Результат интеллектуальной деятельности: ЖИДКИЕ ПРЕПАРАТИВНЫЕ ФОРМЫ ДЛЯ ДЛИТЕЛЬНО ДЕЙСТВУЮЩЕГО КОНЪЮГАТА G-CSF

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к жидкой препаративной форме для обеспечения стабильности при длительном хранении длительно действующего конъюгата G-CSF, в котором G-CSF, непептидный полимер и фрагмент иммуноглобулина Fc ковалентно связаны и который проявляет увеличенную продолжительность действия по сравнению с диким типом.

Предшествующий уровень техники

Фактор, стимулирующий колонии гранулоцитов (G-CSF), представляет собой цитокин, который стимулирует стволовые клетки костного мозга и лейкоциты для индукции их дифференциации и пролиферации. Он представляет собой гликопротеин с молекулярной массой в диапазоне от 18000 до 19000 Да с pI 6,1 (5,5-6,1 в зависимости от степени гликозилирования (Nomura et al., EMBO J. 5(5): 871-876, 1986).

Технология рекомбинантной ДНК выявила молекулярные и генетические свойства G-CSF (Clark и Kamen, Science, 236:1229-1237, 1987). Со времени клонирования гена человеческого G-CSF из библиотек кДНК, сконструированных мРНК, выделенных из клеточных линий CHU-2 и карциномы мочевого пузыря человека 5637 (Nagata et al., Nature, 319: 415-418, 1986; Nagata et al., EMBO J., 5(3): 575-581, 1986; Souza et al., Science, 232: 61-65, 1986), технология рекомбинантной РНК обеспечила возможность получения G-CSF из клеток млекопитающих и прокариоцитов. Кроме того, заявители обнаружили, что модифицированный hG-CSF, который отличается от дикого типа тем, что, по меньшей мере, один аминокислотный остаток, в частности цистеиновый остаток в положении 17, замещенный другим аминокислотным остатком, может в большом масштабе секретироваться на его N-конце в периплазму в форме, свободной от метиониновых остатков (патент Кореи № 10-356140).

Поскольку полипептиды имеют тенденцию легко денатурироваться вследствие их низкой стабильности, разрушаться протеолитическими ферментами в крови и легко проходить через почки или печень, то белковые лекарственные препараты, включая полипептиды в качестве фармацевтически эффективных компонентов, должны часто вводиться пациентам для поддержания желательного уровня концентраций и титров в крови. Однако данное частое введение белковых лекарственных препаратов, в частности, путем инъекции вызывает у пациентов боль.

Для разрешения указанных проблем было приложено много усилий для повышения стабильности в сыворотке крови белковых лекарственных средств и поддержания высоких уровней лекарственных средств в крови в течение продолжительного периода времени и, таким образом, максимизации фармацевтической эффективности лекарственных средств. Для применения в препаративных формах длительного действия белковые лекарственные средства должны составляться для наличия высокой стабильности и иметь свои титры, поддерживаемые на достаточно высоких уровнях без вызова иммунных ответов у пациентов.

Для стабилизации белков и предотвращения ферментного разрушения и расщепления почками полимер, имеющий высокую растворимость, такой как полиэтиленгликоль (PEG), обычно использовали для модификации поверхности белкового лекарственного средства. Путем связывания с определенными или различными областями белка-мишени, PEG стабилизирует белок и предотвращает гидролиз, не вызывая тяжелых побочных эффектов (Sada et al., J. Fermentation Bioengineering 71:137-139, 1991). Однако несмотря на способность увеличивать стабильность белка пегилирование имеет такие проблемы, как значительное снижение титров физиологически активных белков. Кроме того, уменьшается выход с увеличением молекулярной массы PEG вследствие сниженной реактивности белков.

Альтернативным способом повышения стабильности in vivo физиологически активных белков является связывание гена физиологически активного белка с геном, кодирующим белок, имеющий высокую стабильность в сыворотке крови, технологией генетической рекомбинации и культивированием клеток, трансфицированных рекомбинантным геном, для получения слитого белка. Например, слитый белок может быть получен конъюгацией альбумина, белка, который, как известно, наиболее эффективен при повышении стабильности белка, или его фрагмента с представляющим интерес физиологически активным белком путем генетической рекомбинации (Публикации PCT №№ WO 93/15199 и WO 93/15200, Публикация Европейского патента № 413622).

Другим способом является применение иммуноглобулина. Как описано в патенте США № 5045312, человеческий гормон роста конъюгируется с бычьим сывороточным альбумином или мышиным иммуноглобулином путем применения поперечно сшивающего агента. Конъюгаты имеют повышенную стабильность по сравнению с немодифицированным гормоном роста. Карбодиимид или глутаральдегид используется в качестве поперечно сшивающего агента. Однако неспецифическое связывание с пептидами, такими как поперечно сшивающие агенты с низкой молекулярной массой, не обеспечивают возможности образования однородных конъюгатов и являются даже токсичными in vivo. Кроме того, в патенте показано усиление активности только благодаря химическому связыванию с гормоном роста. Способ по патенту не может гарантировать усиление активности различным видам полипептидных лекарственных средств, так что в патенте не распознаются даже факторы, связанные со стабильностью белков, такие как длительность, период полувыведения из крови и т.д.

Недавно была предложена лекарственная препаративная форма, которая представляет собой длительно действующую белковую лекарственную препаративную форму и с улучшенной длительностью действия in vivo и стабильностью. Для применения в длительно действующей лекарственной препаративной форме белковый конъюгат получают ковалентным связыванием физиологически активного полипептида, неполипептидного полимера и фрагмента Fc иммуноглобулина (патенты Кореи № 10-0567902 и 10-0725315).

