы по патенту РФ №2151397, (20.06.2000). В цельной крови методом проточной горизонтальной хроматографии определяют уровень фосфатидилинозит-3-фосфатов (ФИФ 1). И при значениях 0,1-0,08 нмоль фосфора ФИФ 1 на 1 мг белка диагностируют доброкачественную гиперплазию предстательной железы, а при значении 0,04-0,01 нмоль фосфора ФИФ 1 на 1 мг белка - рак предстательной железы.

Известен способ дифференциальной диагностики гиперплазии, дисплазии и рака предстательной железы по патенту РФ №2156977, (27.09.2000). Проводят микротелефотометрическое исследование срезов биоптатов, окрашенных по Фельгену, для определения содержания дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) в ядрах интерфазных клеток популяции ростковых зон и вычисляют индекс ее накопления, и при его значениях от 2,2 до 3,7 диагностируют гиперплазию, от 3,8 до 6,5 - дисплазию, а от 6,6 и выше - разные формы рака предстательной железы.

Недостатки: перечисленные методы оказались недостаточно специфичными, трудно воспроизводимыми и не нашли до настоящего времени клинического применения (Злокачественные новообразования в России в 2002 году. Заболеваемость и смертность. / Ред. В.И. Чиссов, В.В. Старинский, Г.В. Петрова, М., Из-во "МЕДпресс-информ". 2004. С.5-22).

Известен способ цитометрической диагностики опухолевых заболеваний предстательной железы по патенту РФ №2322676, (20.04.2008). Для осуществления способа клеточные отпечатки биоптатов предстательной железы фиксируют спиртом и окрашивают 50% раствором AgNO3. Далее проводят компьютерную морфометрию ядерно-ядрышкового аппарата и выделяют 6 морфотипов ядер, имеющих следующие характеристки по средним значениям площадей: 1-й морфотип - ядра 34,43 мкм2, ядрышки 1,43 мкм 2; 2-й морфотип - ядра 45,71 мкм2, ядрышки 2,78 мкм2; 3-й морфотип - ядра 51,64 мкм2, ядрышки 4,60 мкм 2; 4-й морфотип - ядра 62,70 мкм2, ядрышки 6,96 мкм2; 5-й морфотип - ядра 94,91 мкм2, ядрышки 11,07 мкм 2, 6-й морфотип - ядра 111,46 мкм2, ядрышки 16,35 мкм2. При этом при выявлении 1-3 морфотипов диагностируют доброкачественную гиперплазию, 1-4 морфотипов - интраэпителиальную неоплазию, 1-6 морфотипов - рак предстательной железы.

К недостаткам данного метода, как и для всех микроскопических методов, можно отнести относительно высокий фактор субъективности оценки наблюдаемой картины. Биопсия простаты, особенно на ранних стадиях развития РПЖ зачастую не имеет возможности дать объективную гистологическую картину опухолевого процесса простаты, и требует повторных болезненных процедур.

Известен маркер рака предстательной железы по патенту РФ №2360924, (10.07.2009), который состоит из белка молекулярной массы 28,5 кДа и видимой изоэлектрической точкой 6,92, выделяемого из опухолевой ткани предстательной железы. Выделенный маркерный белок включает пептиды MPADLPSLAADFVESK; DVFLGMFLYEYAR; VFDEFKPLVEEPQNLIK; FQNALLVR; VPQVSTPTLVEVSR и AVMDDFAAFVEKCCK.

Недостатки - предлагаемый тест сходен с тестом на простатспецифичный антиген и поэтому имеет те же недостатки, в частности малую специфичность.

Известен способ диагностики онкологических заболеваний предстательной железы по патенту РФ№2348042, (27.02.2009). Способ включает сочетанное определение активности сериновой протеиназы-хепсина и метилированного гена глютатион-S-трансферазы класса PI (GSTP1) в опухолевых клетках, обнаруживаемых в моче пациентов, и при значении активности хепсина выше, чем 42% по отношению к контролю, и выявлении метилированного гена GSTP1 диагностируют онкологическое заболевание.

Известен способ диагностики рака предстательной железы на основе детекции метилирования гена GSTP1 в биологических жидкостях и тканях человека, в том числе моче пациентов (патент США №7,049,062).

Недостатками такого определения являются традиционно низкая прогностическая ценность при использовании одного маркера, а также отсутствие первичного материала (объектов анализа) - т.е. опухолевых клеток предстательной железы.

Описан анализ аномального метилирования трех генов (GSTP1, RASSF1A, RARβ 2), вовлеченных в канцерогенез предстательной железы, показана значительная частота этого явления. Предполагается, что эти гены могут быть использованы для ранней диагностики и определения прогноза развития рака предстательной железы (Perry AS, Foley R, Woodson K, Lawler M. The emerging roles of DNA methylation in the clinical management of prostate cancer. Endocr Relat Cancer. 2006 Jun; 13(2):357-77).

