Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕФЕРЕНС-ПАНЕЛИ ОБРАЗЦОВ СЫВОРОТОК, ПРЕДНАЗНАЧЕННОЙ ДЛЯ ОЦЕНКИ СПЕЦИФИЧНОСТИ РЕЗУЛЬТАТОВ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ СОЦИАЛЬНО ЗНАЧИМЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Способ получения референс-панели образцов сывороток, предназначенной для оценки специфичности результатов серологической диагностики социально значимых заболеваний

Изобретение относится к технологии изготовления референс-препаратов для оценки специфичности результатов серологической диагностики и может быть использовано в медицине и биотехнологии.

Разработка референс-материалов, содержащих известные количества специфических маркеров социально значимых инфекций, имеет наивысший приоритет для контроля качества лабораторной клинической диагностики. В докладе экспертов Комитета ВОЗ по биологической стандартизации, посвященном оценке качества наборов для диагностики гепатитов В и С (ВГВ и ВГС) [1], было детально описано текущее состояние разработок и эффективности применения профильных референс-панелей, проблемы их сертификации и серийного контроля. Отмечено отсутствие научно обоснованных критериев при формировании референс панелей для контроля специфичности результатов серологической диагностики. Отсутствие критериев препятствует сертификации таких панелей в качестве международных стандартов.

Ранее референс-панели формировались по принципу пригодности для оценки чувствительности клинической диагностики отдельного патогена. Основная часть такой панели составлена из реактивных к антигенам инфекционного возбудителя образцов. Например, известен способ формирования референс-панелей для оценки чувствительности клинических исследований отдельно к антигенам вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), ВГВ и ВГС [2] которые изготавливает известная фирма-производитель Boston Biomedica Inc. (BBI), США. Панели BBI сформированы из сывороток, сероположительных к основным белкам HIV-I или ВГС (или содержащих поверхностный антиген HBsAg ВГВ) и имеющих разную концентрацию аналита в образцах.

Эти панели не позволяют контролировать специфичность серодиагностики, т.к. составлены на 80-90% из положительных образцов и содержат только 2-3 отрицательных образца.

Панель для контроля специфичности необходимо на 50-90% формировать из образцов сывороток или плазмы здоровых доноров. Все образцы панели нужно предварительно охарактеризовать минимум по 14 серологическим, биохимическим и молекулярно-биологическим параметрам.

Чтобы использовать референс-панель в качестве национального стандарта, ее состав должен обеспечивать возможность контроля специфичности лабораторной диагностики образцов с содержанием аутоиммунных и человеческих антимышиных антител (НАМА), предупреждать появление ложноположительных результатов вследствие эффектов матрикса и кроссреакций с гомологами аминокислотного сиквенса.

Ввиду отсутствия нормативных требований к референс-панелям, они различаются по количеству и составу образцов. Но как наиболее стабильной субстанции, предпочтение отдано образцам в форме сыворотки крови человека. В качестве одного из аналогов заявляемого технического решения является способ изготовления из плазмы крови референс-сывороток (патент США №4121905, МПК G01N 33/96, опубл. 24.10.1978 г.) [3].

Другим наиболее близким аналогом (прототипом) является также

способ изготовления из плазмы крови референс-сывороток (патент США №4158544, МПК G01N 33/96, опубл. 19.06.1979 г.) [4]. В этих патентах описаны процессы переработки плазмы в дефибринированную сыворотку и изготовления из нее контрольных образцов, стабилизированных добавкой 3-5 алкилен полиолов. Такие композиции сохраняют свои специфические характеристики в течение 4-5 недель при температуре хранения от 2 до 8°C.

Основным их недостатком является введение от 15 до 40% алкилен полиола для повышения стабильности. Добавки органического вещества значительно изменяют вязкость образца и скорости химических реакций, лежащих в основе серологического метода диагностики, что искажает результаты анализа.

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание такого способа получения референс-панели образцов сывороток, который обеспечивал бы более надежный контроль специфичности серологической диагностики социально значимых заболеваний и стабильность специфических характеристик всех образцов панели в течение длительного времени (не менее 18 месяцев) при температуре хранения от 2 до 8°C.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения референс-панели образцов сывороток, предназначенной для оценки специфичности результатов серологической диагностики социально значимых заболеваний, регламентируется: исследование образцов доноров и пациентов на наличие инфекционного материала; отбор для отрицательной части референс-панели образцов, не содержащих антитела к ВГС, HBsAg ВГВ, раннего белка р24 и антител к ВИЧ, а также антитела к Т. Pallidum; отбор для положительной части референс-панели образцов, содержащих антитела к ВИЧ, ВГС, HBsAg и Treponema pallidum, и введение в отобранные образцы стабилизирующего состава, согласно изобретению исследование донорского материала на наличие инфекционных маркеров проводят методами полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и подтверждающими серологическими тестами (иммуноблот, РИБА, СПЕКТР).

