СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ФЛОТАЦИИ ТРОМБА В СИСТЕМЕ НИЖНЕЙ ПОЛОЙ ВЕНЫ С ДОПОЛНИТЕЛЬНЫМ ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, клинической лабораторной диагностике, хирургии и может быть использовано гематологами, врачами-лаборантами, хирургами для своевременной диагностики и прогнозирования флотации тромба в системе нижней полой вены.

В настоящее время не существует достоверного способа прогнозирования развития флотации тромба в системе нижней полой вены с использованием молекулярно-генетического анализа в системе фибринолиза. В настоящее время в основном в диагностике тромбоза и его осложнении в виде флотации тромба используются консервативные или инвазивные методы, основанные на ультразвуковом исследовании (УЗДГ) и (или) проведении илеокаваграфии [1, 3, 4, 5, 10, 12, 14].

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является способ молекулярно-генетической диагностики венозного тромбоэмболизма, опубликованного в 2007 г.(автор - Капустин С.И. НИИ гематологии и трансфузиологии, г.СПб), основанный на определении генетических полиморфизмов в системе гемостаза при тромбозах глубоких вен и венозном тромбоэмболизме.

Однако метод имеет существенные недостатки, так как не позволяет использовать его для прогнозирования развития флотации тромба в виду того, что в данном методе не исследовались особенности распределения генетических полиморфизмов системы гемостаза в отдельности при окклюзионных и флотирующих тромбах в системе нижней полой.вены. Способ-прототип не предусматривает прогнозирования генетически детерминированной депрессии активности системы фибринолиза, которая в свою очередь обуславливает развитие нестабильности и неполноценности тромба (фибрина) и как следствие - флотации тромба. В прототипе не используется изучение генетических полиморфизмов системы гемостаза в зависимости от наличия или отсутствия флотации тромба.

Цель предлагаемого способа состояла в поиске молекулярно-генетических маркеров, определяющих генетическую детерминацию к развитию флотации тромба в системе нижней полой вены. То есть, нами выдвигалась гипотеза, согласно которой клиническому проявлению флотации тромба у части пациентов с тромбозами глубоких вен может предшествовать наличие наследственного генетически детерминированного тромбофилического состояния, характеризующегося повышенным риском развития нарушения в системе фибринолиза и как следствие этого - тромбинемии на фоне носительства полиморфизма в гене PAI-1 675 4G/5G. В связи с этим мы посчитали возможным в группе пациентов с диагнозом тромбоза глубоких вен в системе нижней полой вены дополнительно к клинико-лабораторным и инструментальным методам провести молекулярно-генетическое исследование на предмет наличия генетических полиморфизмов в фибринолитической системе, а именно в гене PAI-1, указывающих на наследственное тромбофилическое состояние, связанное с нарушением (депрессией) фибринолитической активности.

Известно, что генотипически значимые полиморфизмы системы гемостаза могут являться причиной патологической депрессии в системе фибринолиза, тем самым обуславливая развития тромбоза с последующей тромбоэмболией в легочные артерии.

Наша гипотеза основывалась на том, что у части исследуемых пациентов с острыми тромбозами глубоких вен в системе нижней полой вены диагностировалась выраженная лабораторная депрессия активности фибринолиза, которая положительно коррелировала с наличием признаков флотации по данным ультразвукового исследования или данным илеокаваграфии. При этом наличие флотации тромба становилось непосредственной причиной или предвестником тромбоэмболии в системе легочных артерий.

В настоящее время в доступной нам литературе мы не нашли данных о влиянии выбранных нами генетических вариантов полиморфизмов в гене PAI-1 6 75 4G/5G на возможность развития именно флотации тромба в системе нижней полой вены. Исходя из того, что одним из определяющих лабораторных показателей на фоне флотации тромба в нашем исследовании явилось лабораторное снижение активности фибринолиза при наличии подтвержденных признаков флотации тромба по данным УЗДГ и илеокаваграфии, мы посчитали - возможным провести поиск наследственно-детерминированного состояния, обусловленного наличием полиморфизмов именно в гене PAI-1 675 4G/5G.

В литературных источниках достаточно изучены следующие ингибиторы активатора плазминогена (PAI) - это PAI-1, PAI-2, PAI-3 и протеаза-nexin. При тромбозах циркулирующий тромбин может уменьшать эндогенный фибринолитический потенциал путем стимулирования высвобождения ингибитора активатора плазминогена (PAI-1) из тромбоцитов и эндотелия. В этой связи, наибольший интерес вызывают именно полиморфные варианты гена ингибитора активатора плазминогена I типа (PAI-1, -675 4G/5G), ассоциированные с вариацией уровня функциональной активности данного белка в плазме. Немаловажно отметить, что именно белок PAI-1 обеспечивает до 60% всей ингибиторной активности в отношении активаторов плазминогена в плазме крови, тем самым определяя в большинстве случаев регуляцию и активность фибринолиза. Кроме того, известна и доказана роль повышенного уровня PAI-1 при гематогенных тромбофилиях, при которых некоторыми авторами именно PAI-1 отводится ведущая роль в регуляции клинически значимого фибринолиза. Большинство исследований свидетельствует о связи повышения концентрации PAI-1 в крови при ДВС-синдроме, тромбозе глубоких вен, злокачественных новообразованиях, метаболическом синдроме. В клинической практике повышение уровня PAI-1 наблюдается примерно у 20% пациентов с различными проявлениями тромбофилических состояний.