Однако авторы не анализируют метилирование других генов, используют в своем анализе метилспецифическую полимеразную реакцию (МС-ПЦР). Кроме того, анализ проводился на опухолевом и биопсийном материале (что может приводить к занижению частот метилирования, если не использована микродиссекция опухолевых клеток).

Известен способ ранней ДНК-диагностики рака предстательной железы по патенту РФ №2405837, (10.12.2010). Исследуют сыворотку крови на предмет метилирования промоторных районов генов GSTP, р16 и N33 методом метил-чувствительной ПЦР. И при обнаружении аномального метилирования хотя бы двух из указанных генов, делают вывод о наличии заболевания.

К недостаткам можно отнести относительно небольшие величины содержания внеклеточной ДНК в сыворотке крови, с вытекающими отсюда проблемами анализа при малом количестве ДНК и большие затраты времени при выполнении диагностики. На сегодняшний день сертифицированных тест-систем и способов ДНК-диагностики такого типа не существует.

Известен способ дифференциальной диагностики морфологических форм рака предстательной железы по патенту РФ №2455643, (10.07.2012), включающий исследование образца сыворотки крови, обработку полученных данных и диагностику заболеваний, где перед исследованием в образец сыворотки крови вводят химические реагенты, а именно: фосфатный буфер с рН 7,4-7,5, раствор сульфата железа (FeSO4) и перекись водорода, световой поток, выделяющийся в результате протекания химической реакции, регистрируют и измеряют величину максимальной интенсивности свечения (Imax) и светосумму (S), характеризующую свечение в течение первых 30 секунд, и при значении максимальной интенсивности свечения (Imax) выше 3,2 мВ и светосуммы (S) выше 24,9 мВ диагностируют злокачественную опухоль предстательной железы как опухоль с инфильтративным ростом, а при значении Imax, равном или меньшем 3,2 мВ, и S, равном или меньшем 24,9 мВ, диагностируют злокачественную опухоль предстательной железы без инфильтративного роста.

Недостатком данного метода является потенциально низкая специфичность изменения хемилюминесценции сыворотки крови - существует много литературных данных изменения данного показателя не только при раке, но и при любых воспалительных процессах.

Прототипом изобретения нами выбран патент США №7,049,062, адаптированный к измерению величины относительной экспрессии генетических локусов МНФ периферической крови человека методами обратной транскрипции с последующим количественным измерением методом Real-Time.

Недостатками данного метода с нашей точки зрения являлись его относительная низкая специфичность и чувствительность к дифференцировке различных фаз развития рака предстательной железы.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа дифференциальной диагностики ДГПЖ и рака предстательной железы, обладающего высокой специфичностью, экономически выгодного и простого в применении.

Поставленная задача решается предлагаемым способом дифференциальной диагностики рака предстательной железы: что в клетках периферической крови пациента методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени измеряют экспрессию генов Тр53, GSTP1 и IL10 относительно референтного гена β-актина (АСТВ) в клетках мононуклеарной фракции периферической крови и при величинах относительной экспрессии генов Тр53 больше 3,68×10-6, GSTP1 больше 3,73×10-3 и IL10 меньше величины 4,32×10-5 диагностируют рак предстательной железы, если величина относительной экспрессии гена Тр53 меньше 3,68×10-6, GSTP1 меньше 3,73×10-3 и IL10 больше 4,32×10-5 - диагностируют доброкачественную гиперплазию предстательной железы. Использование показателей отношения транскрипционной активности генетического локуса BCL2 по сравнению с локусом ВАХ (отношение BCL2/BAX) в клетках МНФ периферической крови (способ - прототип) позволяет эффективно дифференцировать локальный и местнораспространенный РПЖ между собой при пороговом уровне при РПЖ Т3-4 менее единицы.

Новым техническим результатом предлагаемого способа является то, что он позволяет с высокой точностью осуществлять дифференциальную диагностику раннего рака предстательной железы и ДГПЖ, при его экономичности и простоте, значительно снизить количество неоправданных биопсий предстательной железы.

Данный технический результат обусловлен тем, что найдены специфические для рака простаты биомаркеры, проявляющиеся в изменении транскрипционной активности генетических локусов в мононуклеарной фракции периферической крови. В качестве целевых кандидатных локусов были выбраны гены, играющие критическую роль в регулировании клеточного цикла, апоптоза, ангиогинеза и окислительного фосфорилирования митохондриальной локализации. [Водолажский Д.И., Тимошкина Н.Н. Молекулярно-генетические маркеры рака предстательной железы. Вестник Южного научного центра 2009; 5 (1): 36-52.]