В данном способе G-CSF может использоваться в качестве физиологически активного для получения длительно действующего конъюгата G-CSF. Для применения длительно действующих конъюгатов в лекарственных продуктах необходимо поддерживать их фармацевтическую эффективность in vivo, в то же время ограничивая физико-химические изменения, такие как вызванную светом, теплом или добавками дегенерацию, агрегацию, абсорбцию или гидролиз во время хранения и транспортировки. Длительно действующие конъюгаты G-CSF труднее стабилизировать, чем сам полипептид G-CSF, потому что они увеличены в объеме и молекулярной массе.

В целом, белки имеют очень короткий период полураспада, и при воздействии неподходящих температур, границ раздела воды-воздуха, высоких уровней давления, физического/механического стресса, органических растворителей, микробного заражения и т.д. они подвергаются такой дегенерации, как агрегация мономеров, осаждение агрегацией и адсорбция на поверхность контейнеров. При дегенерации белки теряют свои физико-химические свойства и физиологическую активность. После дегенерации белки почти не могут восстановить свои первоначальные свойства, потому что дегенерация является необратимой. В частности, в случае белков, которые вводятся в следовых количествах, составляющих сотни микрограмм на инъекцию, таких как G-CSF, когда они теряют стабильность и, таким образом, абсорбируются на поверхность контейнера, это приводит к относительно большой степени повреждения. Кроме того, абсорбированные белки легко агрегируются во время процесса дегенерации, и дегенерированные белки при введении в организм действуют в качестве антигенов в отличие от белков, синтезированных in vivo. Таким образом, белки должны вводиться в стабильной форме. Было проведено много исследований для предотвращения дегенерации белков в растворах (John Geigert, J. Parenteral Sci. Tech., 43(5): 220-224, 1989; David Wong, Pharm. Tech., 34-48, 1997; Wei Wang., Int. J. Pharm., 185: 129-188, 1999; Willem Norde, Adv. Colloid Interface Sci., 25: 267-340, 1986; Michelle et. Al., Int. J. Pharm. 120: 179-188, 1995).

Лиофилизация применяется в отношении некоторых белковых лекарственных средств для достижения цели стабильности. Однако лиофилизированные продукты неудобны в том, что их необходимо повторно растворять в воде для инъекций для применения. Кроме того, они требуют обширных инвестиций в лиофилизаторы большой емкости, потому что процесс лиофилизации включен в способ их производства. Было предложено «притирание» белков путем применения распылительной сушилки. Однако этот способ является экономически неблагоприятным вследствие низкой производительности. Кроме того, процесс распылительной сушки подвергает белки воздействию высоких температур, таким образом оказывая негативные влияния на стабильность белков.

В качестве альтернативы для преодоления ограничений появились стабилизаторы, которые при добавлении к белкам в растворе могут сдерживать физико-химические изменения белковых лекарственных средств и поддерживать фармацевтическую эффективность in vivo даже после хранения в течение длительного периода времени. Среди них имеются углеводороды, аминокислоты, белки поверхностно-активные вещества (ПАВ), полимеры и соли. Наряду с другими стабилизаторами человеческий сывороточный альбумин широко использовался в качестве стабилизатора для различных белковых лекарственных средств с подтверждением его эффективности (Edward Tarelli et al., Biologicals, 26: 331-346, 1998).

Типичный способ очистки для человеческого сывороточного альбумина включает инактивацию биологических загрязняющих агентов, таких как микоплазма, прионы, бактерии и вирусы, или скрининг или исследование одного или более биологических загрязняющих агентов или патогенов. Однако всегда имеется риск того, что белки подвергаются воздействию биологических загрязняющих агентов, потому что они не полностью удаляются или инактивируются. Например, проводятся скрининговые исследования человеческой крови от доноров для выявления содержания в ней определенных вирусов. Однако этот способ не всегда надежен. В частности, невозможно выявить определенные вирусы, существующие в очень небольшом числе.

Недавно были предложены альтернативы человеческому сывороточному альбумину, включая рекомбинантный альбумин (выложенная публикация патента Кореи № 10-2004-0111351) и не содержащий альбумин G-CSF (патенты Кореи №№ 10-0560697 и 10-0596610).

Хотя при применении стабилизаторов, не содержащих альбумин, могут постепенно инактивироваться другие белки вследствие их химических различий, потому что они подвергаются воздействию различных соотношений и условий во время хранения. Воздействие стабилизатора на срок хранения белков отличатся от одного белка к другому. То есть различные стабилизаторы могут использоваться в различных соотношениях в зависимости от физико-химических свойств представляющих интерес белков.

Кроме того, различные стабилизаторы при одновременном применении могут вызвать обратные эффекты вследствие конкуренции и их неверной обработки. Комбинация различных стабилизаторов также вызывает различные эффекты, потому что они изменяют характеристики или концентрацию белков во время хранения. Поскольку каждый стабилизатор должным образом проявляет свою стабилизирующую активность в определенном диапазоне концентраций, то необходимо прикладывать много усилий для соблюдения предосторожностей при комбинации видов и концентраций различных стабилизаторов.

В частности, что касается длительно действующих конъюгатов G-CSF, которые имеют увеличенную длительность действия и повышенную стабильность, то их молекулярные массы и объемы совершенно отличаются от таковых обычных соединений G-CSF, потому что они составлены из физиологически активного пептида G-CSF и фрагмента Fc иммуноглобулина. Кроме того, стабильность фрагментов Fc иммуноглобулина высоко варьируются в зависимости от pH. Таким образом, обычные стабилизаторы не могут использоваться для G-CSF в чистом виде. Соответственно, для длительно действующих конъюгатов G-CSF требуются стабилизаторы с особыми композициями, отличающимися от композиций для стабилизаторов G-CSF.

При создании настоящего изобретения, интенсивные и тщательные исследования по разработке стабильной жидкой препаративной формы длительно действующих конъюгатов G-CSF, способной сохранять фармацевтическую эффективность в течение длительного срока без вирусной инфекции, привели к получению данных о том, что стабилизатор, содержащий буфер в определенном диапазоне pH и высокую концентрацию маннита, обеспечивает длительно действующим конъюгатам G-CSF повышенную стабильность и обеспечивает возможность образования экономичных и стабильных жидких препаративных форм длительно действующих конъюгатов G-CSF.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Техническая проблема

Поэтому целью настоящего изобретения является получение жидкой препаративной формы, содержащей длительно действующий конъюгат G-CSF, в котором ковалентно связаны G-CSF, непептидный полимер и фрагмент Fc иммуноглобулина, и лишенный альбумина стабилизатор, содержащий буфер и маннит.