При формировании референс-панели сывороток отбирают 14 исследованных образцов здоровых доноров, 2 исследованных образца от здоровых беременных женщин и 2 исследованных образца от больных аутоиммунными заболеваниями с содержанием аутоиммунных антител, а также 4 исследованных образца, содержащих по отдельности HBsAg -поверхностный антиген ВГВ, антитела к ВИЧ, ВГС и Т. pallidum.

Стабилизирующий состав образцов референс-панели сывороток содержит пролин, аргинин, сахарозу, этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) и бактерицидную добавку при следующем содержании указанных компонентов в сыворотке:

Приготовленные образцы в референс-панели высушивают до остаточной влажности менее 2,0 мас.% путем лиофилизации.

В качестве бактерицидной добавки стабилизирующий состав содержит мертиолят? или гентамицин, или их смесь в равных соотношениях.

Создание референс-панелей, содержащих отрицательные сыворотки и контрольные сыворотки с инфекционными маркерами? облегчает задачу контроля качества диагностики инфекционных маркеров и GLP-валидацию наборов реагентов, контроль качества иммуногенов и контроль кандидатных вакцин.

Способ получения референс-панели образцов сывороток, предназначенной для оценки специфичности результатов серологической диагностики социально значимых заболеваний, осуществляют следующим образом. Способ включает два этапа: изготовление и аттестация сывороток из плазмы крови, а также формирование панели контроля специфичности из аттестованных кандидатов сывороток. Переработка цитратной плазмы в сыворотку. Цитратную плазму заготавливают методом плазмафереза (в количестве 500 мл в неделю от одного донора) и далее:

(a) добавляют хлорид кальция и тщательно перемешивают для получения безцитратной плазмы;

(b) добавляют тромбин к безцитратной плазме и тщательно перемешивают для получения плотного сгустка фибрина;

(c) выполняют 1-3 цикла замораживания - оттаивания для уплотнения сгустка;

(d) инактивация сывороток здоровых доноров путем прогревания при температуре 56°C в течение не менее 3-х часов;

(e) добавление к полученной сыворотке стабилизирующего состава, представленного в примерах 1-3 и не влияющего на вязкость сыворотки;

(f) удаление центрифугированием осадка для получения образцов отрицательной сыворотки;

Пример 1. Стабилизирующий состав.

Пример 2. Стабилизирующий состав.

Пример 3. Стабилизирующий состав.

Далее свойства стабилизированных сывороток аттестуют по иммунохимическим и биохимическим показателям. Все сыворотки-кандидаты тестируют методом ПЦР на наличие РНК или ДНК ВИЧ, ВГВ, ВГС и Т. pallidum. Все кандидаты показали отрицательный результат.

Перечисленные процедуры или их комбинация должны обеспечить стабильность референс-препаратов на длительный срок, и сохранение специфических свойств в течение времени годности.

На втором этапе из сывороток-кандидатов формируют референс-панель.

Практика использования такой панели в ИФА (96 лунок) определяет оптимальное количество образцов панели - 24 образца. Структура панели включает:

1. Сыворотки доноров или здоровых лиц - 16.

2. Сыворотки неинфицированных беременных - 2.

3. Сыворотки с РФ и аутоиммунными антителами - 2

4. Сыворотка с анти-ВИЧ антителами - 1.

5. Сыворотка с анти-ВГС антителами - 1.

6. Сыворотка с HBsAg - 1.

7. Сыворотка с антипаллидум антителами - 1.

Включение в состав панели сывороток, содержащих реактивные антитела, необходимо для контроля активности специфических антигенов тест-системы, и для выявления кроссреакций.

Срок годности референс-панели определяют тестом ускоренного определения термостабильности. Стабилизированные образцы панели проходят проверку и при длительном хранении при температуре от 2 до 8°C. Введение аминокислот в выше приведенном количестве (примеры 1-3) не изменяет вязкость сывороток.

Дополнительно в соответствии с параметрами технологии изготовления панели сывороток лиофильно высушивают до остаточной влажности не более 2,0 мас.% (хранят при температуре от 2 до 8°C) или используют в жидкой форме (хранят образцы панели при температуре ниже минус 24°C). Конкретный пример получения референс-панели сывороток для контроля специфичности.

Забор образцов плазмы доноров. Плазма анонимных и персонифицированных доноров поступает на производство в гемаконах CPDA емкостью 250 мл, герметично укупоренных.