Предлагаемый нами подход позволяет объективно и с высокой специфичностью с использованием образцов периферической крови дифференцировать различный стадии патологических процессов в тканях предстательной железы. Метод доступен и воспроизводим.

Многочисленные клинические данные указывают на то, что лейкоциты периферической крови человека активно участвуют в процессах онкогенеза. Иммунный статус здорового индивида отличается от патологического статуса, который допускает существование злокачественных опухолей [Finke J. et al. Where have all the Т cells gone? Mechanisms of immune evasion by tumors. Immunol 1999 Apr; 20(4):158-60]. Происходит накопление хронически активированных клеток-супрессоров миелоидного происхождения и регуляторных Т-клеток, находящихся в кровотоке, лимфоидных органах и неопластических тканях [Curiel, Т. et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nature Med 2004; 10:942-994; Serafini, P. et al. Derangement of immune responses by myeloid suppressor cells. Cancer Immunol. Immunother 2004; 53:64-72.]. Лейкоциты миелоидного происхождения могут способствовать развитию опухолей, являясь источником факторов роста сосудов и других стимуляторов клеточного роста [Sparmann, A., Bar-Sagi, D. Ras-induced interleukin-8 expression plays a critical role in tumor growth and angiogenesis. Cancer Cell 2004; 6:447-458].

Сценарий развития РПЖ затрагивает транскрипционный статус намного меньшего количества генетических локусов, что затрудняет поиск информативных биомаркеров для детекции РПЖ. Поэтому отличий в паттернах изменения генетических локусов между группой ДГПЖ и группами РПЖ наблюдалось в рамках настоящего исследования намного меньше. Это позволяет нам высказать предположение, что большая часть изменений в транскрипционных профилях клеток МНФ периферической крови, лежащих в основе процесса онкотрансформации, происходит уже при ДГПЖ и носит системный характер, вовлекая в себя клетки МНФ периферической крови.

Использование двух биомаркеров (HIF1A и HV2) для определения стадии опухолевого процесса невозможно из-за того, что они не позволяют различить пациентов с ДГПЖ и РПЖ Т 1-2. Это связано с тем, что транскрипционная активность подавляющего большинства исследованных нами локусов статистически достоверно изменяется уже при ДГПЖ, и продолжает определяться без существенных изменений своего статуса в группах РПЖ Т1-2 и РПЖ Т3-4. Обнаружено значимое изменение экспрессии генов: ТР53 - гена супрессора образования злокачественных опухолей, GSTP1 - гена глутатион S-трансферазы pil и IL10 МНФ крови при РПЖ в сравнении с доброкачественной гиперплазией простаты. Увеличение экспрессии гена ТР53 может явиться эффективным критерием дифференцировки ДГПЖ и начальных стадий РПЖ. Увеличение экспрессии гена GSTP1 и уменьшение экспрессии IL10 может явиться дифференцирующим критерием ДГПЖ и ранних стадий РПЖ.

Таким образом, изменение паттерна экспрессии генетических локусов МНФ периферической крови может быть эффективно использовано для диагностики раковых заболеваний, в том числе и рака простаты.

Подробное описание способа

Материалом для исследований служит венозная кровь, забор которой осуществляют с использованием вакутайнеров, содержащих стабилизатор EDTA KE ("Sarstedt", Germany). Венозную кровь после взятия визуально тестируют на отсутствие гемолиза и в течение 1 часа доставляют для анализа в лабораторию в охлажденном виде.

Препаративное выделение фракции мононуклеарных клеток из цельной периферической крови проводят методом дифференциального гемолиза с использованием хлористого аммония [Berteau P., Dumas F. et al. Molecular Detection of Circulating Prostate Cells in Cancer II: Comparison of Prostate Epithelial Cells Isolation Procedures. Clinical Chemistry 1998; 44 (8): 1750-1753]. Выбранный нами метод фракционирования клеток крови, по сравнению с применяемыми методами обогащения CTCs в градиенте плотности и иммуномагнитной сорбцией, позволяет получать мононуклеарную фракцию клеток без потерь CTCs, лишенных априорно предполагаемых маркерных антигенов, в том числе в результате ЕМТ [Panteleakou Z. et al. Detection of circulating tumor cells in prostate cancer patients: methodological pitfalls and clinical relevance. Mol. Med. 2009; 15: 101-114].