Решение проблемы

В соответствии с одним вариантом его осуществления настоящее изобретение относится к жидкой препаративной форме, содержащей длительно действующий конъюгат G-CSF, в котором ковалентно связаны G-CSF, непептидный полимер и фрагмент Fc иммуноглобулина, и лишенный альбумина стабилизатор, составленный из буфера и маннита.

Используемый в настоящем описании термин «длительно действующий конъюгат G-CSF» предназначен для обозначения белкового конструкта, в котором ковалентно связаны физиологически активный G-CSF, один или более непептидных полимеров и один или более фрагментов Fc иммуноглобулина и который имеет большую длительность действия по сравнению с G-CSF в его натуральной форме.

Используемый в настоящем описании термин «длительно действующий» относится к увеличенной длительности действия по сравнению с длительностью действия натуральной формы. Термин «конъюгат» относится к конструкту, в котором ковалентно связаны G-CSF, непептидный полимер и фрагмент Fc иммуноглобулина.

Для применения в настоящем изобретении G-CSF имеет аминокислотную последовательность человеческого G-CSF или его близкого родственного аналога. G-CSF, используемый в настоящем изобретении, может представлять собой естественно встречающийся белок или рекомбинантный белок. Также G-CSF, используемый в настоящем изобретении, может представлять собой мутантный G-CSF, который был подвергнут вставке, делеции или добавлению аминокислот, при условии что мутация не оказывает значимого влияния на его первоначальную биологическую активность.

Человеческий G-CSF или его аналоги, используемые в настоящем изобретении, могут быть выделены из позвоночных или могут быть химически синтезированы. Альтернативно G-CSF или его аналоги могут быть получены из прокариотов или эукариотов, которые трансформированы геном, кодирующим G-CSF или его аналог, с применением технологии генетической рекомбинации. В этом отношении в качестве клеток-хозяев могут использоваться кишечные бактерии (например, E.coli), дрожжевые клетки (например, S. cerevisiae) или клетки млекопитающих (например, клетки яичников китайских хомячков (CHO), клетки обезьян). В зависимости от клеток-хозяев рекомбинантный G-CSF или его аналоги могут быть гликозилированы углеводородами млекопитающих или эукариотическими углеводородами или агликозилированы. При экспрессии рекомбинантный G-CSF или его аналоги могут содержать первоначальный остаток метионина (положение - 1). Предпочтительно рекомбинантный человеческий G-CSF (HuG-CSF) получают с применением клеток CHO в качестве хозяйских. Рекомбинантный человеческий G-CSF (HuG-CSF), полученный с применением E. coli в качестве клетки-хозяина, подходит для настоящего изобретения. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения рекомбинантный человеческий G-CSF представляет собой мутантный рекомбинантный человеческий (¹⁷Ser-G-CSF), в котором остаток серина располагался в положении 17, вместо цистеина для дикого типа и может быть экспрессирован, как описано в патенте Кореи № 10-356140.

Для применения в настоящем изобретении фрагмент Fc иммуноглобулина имеет аминокислотную последовательность фрагмента Fc человеческого иммуноглобулина или их близких родственных аналогов. Фрагменты Fc могут быть получены из нативных форм, выделенных из животных, включая ков, коз, свиней, мышей, кроликов, хомяков, крыс и морских свинок. Кроме того, фрагмент Fc иммуноглобулина может представлять собой фрагмент Fc, который получен из IgG, IgA, IgD, IgE и IgM или который получен их комбинациями или их гибридами. Предпочтительно он получен из IgG или IgM, которые являются наиболее обильными белками в крови человека, а наиболее предпочтительно, из IgG, который, как известно, увеличивает период полураспада связывающих лиганды белков. В настоящем изобретении фрагмент Fc иммуноглобулина может быть получен из нативного иммуноглобулина путем выделения цельных иммуноглобулинов из организмов людей или животных и их обработки протеолитическим ферментом или они могут представлять собой их рекомбинанты или производные, полученные из трансформированных клеток животных или микроорганизмов. Предпочтителен фрагмент Fc рекомбинантного человеческого иммуноглобулина, продуцируемый трансформантами E. coli.

С другой стороны, IgG делится на подклассы IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, и настоящее изобретение включает их комбинации и гибриды. Предпочтительными являются подклассы IgG2 и IgG4, и наиболее предпочтителен фрагмент Fc IgG4, редко имеющий эффекторные функции, такие как CDC (комплемент-зависимая цитотоксичность). То есть в качестве лекарственного носителя по настоящему изобретению наиболее предпочтительным фрагментом Fc иммуноглобулина является полученный из человеческого IgG4 гликозилированный фрагмент Fc. Фрагмент Fc человеческого происхождения предпочтительнее, чем Fc фрагмент не человеческого происхождения, который может действовать в качестве антигена в организме человека и вызвать нежелательные иммунные реакции, такие как выработка нового антитела против антигена.

Длительно действующий конъюгат G-CSF, используемый в настоящем изобретении, получен связыванием вместе G-CSF и фрагмента Fc иммуноглобулина. В этом отношении G-CSF и фрагмент Fc иммуноглобулина может быть поперечно сшит посредством непептидного полимера или может быть сформирован в слитый белок с применением рекомбинантной технологии.