Организация и экспрессия гена PAI-1. Ген человеческого PAI-1 локализуется на 7 хромосоме в диапазоне q21.3-22. Его размер составляет 12300 нуклеотидных пар, представленных 9 экзонами и 8 интронами. Молекула состоит из 379 аминокислот.Ингибиторы активаторов плазминогена являются гликопротеинами. По механизму ингибирования активаторов плазминогена они принадлежат к суперсемейству серпинов.

В настоящее время варианты полиморфизма гена PAI-1 (специфические аллели) связывают с повышением концентрации PAI-1 в плазме. К ним относятся Hind III - полиморфизм в рестриктивном участке гена, (CA)n-полиморфизм, связанный с повторяющимся СА-динуклеотидом и единичная нуклеотидная

замена или делеция - полиморфизм гуанидина 4G/5G в промотерном участке гена [11].

Характеристика известных вариантов полиморфизма 4 гуанидина в промоторе PAI-1 представлена в таблице 1.

В настоящее время существует мнение, что наиболее часто присутствующий полиморфизм 4-гуанидина (4G/5G) в промоторе гена PAI-1 ассоциируется с повышенной активностью PAI-1 и, как следствием этого, со снижением активности фибринолитической системы. При гомозиготном носительстве 40-аллеля отмечается более высокая активность PAI-1. Таким образом, вариант 4G/4G ассоциируется с наибольшей активностью PAI-1, при этом вариант 5G/5G - с нормальной или низкой активностью PAI-1.

Дизайн нашего исследования - случай-контроль. Клиническая часть исследования проведена на базе Лаборатории гемостаза и атеротромбоза ГБУЗ «Первая городская клиническая больница им. Е.Е.Волосевич» г.Архангельска. Молекулярно-генетический анализ выполнен на базе Лаборатории ДНК-диагностики ЦНИЛ ГОУ ВПО Северного государственного медицинского университета.

Исследование выполнено на выборке пациентов с острыми тромбозами глубоких вен в системе нижней полой вены. Исходя из основной цели исследования, все пациенты были разделены на две группы. Группа 1 (n=98) - пациенты с тромбозами глубоких вен с признаками флотации тромба по данным УЗДГ или илеокаваграфии. Группа сравнения (2) была представлена 76 пациентами с острыми тромбозами глубоких вен в системе нижней полой вены с окклюзионными тромбозами (без признаками флотации тромба) по данным УЗДГ.

В качестве материала исследования использовали образцы

геномной ДНК, полученной из лейкоцитов периферической крови по методу Miller S.A. и соавт. Стабилизация крови осуществлялась раствором 4% ЭДТА, замораживание и хранение образца до исследования проводилось при температуре - 50 градусов. Для генотипирования полиморфизма -675 4G/5G в гене ингибитора активатора плазминогена I типа (plasminogen activator inhibitor type I, PAI-1) использовали метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим рестрикционным анализом продукта на оборудовании фирмы «Transgenomic», США. Исследование фибринолитической активности проводилось с использованием лизиса эуглобулиновой фракции плазмы при стимуляции стрептокиназой по Gidron et al., 1978, в модификации В.Г.Лычева и А.Е.Дорохова, 1981, (реактив фирмы «Технология-Стандарт»), норма 75-85 сек; активности плазминогена (реактив «Диагнотика-Стаго»)

Для определения частоты распределения генотипов в здоровой популяции без признаков тромбозов были обследованы 32 практически здоровых человека, соответствующих по полу и возрасту исследуемой группе пациентов и проживающих в г.Архангельске. Данные о распределении изученных вариантов полиморфизма в гене PAI-1 представлены в таблице 2.