Экстракцию суммарной РНК из мононуклеарной фракции клеток периферической крови проводят по Хомчинскому [Chomczynski P., Sacchi N.. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem 1987; 162: 156-159]. Для этих целей используют набор реагентов «РИБО-золь-А» (ООО «ИнтерЛабСервис», Россия). Количественную оценку и нормализацию полученных препаратов РНК осуществляют с помощью набора Quant-iT™ RNA Assay Kit («Invitrogen», USA) на флюориметре Qubit™ («Invitrogen», USA).

Удаление остаточной ДНК из препаратов РНК осуществляют в два этапа. На первом этапе препараты РНК обрабатывают ДНКазой I (#EN0525, Fermentas) согласно протоколу фирмы-изготовителя. На втором этапе препараты РНК центрифугируют в растворе 2М хлорида лития и дважды отмывают 80%-м этанолом [Barlow J. et al. A Simple Method for the Quantitative Isolation of Undegraded High Molecular Weight Ribonucleic Acid. Biochem. Biophys. Res. Commun 1963; 13:61-66].

Для получения кДНК на выделенной РНК - матрице (от 0,5 до 1 мкг) проводят реакцию обратной транскрипции с помощью комплекта реагентов «PEBEPTA-L» (000 «ИнтерЛабСервис», Россия) с использованием рэндомных гексамерных праймеров.

На всех этапах растворения препаратов РНК в DEPC-воде, обработке проб РНК ДНКазой I и синтеза первой цепи кДНК добавляют ингибитор рибонуклеаз (IRNase, ЗАО «Синтол», Россия) до конечной концентрации 1 ед. акт./мкл.

Полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени (ПЦР-РВ) используют для определения транскрипционной активности ядерных генов BCL2, ВАХ, ТР53, GSTP1, IL10. В качестве референтного гена использовали ген β-актина (АСТВ). Подбор праймеров для каждого локуса осуществляют с помощью международной базы данных RTPrimer DB (http://www.rtprimerdb.org/) и на основании литературного поиска (Табл.1).

ПЦР-РВ проводят в присутствии флуоресцентного интеркалирующего красителя Eva Green с использованием набора реактивов R-441 (ЗАО «Синтол», Россия) на приборе iCycler CFX96 (Bio-Rad, USA). Объем ПЦР-смеси составляет 25 мкл и содержит 2,5 мМ MgCl2, 5 пкМ каждого праймера, 0.25 мМ dNTP, 1x ПЦР-буфер и 1 ед. акт. HotTaq полимеразы. Матрица кДНК была нормализована до 2-3 нг на реакцию. Амплификацию проводят с использованием следующей программы: первичная денатурация 95°С - 4 мин.; 40 циклов: 95°С - 30 с, 58°С - 20 с, 72°С - 20 с. Для определения экспрессии каждого гена ПЦР-РВ проводят в трех повторностях для каждого локуса с использованием не менее двух наиболее близких значений Ct. Для контроля эффективности ПЦР-РВ и адекватности получаемых результатов каждый опыт сопровождают постановкой реакций, в которых матрицей служила ДНК, оставшаяся в препаратах суммарной РНК без проведения реакции обратной транскрипции.

Работоспособность заявляемого способа подтверждается следующими клиническими примерами:

Пример 1.

Пациент Б-ов, 65 лет.

В марте 2012 г. проходил обследование в клинике урологии Ростовского государственного медицинского университета с предварительным диагнозом гиперплазия предстательной железы. Жалобы на учащенное мочеиспускание.

Результаты проведенного пальцевого ректального исследования показали: границы предстательной железы нечеткие; железа - умеренно увеличена, уплотнена, неоднородна. Количество баллов по международной шкале оценки простатических симптомов (IPPS) - 18.

Общий анализ мочи - норма. Лабораторная диагностика: ПСА=0,3 нг/мл. Результаты ТРУЗИ предстательной железы: объем простаты - 63 см3.

Пациенту было проведено исследование согласно заявляемому способу.

Таблица 2.
Уровень относительной экспрессии предлагаемых генов, полученные у пациента.
Ген Уровень полученной экспрессии, 2-ΔCt Пороговый уровень экспрессии при РПЖ Диагноз
ТР53 5,92×10-6 >3,68×10-6 РПЖ Т1-2
GSTP1 9,61×10-3 >3,73×10-3 РПЖ Т1-2
IL10 1,71×10-5 <4,32×10-5 РПЖ Т1-2

Согласно результатам, полученным методом ПЦР-РВ, уровень экспрессии ТР53, GSTP1, IL10 генов в МНФ крови значительно отличается от показателей, известных для ДГПЖ: активность генов ТР53 и GSTP1 повышается в 1,6 и 2,6 раза, соответственно, тогда как уровень экспрессии IL10 снижается в 2,5 раз (Табл.2). Наблюдаемые значения по всем трем локусам соответствуют раку предстательной железы РПЖ Т 1-2.