Непептидный полимер для применения при поперечной сшивке может быть выбран из группы, состоящей из биоразлагаемых полимеров, липидных полимеров, хитинов, гиалуроновой кислоты и их комбинаций. Биоразлагаемый полимер может быть выбран из полиэтиленгликоля, сополимеров этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированнных полиолов, поливинилового спирта, полисахарида, декстрана, поливинилового этилэфира, PLA (поли(молочной кислоты), PLGA (полимолочной-гликолевой кислоты) и их комбинаций. Наиболее предпочтительным является поли(этиленгликоль) (PEG) с предпочтением, отданным полиэтиленгликолю. Его производные, которые хорошо известны и могут быть легко получены в данной области техники, также включены в объем настоящего изобретения.

Длительно действующие конъюгаты G-CSF, используемые в настоящем изобретении, могут быть получены с применением технологии генетической инженерии, как описано в патенте Кореи № 10-0725315.

Жидкая препаративная форма в соответствии с настоящим изобретением содержит длительно действующий конъюгат G-CSF в терапевтически эффективном количестве. Обычно терапевтически эффективное количество G-CSF составляет примерно 30 мкг на ампулу для однократного применения. Концентрация длительно действующих конъюгатов G-CSF, используемых в настоящем изобретении, составляет порядка от 7 мг/мл до 22 мг/мл и предпочтительно порядка от 11 мг/мл до 22 мг/мл.

Используемый в настоящем описании термин «стабилизатор» предназначен для обозначения вещества, которое обеспечивает возможность безопасного хранения длительно действующего конъюгата G-CSF. Термин «стабилизация» предназначен для обозначения потери активного ингредиента до заданной степени, в целом до 10% в течение определенного периода времени в условиях хранения. Когда G-CSF сохраняет 90% или более его первоначальной активности и предпочтительно 95% или выше его первоначальной активности после хранения при 10°C в течение 2 лет, при 25°C в течение 6 месяцев или при 40°C в течение от одной до двух недель, то это считается, что он является стабильным. Что касается белков, таких как G-CSF, то их стабильность при хранении важна при подавлении потенциального генерирования подобных G-CSF антигенных материалов, а также обеспечении точных вводимых количеств. Во время хранения потеря примерно 10% активности G-CSF может считаться допустимой для введения, пока G-CSF внутри препаративной формы не агрегируется или фрагментируется для образования антигенных материалов.

Стабилизатор, подходящий для применения в настоящем изобретении, содержит забуференный раствор, составленный для придания стабильности длительно действующему конъюгату G-CSF, и маннит.

Кроме того, стабилизатор в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно не содержит альбумина. Ввиду того что человеческий сывороточный альбумин, доступный в качестве стабилизатора для белка, получают из крови человека, то существует возможность его заражения патогенными вирусами человеческого происхождения. Желатин или бычий сывороточный альбумин могут быть причиной заболевания или вызвать аллергическую реакцию у некоторых пациентов. Стабилизатор, не содержащий сывороточного альбумина человеческого или животного происхождения или гетерогенных белков, таких как очищенный желатин, в соответствии с настоящим изобретением избавлен от угрозы относительно вирусной инфекции.

Буферный раствор в стабилизаторе играет роль поддержания постоянного pH жидкой препаративной формы для предотвращения колебаний pH, таким образом, стабилизируя длительно действующий конъюгат G-CSF. Буферный раствор, используемый в настоящем изобретении, может содержать фармацевтически приемлемые забуферивающие pH агенты, включая щелочные соли (фосфат натрия или калия, их гидро- и дигидрофосфаты), цитрат натрия/лимонную кислоту, ацетат натрия/уксусную кислоту и их комбинацию. Подходящим для применения в настоящем изобретении является цитратный буфер, фосфатный буфер, тартратный буфер, карбонатный буфер, сукцинатный буфер, лактатный буфер и ацетатный буфер с предпочтением фосфатного буфера и цитратного буфера, причем предпочтительнее цитратный буфер. В цитратном буфере концентрация цитрата находится в диапазоне предпочтительно от 5 до 100 мМ, а предпочтительнее от 10 до 50 мМ. Буфер имеет предпочтительно pH от 4,0 до 8,0, более предпочтительно pH от 5,0 до 7,0 и наиболее предпочтительно pH от 5,0 до 6,0.

В одном варианте осуществления длительно действующий конъюгат G-CSF оценивали в отношении стабильности в соответствии с величинами pH используемого буфера. При pH 5,5 было обнаружено, что буфер с pH 5,5 гарантирует длительно действующему конъюгату G-CSF более высокую стабильность, чем при pH 6,0 (см. таблицы 2 и 4). По этим результатам понятно, что длительно действующий конъюгат G-CSF по настоящему изобретению стабилизируется до различных степеней в зависимости от величин pH буфера и проявляет максимальную стабильность при определенном pH. В частности, было обнаружено, что стабильность длительно действующего конъюгата G-CSF, в котором Fc, стабильный при нейтральном pH, связан с G-CSF, снижается в жидкой препаративной форме, содержащей буфер при низком pH. В Невласте (Neulasta), имеющемся в продаже слитом с PEG лекарственном препарате G-CSF используется ацетатный буфер с pH 4 в качестве стабилизирующего агента. Однако не рекомендуется применение композиции обычного стабилизатора и pH для длительно действующего конъюгата G-CSF не только потому, что длительно действующий конъюгат G-CSF по настоящему изобретению больше и по молекулярной массе, и по объему, чем G-CSF дикого типа, но также потому, что фрагмент Fc иммуноглобулина стабилен в нейтральном диапазоне pH.

Маннит, вид сахарного спирта, используется в стабилизаторе по настоящему изобретению, потому что он действует для повышения стабильности длительно действующего конъюгата G-CSF. Маннит используется предпочтительно в концентрации от 1 до 20% (масс./об.) на основании общего объема жидкой препаративной формы, более предпочтительно в концентрации от 3 до 10% (масс./об.) и наиболее предпочтительно в концентрации от 5 до 7% (масс./об.).