Каждый образец плазмы, поступающий на производство для изготовления панели, должен иметь паспорт с характеристиками - ИН (индивидуальный номер) донора, объем сыворотки, дату забора крови, предприятие-изготовитель, а также отвечать следующим требованиям: без признаков гемолиза и гиперлипидиемии, прозрачная, цвет - янтарный или светло-желтый. Посторонние механические примеси, взвесь, осадок отсутствуют.

Трансформация плазмы в сыворотку. Технология конвертации плазмы в сыворотку выполняется в строгом соответствии с лабораторной методикой. Из гемакона 250 мл приготавливают 120 мл дефибрированной сыворотки. Сыворотки должны отвечать следующим требованиям: без признаков гемолиза и гиперлипидиемии, прозрачная, цвет - янтарный или светло-желтый, посторонние механические примеси, взвесь, осадок отсутствуют.

Инактивация сывороток здоровых доноров. Флаконы с донорской сывороткой помещают в термостат при температуре 56°C. Фиксируют время начала инактивации. Инкубирование сыворотки проводят 3 часа. После истечения этого времени сыворотку достают из термостата, фиксируют время окончания инактивации. Дату инактивации регистрируют в «Журнале регистрации движения материала».

Для длительного хранения перед использованием сыворотки хранят в морозильной камере Medical freezer MDF 436 (Sanyo), при -35°C. Это обеспечивает сохранение свойств сывороток в течение 5-7 лет.

В каждый флакон с донорской сывороткой добавляют стабилизирующий состав по примеру 1:

Относительная скорость истечения стабилизированного образца сыворотки не превышает скорости истечения сыворотки без добавления стабилизатора более 1, 2 раза.

Фасовка сывороток доноров. Из каждого гемакона в стерильном боксе автоматической пипеткой отбирают 5 аликвот по (0,5±0,05) мл сыворотки в пластиковые пробирки «Эппендорф» емкостью 1,5 мл для контроля биохимических показателей и для исследования вирусных маркеров в ПЦР и ИФА. Пробирки закрывают, на каждой пробирке маркером пишут кодовый номер образца сыворотки. Сыворотки, не соответствующие физиологической нормам по биохимическим показателям, отбраковывают и утилизируют.

Оставшийся объем сыворотки фасуют в стерильные пластиковые флаконы емкостью 10 мл и передают в Коллекцию.

Формирование панели. Для формирования панели из Коллекции набирают сыворотки здоровых доноров, сыворотки беременных, с аутоиммунными антителами и сыворотки, реактивные на антигены T. pallidum, ВИЧ, ВГС и HBsAg ВГВ по описанной выше процедуре. Объем забора составляет 20 мл. Для рабочей модели панели отобрали 33 образца.

Контроль кандидатных сывороток в ПЦР и ИФА. Аликвоту каждой сыворотки-кандидата передают в ИФА лабораторию для исследования сывороток на содержание HBs антигена, антител к T. pallidum, ВГС, ВИЧ-1,2 типов и анти-HBs, анти-НВс, анти-НВе антител. ИФА анализ выполняли на зарегистрированных в РФ в качестве медицинских изделий наборах реагентов для иммуноферментной диагностики. Все сыворотки-кандидаты протестировали методом ПЦР на наличие РНК или ДНК ВИЧ, ВГВ, T. pallidum и ВГС. Все кандидаты показали отрицательный результат.

По результатам тестирования в ИФА и ПЦР из 33 кандидатов отобрали 24 образца, которые включают донорские сыворотки, сыворотки с аутоиммунными антителами и беременных (Таблица 1).

Розлив и лиофильная сушка. Каждый образец разливали по 0,4 мл во флаконы R2, коэффициент вариации погрешности розлива не превышал 0,2%. Флаконы в кассетах загружают на ночь в морозильник -60°C. Утром замороженные флаконы размещают равномерно на полках лиофильной камеры, предварительно охлажденных до минус 35°C. При этой температуре образцы в лиофильной камере выдерживают более 3-х час. В течение 3-х часов вакуум достигает своего минимума, и включается программа нагрева полок от -35°C до +20°C в течение 20-ти часов.

На заключительной стадии при комнатной температуре образцы досушивают с откачкой в течение 6-ти часов. Затем опускают прижимные плиты и запрессовывают пробки во флаконы. Флаконы удаляют из лиофильной камеры, закатывают алюминиевыми колпачками и размещают в хранилище при -20°C.