Биопсия простаты (гистологическое заключение), выполненная обосновано: высокодифференцированная аденокарцинома, занимающая верхушку правой доли простаты. Индекс Глиссона 4(2+2).

Пример 2.

Пациент Г-ев, 69 лет.

В январе 2012 года проходил обследование в клинике урологии Ростовского государственного медицинского университета с предварительным диагнозом гиперплазия предстательной железы. Жалобы на учащенное мочеиспускание.

Результаты проведенного пальцевого ректального исследования показали: границы предстательной железы нечеткие; железа - умеренно увеличена, без очаговых образований. Количество баллов по международной шкале оценки простатических симптомов (IPPS) - 16.

Общий анализ мочи - норма. Лабораторная диагностика: ПСА=8,44 нг/мл. Результаты ТРУЗИ предстательной железы: объем простаты - 54 см3.

Пациенту было проведено исследование согласно заявляемому способу.

Таблица 3.
Уровень относительной экспрессии предлагаемых генов, полученных у пациента.
Ген Уровень полученной экспрессии, 2-ΔCt Пороговый уровень экспрессии при РПЖ Диагноз
ТР53 3,86×10-6 >3,68×10-6 РПЖ Т1-2
GSTP1 1,1×10-2 >3,73×10-3 РПЖ Т1-2
IL10 2,84×10-5 <4,32×10-5 РПЖ Т1-2

Согласно полученным в ПЦР-РВ результатам (табл.3), уровень экспрессии ТР53 отличается от подобного показателя для ДГПЖ, активность GSTP1 гена в МНФ крови пациента в 3 раза превысила показатель ДГПЖ, а IL10 гена - в 1,5 раза снизилась, что идентифицирует по двум локусам местно распространенный рак предстательной железы.

Биопсия простаты (гистологическое заключение): высодифференцированная аденокарцинома с поражением двух долей. Индекс Глиссона 6(3+3).

Пример. 3.

Больной Б-ов, 76 лет.

В феврале 2009 года проходил обследование в клинике урологии Ростовского государственного медицинского университета с диагнозом подозрение на рак предстательной железы. Жалобы на частое затрудненное мочеиспускание.

Результаты проведенного пальцевого ректального исследования: границы предстательной железы нечеткие; железа - увеличена с уплотнениями в обеих долях каменистой плотности, неоднородна. Количество баллов по международной шкале оценки простатических симптомов (IPPS) - 20.

Общий анализ мочи - норма. Лабораторная диагностика: ПСА=64,4 нг/мл.

Результаты ТРУЗИ предстательной железы: объем простаты - 55 см3

Пациенту было проведено исследование согласно заявляемому способу.

Таблица. 4
Уровень относительной экспрессии предлагаемых генов, полученных у пациента.
Ген Уровень полученной экспрессии, 2-ΔCt Пороговый уровень экспрессии при РПЖ Т3-4 Диагноз
BCL2/BAX 0,33 <1,0 РПЖ Т3

Биопсия простаты (гистологическое заключение): Умереннодифференцированная ацинарная аденокарцинома индекс Gleason 7 (4+3), локализующаяся в двух долях, занимающая до 100% объема биоптатов, прорастает капсулу, инвазия в периневальные пространство

Пример 4.

Больной И-ов, 63 лет.

В декабре 2011 года проходил обследование в клинике урологии Ростовского государственного медицинского университета с диагнозом доброкачественная гиперплазия предстательной железы. Жалобы на частое затрудненное мочеиспускание.

Результаты проведенного пальцевого ректального исследования: границы предстательной железы четкие, железа увеличена по аденоматозному типу, без очаговых образований, однородна. Количество баллов по международной шкале оценки простатических симптомов (IPPS) - 22.

Общий анализ мочи - норма. Лабораторная диагностика: ПСА=3,8 нг/мл.

Результаты ТРУЗИ предстательной железы: объем простаты - 75 см3.

Пациенту было проведено исследование согласно заявляемому способу.

Таблица 5.
Уровень относительной экспрессии генов, полученных у пациента.
Ген Уровень полученной экспрессии, 2-ΔCt Пороговый уровень экспрессии при РПЖ Т1-2 Диагноз
ТР53 1,8×10-6 >3,68×10-6 ДГПЖ
GSTP1 1,7×10-3 >3,73×10-3 ДГПЖ
IL10 7,5×10-5 <4,32×10-5 ДГПЖ
BCL2/BAX 3,3 >0,9 ДГПЖ

Нами обследовано 78 мужчин, разделенных на группы: ДГПЖ, РПЖ Т1-2, РПЖ Т3-4, здоровые.