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения было показано, что когда маннит в присутствии цитратного буфера используется в качестве стабилизатора, то стабильность при хранении длительно действующего конъюгата G-CSF увеличивается больше, чем при применении сорбита (см. таблицу 6). Эти данные показывают специфичность маннита в качестве стабилизатора для длительно действующего конъюгата G-CSF по сравнению с другими стабилизаторами, указывая на то, что в соответствии с подлежащими стабилизации объектами требуются различные стабилизаторы.

Стабилизатор может дополнительно содержать другие сахарные спирты, если они не ухудшают стабилизирующий эффект комбинации маннита и буфера на длительно действующий конъюгат G-CSF.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения стабилизатор, используемый в настоящем изобретении, может дополнительно содержать, по меньшей мере, один компонент, выбранный из группы, состоящей из изотонических агентов, многоатомных спиртов, сахаров, неионных ПАВ и натуральных аминокислот в дополнение к буферному раствору и манниту.

Изотонический агент действует не только для поддержания подходящего осмотического давления, когда длительно действующему конъюгату G-CSF в жидкой препаративной форме предоставлена возможность поступить в организм, но для дополнительной стабилизации длительно действующего конъюгата G-CSF в жидкой препаративной форме. Примеры изотонического агента включают растворимые в воде неорганические соли. Среди них имеются хлорид натрия, сульфат натрия, цитрат натрия, хлорид кальция и их комбинация. Наиболее предпочтительным является хлорид натрия.

Предпочтительно концентрация изотонического агента составляет порядка от 5 до 200 мМ. В пределах данного диапазона концентрация изотонического агента может регулироваться в соответствии с видами и количествами содержащихся компонентов, с тем чтобы жидкая препаративная форма была изотонической.

Предпочтительные примеры сахара, который может, кроме того, содержаться для увеличения стабильности при хранении длительно действующего конъюгата G-CSF, включают моносахариды, такие как манноза, глюкоза, фукоза и ксилоза, и полисахариды, такие как лактоза, мальтоза, сахароза, раффиноза и декстран. В жидкой препаративной форме сахар предпочтительно используется в количестве от 1 до 20% (масс./об.) и более предпочтительно используется в количестве от 5 до 20% (масс./об.). Примеры многоатомного спирта, используемого в настоящем изобретении, включают пропиленгликоль, полиэтиленгликоль низкой молекулярной массы, глицерин и полипропиленгликоль низкой молекулярной массы. Они могут использоваться отдельно или в комбинации. И их концентрация в жидкой препаративной форме составляет предпочтительно порядка от 1 до 15% (масс./об.) и более предпочтительно порядка от 5 до 15% (масс./об.)

Что касается неионного ПАВ, то оно снижает поверхностное натяжение белкового раствора для предотвращения адсорбции или агрегации белков на гидрофобных поверхностях, неионные ПАВ на основе полисорбата и неионные ПАВ на основе полоксамера подходят для применения в настоящем изобретении. Они могут использоваться отдельно или в комбинации. Предпочтительны неионные ПАВ на основе полисорбата. Среди них находятся полисорбат 20, полисорбат 40, полисорбат 60 и полисорбат 80 при более предпочтительном полисорбате 80.

Не рекомендуется применение неионного ПАВ в высокой концентрации, потому что, если неионное ПАВ присутствует в высокой концентрации, оно вызывает помехи при УФ-спектрометрии или изоэлектрическом фокусировании, затрудняя точную оценку концентрации или стабильности белка. Таким образом, жидкая препаративная форма по настоящему изобретению может содержать неионное ПАВ предпочтительно в концентрации 0,1% (масс./об.) или менее и более предпочтительно в концентрации от 0,001 до 0,05% (масс./об.).

В отношении стабильности при хранении длительно действующего конъюгата G-CSF полисорбат 20 сравнивали с полисорбатом 80. Было обнаружено, что длительно действующий конъюгат G-CSF увеличивает стабильность в присутствии полисорбата 80 по сравнению с полисорбатом 20 (см. таблицу 8). В Невласте, слитой с PEG лекарственной препаративной формой G-CSF, используется полисорбат 20. Однако жидкая препаративная форма по настоящему изобретению гарантирует длительно действующему конъюгату G-CSF более высокую стабильность при хранении при содержании полисорбата 80, чем полисорбата 20. По представленным данным понятно, что в соответствии с подлежащими стабилизации объектами требуются различные ПАВ.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения длительно действующий конъюгат G-CSF сохранялся в более стабильном состоянии в течение периода хранения 4 недель при 40°C в жидкой препаративной форме, содержащей в качестве неионного ПАВ 0,005% (масс./об.) полисорбата 80, чем 0,01% (масс./об.) полисорбата 80 (см. таблицу 10).

Аминокислота, также доступная в качестве стабилизатора для жидкой препаративной формы, действует для привлечения большего числа молекул воды вокруг G-CSF в растворе, так что дополнительно стабилизируются самые наружные молекулы гидрофильных аминокислот G-CSF (Wang, Int. J. Pharm. 185: 129-188, 1999). В этом отношении заряженные аминокислоты могут вызвать электростатическое привлечение G-CSF для содействия агрегации G-CSF. Следовательно, нейтральные аминокислоты, такие как глицин, аланин, лейцин и изолейцин, добавляются в качестве стабилизирующего компонента. В жидкой препаративной форме нейтральная аминокислота используется предпочтительно в концентрации от 0,1 до 10% (масс./об.).

В одном варианте осуществления настоящего изобретения стабилизатор, содержащий маннит в концентрации от 3 до 12% (масс./об.) на основании общего объема жидкой препаративной формы, обеспечивал возможность длительно действующему конъюгату G-CSF, имеющему Fc с большой молекулярной массой, стабильно храниться в течение 4 недель, даже несмотря на то что нейтральные аминокислоты не добавлялись (см. таблицу 12). Соответственно, жидкая препаративная форма для обеспечения высокой стабильности длительно действующим конъюгатам G-CSF может быть получена с применением высокой концентрации маннита, даже когда не добавляются нейтральные аминокислоты. Однако концентрация маннита, превышающая 20% (масс./об.), находится вне верхнего изотонического предела. Таким образом, маннит используется в концентрации от 1 до 20% (масс./об.) в жидкой препаративной форме, предпочтительно в концентрации от 3 до 10% (масс./об.) и более предпочтительно в концентрации от 5 до 7% (масс./об.).