Комментарии. При аттестации панели использовали следующие наборы:

VB-БЕСТ анти-ВГС-СПЕКТР, серия 2024, годен до 05.2011 ОПкрит=0,206

Vector-Вектор ИФА ВГС-АТ спектр, экспериментальная серия 5, годен до 10.2010, ОПкрит=0,275

DS36-ДС-ИФА-АНТИ-HCV-СПЕКТР-GM, серия 36, ОПкрит=0,236

VBg-БЕСТ анти-ВГС - СПЕКТР, серия 2117, годен до 01.2011, ОПкрит=0,204

DS49-ДС-ИФА-АНТИ-HCV-СПЕКТР-GM, серия 49, ОПкрит=0,230

DS-55-ДС-ИФА-АНТИ-HCV-СПЕКТР-GM, серия 55, ОПкрит=0,250

MBU-Мелиса ВГС-ДСМ, ОПкрит=0,260

HBsAg-ИФА-БЕСТ, с.33, 24.07.2013

КомбиБест ВИЧ-1,2 АГ/АТ, серия 1298, годен до 18.01.2013

MBU-T.P.-СИФ-ДСМ-суммарный (ЗАО МБС)

ПЦР-анализ ВЕС-РеалБест РНК ВГС, кат.№D-0799

ПЦР-анализ ВЕВ-РеалБест ВГВ ПЦР, кат.№D-0596

ПЦР-анализ ВИЧ-РеалБест ВИЧ ПЦР, кат.№D-0195

ПЦР-анализ T. pallidum - «АмплиСенс® Treponema pallidum-FL», кат. №TB20-100-R0,2.

Испытания стабильности. Стабильность образцов панели в различных условиях хранения в темноте во флаконах определяли по результатам теста термодеградации при температурах: -20°C, +4°C, +37°C и 50°C.

Объединенную выборку лиофилизованных образцов панели контроля специфичности исследуют в тесте ускоренной термодеградации. Образцы выдерживают в условиях контролируемой температуры, извлекают через определенные промежутки времени, растворяют в очищенной воде и анализируют в дублях скрининговыми и подтверждающими методами.

В испытаниях при -20°C не отмечены экспериментально значимые потери титров антител. Средние величины рассчитанных процентов потери активности при других температурах за месяц и за год приведены в Таблице 2. Образцы демонстрируют высокую стабильность. Предсказываемая потеря активности за год при +4°C составляет 0.4%.

По результатам таблицы 2 рекомендуется использовать регидратированные образцы панели после хранения при 4°C в течение 1 недели. Стабильность жидких образцов панели испытывали в тесте замораживание - оттаивание. Результаты испытаний показали, что специфические свойства кандидатов не изменяются в течение 3-х циклов замораживания - оттаивания.

Предсказанная потеря активности за месяц составляет примерно 1,5% при температуре хранения 37°C, что позволяет кратковременно хранить сыворотки панели при повышенных температурах, например, при транспортировке панели.

Лиофильно высушенные сыворотки панели сохраняют свои специфические характеристики более 2-х лет при температуре хранения 4°C.

Основная предназначение референс-панели - это использование ее для ежедневного и длительного мониторинга качества серологических исследований в клинических диагностических лабораторях (КДЛ). Правильное использование панели как контрольного средства мониторинга качества предполагает ежедневную фиксацию результатов серодиагностики образцов панели с последующей валидацией всех суточных результатов анализов по критерию «специфичность» при условии совпадения результатов по панели с ее паспортными данными [5].

В качестве меры дальнейшего повышения качества клинической лабораторной диагностики предлагается совершенствование панели на основе накопления, сравнения и анализа в уполномоченном национальном органе результатов рутинного применения референс-панели. Задача чрезвычайно усложнена отсутствием международных стандартов. Она может быть решена на национальном уровне при условии параллельного контроля специфичности той же референс-панелью серийно выпускаемых медицинских изделий, зарегистрированных в качестве диагностикумов социально значимых инфекций.

Источники информации

1. WHO Working group. The international reference preparations for testing diagnostic kits used for the detection of HBsAg and anti-HCV antibodies. (WHO Headquarters, Geneva, 6-7 October 2003).

2. BBI product catalog 2003/2004. Quality control products for infectious disease testing. BBI, Boston, USA.

3. Патент США №4121905, МПК G01N 33/96, опубл. 24.10.1978 г.

4. Патент США №4158544, МПК G01N 33/96, опубл. 19.06.1979 г. (прототип).

5. Kirkwood T.B.L Принципы приготовления и утверждения международных и других стандартов и эталонных материалов биологических препаратов. Сер. техн. докл. N37. ВОЗ, Женева, 1990. 14а // J. biol. Standardization.- 1984.- Vol.12. - P.207-224.