Во всех случаях рак верифицировался путем выполнения биопсии предстательной железы и гистологически представлял аденокарциному. Объем поражения опухолью биоптатов - 70-100%. Сумма Глисона варьировала от 6 до 10 баллов.

Для выяснения чувствительности выбранных биомаркеров для анализа РПЖ и их способности отражать стадийность развития этого заболевания, мы провели сопоставление изменений транскрипционного паттерна изучаемых генов МНФ периферической крови при РПЖ с аналогичными показателями контрольной группы.

Статистически значимые отличия (р<0.05) между группами РПЖ и ДГПЖ наблюдались для транскрипционной активности 3 генов: ТР53, GSTP1 и IL10. При этом наиболее выраженные количественные отличия наблюдались для увеличения транскрипционной активности гена ТР53 в ряду ДГПЖ → РПЖ Т1-2 (увеличение относительной экспрессии в 3 раза) и ДГПЖ → РПЖ Т3-4 (увеличение относительной экспрессии в 4 раза).

Изменения в транскрипционной активности генов GSTP1 и IL10 в группах РПЖ носили разнонаправленный характер. Относительная экспрессия гена GSTP1 у больных группы РПЖ Т1-2 увеличивалась на 40% по сравнению с группой больных с ДГПЖ, в то время как в группе с РПЖ Т3-4 аналогичный показатель уменьшался на 70%. Таким образом, суммарное изменение экспрессии локуса GSTP1 между группами больных РПЖ Т1-2 и РПЖ Т3-4 достигает 110%, что позволяет дифференцировать стадии локального и местнораспространенного развития патологического процесса с высоким уровнем достоверности.

Относительная экспрессия гена IL10 у больных с РПЖ Т1-2 уменьшалась на 30% по сравнению с группой ДГПЖ, в то время как в группе РПЖ Т3-4 аналогичный показатель, наоборот, увеличивался на 10%.

Таким образом, суммарное изменение экспрессии гена IL10 между группами больных РПЖ Т1-2 и РПЖ Т3-4 достигает 40%, что позволяет дифференцировать эти стадии развития патологического процесса с высокой достоверностью.

Показатели величин относительной экспрессии изученных в исследовании маркеров не проявили достоверной корреляции с ПСА и поэтому они могут быть эффективно использованы в качестве независимых маркеров для повышения достоверности диагностики РПЖ. При комплексном использовании изменения величины транскрипционной активности генов ТР53, GSTP1 и IL10 при дискриминации групп ДГПЖ и РПЖ Т1-2 специфичность составляет 90% и чувствительность 93% соответственно [Алексеева М. и др. Онкомаркеры, их характеристика и некоторые аспекты клинико-диагностического использования (обзор литературы). Проблемы репродукции 2005; 3: 65-78].

Первичную обработку данных ПЦР-РВ анализа проводили с помощью программного обеспечения "Bio-Rad CFX-Manager" ver. 2.1. Оценку уровня экспрессии генов относительно аналогичных показателей контроля рассчитывали по методу 2-ΔΔCt Livak [Livak K., Schmittgen T. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods 2001; 25(4):402-408]. Для представления средних значений показателей транскрипционной активности рядов мы использовали такой показатель как «медиана». В статистическом анализе использовали непараметрические описательные статистики и критерии оценки достоверности различий несвязанных выборок. Для оценки достоверности отличий и корреляционного анализа полученных рядов мы применяли непараметрические критерии: U-критерий Манна-Уитни и коэффициент корреляции Спирмена соответственно [Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Мир 1998] с использованием программного пакета Statistica 6.1.

Использование предлагаемого способа позволяет эффективно диагностировать рак предстательной железы, в том числе при низких значениях ПСА. Способ прост в выполнении, позволяет существенно снизить количество необоснованных биопсий предстательной железы, соответственно снижает экономические затраты на их проведение. Достоверность заявляемого способа составила 95%. Стоимость проведения исследования согласно заявляемому способу составила две тысячи рублей на одного пациента. Способ позволяет дифференцировать малые формы РПЖ от местнораспространенных, что позволяет начать своевременную и адекватную терапию.

Предлагаемый способ не требует штата специально обученного персонала, проводится в амбулаторных условиях и может быть широко внедрен в клиническую практику.