В дополнение к указанным выше компонентам, включающим буфер, изотонический агент, сахарный спирт, нейтральную аминокислоту и неионное ПАВ, жидкая препаративная форма по настоящему изобретению может, кроме того, содержать другие компоненты, известные в данной области техники, пока они не ухудшают эффект настоящего изобретения.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения жидкая препаративная форма не содержит альбумина и может содержать буферный раствор, маннит, изотонический агент и неионное ПАВ.

Более подробно, настоящее изобретение относится к жидкой препаративной форме, которая содержит длительно действующий конъюгат G-CSF и стабилизатор, причем стабилизатор содержит фосфатный или цитратный буфер, маннит, изотонический агент и полисорбат 80, причем изотонический агент выбран из группы, состоящей из хлорида натрия, сульфата натрия, цитрата натрия и их комбинации.

Предпочтительно жидкая препаративная форма содержит раствор фосфатного или цитратного буфера в диапазоне концентрации от 5 до 100 мМ и при pH от 5 до 7, маннит в концентрации от 1 до 20% (масс./об.), изотонический агент в концентрации от 5 до 200 мМ, причем изотонический агент выбран из группы, состоящей из хлорида натрия, сульфата натрия и цитрата натрия, и полисорбат 80 в концентрации от 0,001 до 0,05% (масс./об.). Более предпочтительно жидкая препаративная форма содержит раствор цитратного буфера в диапазоне концентрации от 5 до 100 мМ и pH от 5 до 6, маннит в концентрации от 1 до 10% (масс./об.), хлорид натрия в концентрации от 100 до 200 мМ и полисорбат 80 в концентрации от 0,001 до 0,05% (масс./об.). Более предпочтительно жидкая препаративная форма содержит цитратный буфер (pH 5,2-5,8) в концентрации 20 мМ, маннит в концентрации от 3 до 7% (масс./об.), хлорид натрия в концентрации от 100 до 200 мМ, и полисорбат 80 в концентрации от 0,001 до 0,05% (масс./об.), и в ней не используются нейтральные аминокислоты.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения жидкую препаративную форму для длительно действующего конъюгата G-CSF, содержащую буферный раствор Na-цитрата (pH 5,5), 5% (масс./об.) маннита, 150 мМ хлорида натрия и 0,005% (масс./об.) полисорбата 80, сравнивали с известной препаративной формой G-CSF Невласта, Amgen в отношении стабильности при хранении G-CSF. Было обнаружено, что C-GSF более стабилен в жидкой препаративной форме по настоящему изобретению, чем в имеющейся в продаже препаративной форме, содержащей цитрат натрия с pH 4 (см. таблицу 14).

В другом варианте осуществления жидкая препаративная форма для длительно действующих конъюгатов G-CSF, содержащих цитратный буфер с pH 5,5, маннит, хлорид натрия и полисорбат 80 в соответствии с настоящим изобретением, анализировали на стабильность при долгосрочном хранении и обнаружили, что они поддерживают стабильность длительно действующих конъюгатов G-CSF в течение 6 месяцев и гарантируют, по меньшей мере, 96,6% активности даже после 6-месячного хранения в условиях ускоренного анализа (см. таблицу 16).

Из полученных данных понятно, что жидкая препаративная форма, содержащая буфер в диапазоне pH от 5 до 6 и маннит в концентрации от 1 до 20% (масс./об.), может сохранять стабильность длительно действующего конъюгата G-CSF в течение 12 месяцев или более.

Преимущественные эффекты изобретения

Как описано выше, стабилизатор, содержащий буфер и маннит в соответствии с настоящим изобретением, специализирован для длительно действующих конъюгатов G-CSF. Не имея в своем составе человеческого сывороточного альбумина и других потенциальных факторов, вредных для организма, жидкая препаративная форма для длительно действующих конъюгатов G-CSF в соответствии с настоящим изобретением освобождена от угрозы вирусных инфекций и гарантирует превосходную стабильность при хранении длительно действующим конъюгатам G-CSF, в которых связаны G-CSF и фрагмент Fc иммуноглобулина и которые больше по молекулярной массе и имеют более длительное действие, чем натуральные формы G-CSF.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 представляет собой график, показывающий стабильность G-CSF в жидких препаративных формах для длительно действующего конъюгата G-CSF, где используются буферы с различными величинами pH, и препаративной формы Невласта со слитым с PEG G-CSF, когда они анализируются с применением SE-HPLC (ВЭЖХ с исключением по размеру) каждую неделю в течение двухнедельного срока хранения при 40°C.

Вариант осуществления изобретения

Настоящее изобретение можно лучше понять посредством следующих примеров, которые изложены для иллюстрации, но не рассматриваются как ограничивающие настоящее изобретение.

Пример 1: Конструирование длительно действующего конъюгата G-CSF

<1-1> Получение фрагмента Fc иммуноглобулина

Фрагмент Fc иммуноглобулина, используемый в настоящем изобретении, представлял собой человеческий агликозилированный Fc-фрагмент IgG4, который может быть экспрессирован из трансформанта E. coli, как раскрыто в патенте Кореи № 725314.

<1-2> Получение рекомбинантного человеческого фактора, стимулирующего колонии гранулоцитов

Рекомбинантный человеческий G-CSF, использованный в данной примере, является мутантным (¹⁷Ser-G-CSF), в котором остаток серина располагался в положении 17 вместо цистеина для дикого типа, и мог экспрессироваться из трансформанта E.coli, как раскрыто в патенте Кореи № 356140.

<1-3> Получение длительно действующего конъюгата G-CSF с применением фрагмента Fc иммуноглобулина

Длительно действующий конъюгат G-CSF в данном примере представлял собой конструкт, в котором человеческий фактор, стимулирующий колонии гранулоцитов, и фрагмент Fc иммуноглобулина ковалентно связаны непептидным полимером. Он был получен, как раскрыто в патенте Кореи №№ 725315 и 775343.

Пример 2: Анализ длительно действующих конъюгатов G-CSF в отношении стабильности в соответствии с pH буфера

Для составления жидкой препаративной формы для стабилизации конъюгата G-CSF, полученного в примере 1, исследовали эффект, когда варьирующиеся величины pH буфера оказывают на стабильность длительно действующего конъюгата G-CSF.

Для анализа жидкие препаративные формы для длительно действующего конъюгата G-CSF таблицы 1 получали с композициями стабилизатора, содержащими маннит в качестве стабилизирующего агента, полисорбата 80 в качестве ПАВ и раствор цитрата натрия с pH 5,0, 5,5 или 6,0 в качестве буфера. После их хранения при 40°C в течение двух недель для анализа выполняли эксклюзионную хроматографию. Результаты суммированы ниже в таблице 2. Степень сохранения длительно действующего конъюгата G-CSF по сравнению с ее первоначальной величиной выражали в виде SE-HPLC (%).

Как очевидно из данных таблицы 2, буфер цитрата натрия при pH 5,0 вызывает осаждение белка в 1-ю неделю, в то время как не были выявлены осадки, когда использовали буфер цитрата натрия при pH 5,5 или 6,0. Было также понятно, что стабильность длительно действующего G-CSF дополнительно увеличивалась в буфере цитрата натрия, имеющем pH 5,5, чем pH 6,0.

Следующий эксперимент выполняли с буферами, имеющими подразделенные величины pH. Жидкие препаративные формы для длительно действующих конъюгатов G-CSF получали с композициями стабилизаторов, представленными ниже в таблице 3, и хранили при 40°C в течение двух недель перед анализом с применением хроматографии с обращенной фазой и эксклюзионной хроматографии (SE-HPLC). Результаты суммированы ниже в таблице 4. Степень сохранения длительно действующего конъюгата G-CSF сравнивали с их первоначальной величиной и выражали в виде SE-HPLC (%).

После хранения в течение двух недель в буферах цитрата натрия с pH от 5,2 до 5,5, как видно в таблице 4, было обнаружено, что длительно действующий G-CSF сохранял примерно 90% или выше первоначальной активности.

Из указанных результатов понятно, что длительно действующие конъюгаты G-CSF в соответствии с настоящим изобретением стабилизируются в значительной степени в зависимости от величин pH используемого буфера при максимальной стабильности в определенном диапазоне pH. В частности, было обнаружено, что стабильность при хранении длительно действующего конъюгата G-CSF, в котором фрагмент Fc, стабильный при нейтральном pH, связан с G-CSF, уменьшена в жидкой препаративной форме, содержащей буфер с низким pH.

Пример 3: Анализ длительно действующих конъюгатов G-CSF в отношении стабильности в соответствии с сахарными спиртами

Сахарные спирты, такие как сорбит и маннит, анализировали в отношении способности стабилизировать длительно действующий конъюгат G-CSF следующим образом.

Получали жидкие препаративные формы для длительно действующих конъюгатов G-CSF с композициями стабилизаторов, которые содержали маннит и сорбит в качестве сахарного спирта, хлорид натрия в качестве изотонического агента и полисорбат в качестве ПАВ, как представлено ниже в таблице 5, и хранили при 40°C в течение четырех недель перед анализом с применением эксклюзионной хроматографии (SE-HPLC). Результаты суммированы ниже в таблице 6. Степень сохранения длительно действующего конъюгата G-CSF сравнивали с первоначальной величиной (площадь в %/первоначальная площадь %) и выражали в виде SE-HPLC (%).

Как очевидно из данных таблицы 6, применение маннита вместо сорбита в качестве стабилизирующего агента поддерживал большую стабильность длительно действующего конъюгата G-CSF.

Пример 4: Анализ длительно действующих конъюгатов G-CSF в отношении стабильности в соответствии с видом неионного ПАВ

В присутствии буфера цитрата натрия анализировали различные неоионные ПАВ в отношении их способности стабилизировать длительно действующий конъюгат G-CSF следующим образом.

Для анализа сравнивали два неионных ПАВ, полисорбат 80 и полисорбат 20, причем последний содержится в Невласте, имеющейся в продаже жидкой препаративной форме слитого с PEG G-CSF. В должной комбинации использовались другие агенты, включая буфер цитрата натрия с pH 5,5 и маннит, которые, как было показано в примерах 2 и 3, обеспечивают стабильность длительно действующего конъюгата G-CSF. Получали жидкие препаративные формы для длительно действующего конъюгата G-CSF с композициями стабилизаторов, которые содержали различные виды полисорбата, как показано ниже в таблице 7, и хранили при 40°C в течение четырех недель перед анализом с применением эксклюзионной хроматографии (SE-HPLC). Результаты суммированы ниже в таблице 8. Степень сохранения длительно действующего конъюгата G-CSF по сравнению с ее первоначальной величиной была выражена в виде SE-HPLC (%).

В таких же условиях, как показано в таблице 8, полисорбат 80 гарантировал более высокую стабильность при хранении длительно действующего конъюгата G-CSF, чем полисорбат 20. Не были выявлены значимые различия стабильности при хранении длительно действующего конъюгата G-CSF между двумя соединениями до конца двухнедельного хранения при 40°C. Однако на 4-й неделе неионные ПАВ проявляли значимые различия стабильности при хранении, хотя они очень похожи по структуре.