Способ дифференциальной диагностики рака предстательной железы путем исследования биологической жидкости больного, отличающийся тем, что в клетках периферической крови пациента методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени измеряют экспрессию генов Тр53, GSTP1 и IL10 относительно референтного гена β-актина (АСТВ) в клетках мононуклеарной фракции периферической крови и при величинах относительной экспрессии генов Тр53 больше 3,68×10, GSTP1 больше 3,73×10 и IL10 меньше величины 4,32×10 диагностируют рак предстательной железы, если величина относительной экспрессии гена Тр53 меньше 3,68×10, GSTP1 меньше 3,73×10 и IL10 больше 4,32×10 - диагностируют доброкачественную гиперплазию предстательной железы.
Источник поступления информации: Роспатент

Показаны записи 1-10 из 19.
20.09.2013
№216.012.6a14

Способ комплексной диагностики заболеваний нижних мочевыводящих путей и окружающих тканей у мужчин

Изобретение относится к медицине, урологии, и может быть использовано для выявления стриктур и облитерации уретры, их локализации, протяженности, выраженности, а также патологических изменений окружающих тканей. Выполняют МРТ этой области, выбирая область сканирования в сагиттальной проекции...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002492807
Дата охранного документа: 20.09.2013
20.11.2013
№216.012.8150

Способ низведения яичка при абдоминальной ретенции после пересечения тестикулярных сосудов

Изобретение относится к медицине, а именно к урологии, и касается способов хирургического лечения крипторхизма. Сущность изобретения: производят разрез кожи ипсилатеральной половины мошонки, через который осуществляют мобилизацию влагалищного отростка брюшины на всем его протяжении до...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002498780
Дата охранного документа: 20.11.2013
13.01.2017
№217.015.79f5

Способ прогнозирования развития острой почечной недостаточности по уровню экспрессии генов casp3, casp8 и casp9 после кратковременной ишемии почки

Изобретение относится к области медицины, в частности к молекулярной биологии и онкологии, и предназначено для прогнозирования развития острой почечной недостаточности (ОПН) после кратковременной ишемии почки. Из тканевых проб почки до ишемии выделяют тотальную РНК, получают кДНК, осуществляют...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002599099
Дата охранного документа: 10.10.2016
13.01.2017
№217.015.8f9d

Способ прогнозирования рецидивов рака тела матки на основании уровня экспрессии генов pten и cyp1b1

Изобретение относится к молекулярной биологии. Способ включает: экстракцию препаратов суммарной РНК, получение комплементарной ДНК с помощью реакции обратной транскрипции на РНК-матрице и последующую амплификацию в режиме реального времени с использованием высокоспецифичных праймеров для генов...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002605302
Дата охранного документа: 20.12.2016
13.01.2017
№217.015.9112

Способ прогнозирования риска развития биохимического рецидива у больных раком предстательной железы после гормонолучевой терапии

Изобретение относится к области медицины и найдет применение в онкоурологии, в частности, при лечении рака предстательной железы для прогнозирования риска развития биохимического рецидива у больных. Сущность способа: в ядрах эпителиальных клеток предстательной железы иммуногистохимическим...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002605838
Дата охранного документа: 27.12.2016
25.08.2017
№217.015.a2e2

Способ отбора пациентов с сахарным диабетом 2 типа в группу риска по развитию эндотелиальной дисфункции

Изобретение относится к медицине, а именно к эндокринологии, и может быть использовано для отбора пациентов с сахарным диабетом 2 типа в группу риска по развитию эндотелиальной дисфункции. Проводят пробу с реактивной гиперемией у мужчин. Осуществляют оценку времени наступления максимальной...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002607187
Дата охранного документа: 10.01.2017
25.08.2017
№217.015.a8c7

Способ прогнозирования выживаемости больных раком тела матки на основании уровня экспрессии гена esr1

Изобретение относится к области медицины, в частности к молекулярной онкологии, и предназначено для прогнозирования выживаемости больных раком тела матки на основании уровня экспрессии гена ESR1. Осуществляют выделение тотальной РНК из тканевых проб матки с помощью метода...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002611352
Дата охранного документа: 21.02.2017
25.08.2017
№217.015.ac50

Способ лечения местнораспространённого нерезектабельного рака пищевода

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для лечения местнораспространенного нерезектабельного рака пищевода. Для этого больным в условиях процедурного кабинета после обработки кожи передней грудной стенки раствором антисептика вводят внутрикожно по 0,3...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002612090
Дата охранного документа: 02.03.2017
25.08.2017
№217.015.b0fe

Способ дифференциальной диагностики рака желудка различных гистологических типов

Изобретение относится к области молекулярной онкологии и может быть использовано для дифференциальной диагностики рака желудка различных гистологических типов. Способ включает получение ДНК, выделенной из биопсийного материала; амплификацию фрагментов локусов GSTP1, NFKB1 и HV2 методом...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002613139
Дата охранного документа: 15.03.2017
25.08.2017
№217.015.b1e1

Способ прогнозирования метастазирования при раке ободочной кишки

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано в прогнозировании течения опухолевого процесса при раке ободочной кишки без отдаленных метастазов для индивидуализации и выбора оптимальной тактики лечения. Сущность и новизна изобретения заключаются в том, что до...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002613142
Дата охранного документа: 15.03.2017
Показаны записи 1-10 из 37.
20.09.2013
№216.012.6a14

Способ комплексной диагностики заболеваний нижних мочевыводящих путей и окружающих тканей у мужчин

Изобретение относится к медицине, урологии, и может быть использовано для выявления стриктур и облитерации уретры, их локализации, протяженности, выраженности, а также патологических изменений окружающих тканей. Выполняют МРТ этой области, выбирая область сканирования в сагиттальной проекции...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002492807
Дата охранного документа: 20.09.2013
20.11.2013
№216.012.8150

Способ низведения яичка при абдоминальной ретенции после пересечения тестикулярных сосудов

Изобретение относится к медицине, а именно к урологии, и касается способов хирургического лечения крипторхизма. Сущность изобретения: производят разрез кожи ипсилатеральной половины мошонки, через который осуществляют мобилизацию влагалищного отростка брюшины на всем его протяжении до...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002498780
Дата охранного документа: 20.11.2013
13.01.2017
№217.015.79f5

Способ прогнозирования развития острой почечной недостаточности по уровню экспрессии генов casp3, casp8 и casp9 после кратковременной ишемии почки

Изобретение относится к области медицины, в частности к молекулярной биологии и онкологии, и предназначено для прогнозирования развития острой почечной недостаточности (ОПН) после кратковременной ишемии почки. Из тканевых проб почки до ишемии выделяют тотальную РНК, получают кДНК, осуществляют...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002599099
Дата охранного документа: 10.10.2016
13.01.2017
№217.015.8f9d

Способ прогнозирования рецидивов рака тела матки на основании уровня экспрессии генов pten и cyp1b1

Изобретение относится к молекулярной биологии. Способ включает: экстракцию препаратов суммарной РНК, получение комплементарной ДНК с помощью реакции обратной транскрипции на РНК-матрице и последующую амплификацию в режиме реального времени с использованием высокоспецифичных праймеров для генов...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002605302
Дата охранного документа: 20.12.2016
13.01.2017
№217.015.9112

Способ прогнозирования риска развития биохимического рецидива у больных раком предстательной железы после гормонолучевой терапии

Изобретение относится к области медицины и найдет применение в онкоурологии, в частности, при лечении рака предстательной железы для прогнозирования риска развития биохимического рецидива у больных. Сущность способа: в ядрах эпителиальных клеток предстательной железы иммуногистохимическим...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002605838
Дата охранного документа: 27.12.2016
25.08.2017
№217.015.a2e2

Способ отбора пациентов с сахарным диабетом 2 типа в группу риска по развитию эндотелиальной дисфункции

Изобретение относится к медицине, а именно к эндокринологии, и может быть использовано для отбора пациентов с сахарным диабетом 2 типа в группу риска по развитию эндотелиальной дисфункции. Проводят пробу с реактивной гиперемией у мужчин. Осуществляют оценку времени наступления максимальной...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002607187
Дата охранного документа: 10.01.2017
25.08.2017
№217.015.a8c7

Способ прогнозирования выживаемости больных раком тела матки на основании уровня экспрессии гена esr1

Изобретение относится к области медицины, в частности к молекулярной онкологии, и предназначено для прогнозирования выживаемости больных раком тела матки на основании уровня экспрессии гена ESR1. Осуществляют выделение тотальной РНК из тканевых проб матки с помощью метода...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002611352
Дата охранного документа: 21.02.2017
25.08.2017
№217.015.ac50

Способ лечения местнораспространённого нерезектабельного рака пищевода

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для лечения местнораспространенного нерезектабельного рака пищевода. Для этого больным в условиях процедурного кабинета после обработки кожи передней грудной стенки раствором антисептика вводят внутрикожно по 0,3...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002612090
Дата охранного документа: 02.03.2017
25.08.2017
№217.015.b0fe

Способ дифференциальной диагностики рака желудка различных гистологических типов

Изобретение относится к области молекулярной онкологии и может быть использовано для дифференциальной диагностики рака желудка различных гистологических типов. Способ включает получение ДНК, выделенной из биопсийного материала; амплификацию фрагментов локусов GSTP1, NFKB1 и HV2 методом...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002613139
Дата охранного документа: 15.03.2017
25.08.2017
№217.015.b1e1

Способ прогнозирования метастазирования при раке ободочной кишки

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано в прогнозировании течения опухолевого процесса при раке ободочной кишки без отдаленных метастазов для индивидуализации и выбора оптимальной тактики лечения. Сущность и новизна изобретения заключаются в том, что до...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002613142
Дата охранного документа: 15.03.2017
+ добавить свой РИД