Пример 5: Анализ длительно действующих конъюгатов G-CSF в отношении стабильности в связи с концентрацией неионного ПАВ

В примере 4 полисорбат 80 был по оценке более эффективным в стабилизации длительно действующего конъюгата G-CSF, чем полисорбат 20. В данном примере проводили исследование эффекта концентрации полисорбата 80 на стабильность длительно действующего конъюгата. Для этого получали жидкую препаративную форму длительно действующего конъюгата G-CSF с композицией стабилизатора, представленной ниже в таблице 9, и хранили при 40°С в течение четырех недель перед анализом с применением эксклюзионной хроматографии. Результаты суммированы ниже в таблице 10. Сохранение длительно действующего конъюгата G-CSF по сравнению с первоначальной величиной его содержания была выражена в виде SE-HPLC (%).

Как показано в таблице 10, было обнаружено, что в течение четырехнедельного периода хранения при 40°С длительно действующий конъюгат G-CSF был более стабилен в жидкой препаративной форме, содержащей 0,005% полисорбата 80, чем в препаративной форме с 0,01% полисорбата 80.

Пример 6: Анализ стабильности длительно действующих конъюгатов в связи с аминокислотой

Применение аминокислоты в качестве стабилизирующего агента анализировали в отношении способности стабилизировать длительно действующие конъюгаты G-CSF. Эксперимент по оценке стабильности при хранении длительно действующих конъюгатов G-CSF выполняли со стабилизаторами, содержащими буфер цитрат натрия (pH 6,0), маннит и нейтральную аминокислоту глицин.

Получали жидкие препаративные формы для длительно действующих конъюгатов G-CSF с композициями стабилизатора, представленными ниже в таблице 11, и хранили при 40°С в течение четырех недель перед анализом с применением эксклюзионной хроматографии. Результаты суммированы ниже в таблице 12. Сохранение длительно действующего конъюгата G-CSF по сравнению с первоначальной величиной его содержания (площадь в %/первоначальную площадь в %) была выражена в виде SE-HPLC (%).

Даже в отсутствие нейтральной аминокислоты глицина, как видно в таблице 12, жидкая препаративная форма, содержащая высокую концентрацию (5% (масс./об.)) маннита, гарантировала стабильность при хранении длительно действующего конъюгата на уровне, аналогичном уровню, полученному, когда использовалась нейтральная аминокислота.

Пример 7: Сравнение стабильности при хранении длительно действующих конъюгатов G-CSF относительно жидких препаративных форм

В отношении стабильности при хранении жидкая препаративная форма, которая была получена с композицией стабилизатора, содержащей буфер цитрат натрия (pH 5,5), хлорид натрия, маннит и полисорбат 80, которые все, как было доказано в примерах 2-6, обладают стабилизирующей активностью, сравнивали с имеющейся в продаже жидкой препаративной формой G-CSF Невласта от компании Amgen. Композиции жидкой препаративной формы по настоящему изобретению и Невласта показаны ниже в таблице 13. Пока жидкие препаративные формы для длительно действующего конъюгата G-CSF хранились при 40°C в течение двух недель, их анализировали каждую неделю с применением хроматографии с обращенной фазой и эксклюзионной хроматографии. Результаты суммированы ниже в таблице 14. Степень сохранения длительно действующего конъюгата G-CSF в сравнении с ее первоначальной величиной была выражена в виде RP-HPLC (%) и SE-HPLC (%).

Как очевидно по данным таблицы 14, после длительного хранения жидкая препаративная форма для длительно действующего конъюгата G-CSF по настоящему изобретению гарантировала стабильность при хранении, эквивалентную или большую, чем стабильность, обеспечиваемая Невластой. По данным результатам понятно, что жидкие препаративные формы по настоящему изобретению способны гарантировать превосходную стабильность при хранении, в частности, длительно действующего конъюгата G-CSF.

Пример 8: Анализ жидких препаративных форм для длительно действующего конъюгата G-CSF в отношение стабильности при длительном хранении и стабильности при ускоренном анализе

Для исследования стабильности при длительном хранении и стабильности при ускоренном анализе жидкая препаративная форма для длительно действующего конъюгата G-CSF, полученная из композиции стабилизатора, содержащей буфер цитрата натрия (pH 5,5), хлорид натрия, маннит и полисорбат 80, которая, как было доказано в примерах 2-6, гарантирует наибольшую стабильность при хранении, хранили при 4°C в течение 12 месяцев и в последующем при 25°C в течение 6 месяцев, в течение которых образцы анализировали в отношении стабильности при хранении. Результаты суммированы ниже в таблицах 15 и 16. В таблицах 15 и 16 степень сохранения длительно действующего конъюгата G-CSF по сравнению с ее первоначальной величиной выражена в виде RP-HPLC (%), SE-HPLC (%), содержания белка (%) и биологической инертной активности (%).

Как очевидно из данных таблиц 15 и 16, длительно действующий конъюгат G-CSF сохранял высокую стабильность в течение 6 месяцев в жидкой препаративной форме, содержащей композицию стабилизатора в соответствии с настоящим изобретением, и было обнаружено, что он имеет 92,5% первоначальной активности даже после хранения в течение 6 месяцев в жидкой препаративной форме в условиях ускоренного анализа. Поэтому жидкая препаративная форма для длительно действующего конъюгата G-CSF в соответствии с настоящим изобретением проявляет эффективность в отношении стабильности при хранении.

Хотя предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения были описаны в иллюстративных целях, специалистам в данной области техники понятно, что возможны различные модификации, добавления и замещения без отхода от объема и сущности изобретения, раскрытого в сопровождающей формуле изобретения.

Промышленная применимость

Не содержащая человеческого сывороточного альбумина жидкая препаративная форма для прицельного обеспечения стабильности при хранении длительно действующих конъюгатов G-CSF в соответствии с настоящим изобретением не вызывает угрозы в отношении вирусных инфекций. Она содержит простую композицию, таким образом, имея экономическое преимущество перед другими стабилизаторами или лиофилизированными препаративными формами. Кроме того, ввиду того что она содержит длительно действующий конъюгат G-CSF, который имеет более длительное действие, чем натуральная форма, а также сохраняет активность белка в течение длительного периода времени, жидкая препаративная форма может использоваться в качестве эффективной лекарственной системы.