Анализ результатов проведенного исследования (табл.2) демонстрирует распределение генотипов PAI-1. В представленной выборке пациентов группы 1 распределение вариантов генотипов PAI-1 было следующим: у 52 (53,1%) пациентов присутствовал генотип 4G/4G, у 40 (40,8%) - генотип 4G/5G, у 6 (6,1%) - 5G/5G. Уровень гетерозиготности составил 40,8%. В группе сравнения (2) соотношение генотипов PAI-1 отличалось от предыдущей выборки:

генотип 4G/4G определялся у 12 (15,7%) пациентов, 4G/5G - у 36 (47,5%) пациентов, и генотип 5G/5G - у 28 (36,8%). Уровень гетерозиготности - 47,5%. Сравнение частот аллелей (р=0.019, F-критерий) и генотипов (р=0.001) в каждой из групп выявило значимые различия в их распределении. Так, частота гомозиготного носительства аллеля -675 4G гена PAI-1, ассоциированного с депрессией фибринолиза, была достоверно выше (р<0.001) в группе пациентов с развитием флотации тромба в системе нижней полой вены. Попарное сравнение частот генотипов в группе 1 обнаружило, что генотип 4G/4G по сравнению с генотипом 4G/5G значимо чаще встречался у пациентов тромбозами глубоких вен с признаками флотации тромба, чем в группе сравнения 2 (р=0.005, F-критерий). Относительный риск (ОР) развития флотации тромба составил 1,6 при доверительном интервале (ДИ) для 95%-ного уровня вероятности, равном 1,1-2,9, для генотипа 4G/4G по сравнению с генотипом 4G/5G. Относительно контрольной группы у пациентов группы 1 определялись достоверные различия по распределению указанных выше генотипов PAI-1 675 4G/5G (р=0.003).

При анализе наличия флотации тромба в группах 1 и 2 пациентов получены достоверные различия по частоте выявления генетических полиморфизмов в гене PAI-1 (р=0.02).

Положительные результаты исследования.

Выявлено, что генетический полиморфизм гена PAI-1 связан с рядом признаков, проявляющихся на различных уровнях патогенеза развития нестабильности организации тромба (фибрина), и как следствие, провоцирует развитие флотации тромба. В нашем исследовании получены данные о связи вариантов полиморфных локусов гена PAI-1 с особенностями течения тромбозов глубоких вен в системе нижней полой вены в виде развития флотации тромба. При анализе результатов обнаружено, что генотип PAI-1 4G/4G достоверно чаще встречался у пациентов с наличием признаков флотации тромба на фоне тромбоза. Необходимо отметить, что присутствие генотипов PAI-1 4G/4G и 4G/5G ассоциировалось с проявлением лабораторной депрессии активности фибринолиза.

Выявленное нами присутствие варианта полиморфизма 4G/4G в гене PAI-1 у пациентов с признаками флотации тромба, по всей видимости, свидетельствует о возможной роли системы фибринолиза, а именно генетического полиморфизма в гене ингибитора активатора плазминогена первого типа в развитии процессов флотации тромба у пациентов с тромбозами глубоких вен в системе нижней полой вены. Подобные результаты, но в отношении полиорганной недостаточности ДВС-синдроме были представлены в ряде работ [2], где указывается на связь наличия определенных полиморфных вариантов гена PAI-1 с неблагоприятным исходом при ДВС-синдроме. Раннее сообщалось о роли полиморфизма гена протромбина, фибриногена, фактора V, наличие которых также коррелирует с развитием ТЭЛА [6, 7, 8, 9]. В доступных нам литературных источниках мы не обнаружили сведений о проведении подобных исследований и выявлении генетических маркеров флотации тромба при тромбозах в системе нижней полой вены.

Проведенный анализ показал, что при наличии снижения активности фибринолиза при тромбозах глубоких вен определенное значение могут иметь наследственно-детерминированные генетические полиморфизмы системы фибринолиза. В нашем исследовании установлено, что частота присутствия отдельных вариантов полиморфизма в гене PAI-1 была достоверно выше у больных с депрессией активности фибринолиза, что в свою очередь ассоциировалось с развитием флотации тромба, которая существенно влияла на прогноз и исход заболевания.

Таким образом, в ходе исследования была продемонстрирована значимость генетических полиморфизмов системы гемостаза в предрасположенности развития флотации тромба в системе нижней полой вены. Полученные результаты указывают на возможные молекулярные механизмы развития флотации тромба, и свидетельствуют о целесообразности широкого внедрения методов ДНК-диагностики в клиническую практику для диагностики и прогнозирования флотации тромба.

Представляем несколько клинических примеров, демонстрирующих значимость данного метода в плане прогнозирования и диагностики флотации тромба при тромбозах глубоких вен в системе нижней полой вены. Клинические примеры.

1. Пациент М., 32 г. № истории болезни 11760, поступил в клинику ГКБ №1 г.Архангельска 24.04.2012 г. с диагнозом: острый илеофеморальный тромбоз левой нижней конечности. Болен течении 5-ти суток, когда появились боли в области левого бедра, одышка. Показатели системы гемостаза при поступлении о наличии гиперкоагуляции с депрессией фибринолиза - (тромбоциты - 258×10⁹/л, АЧТВ 28 сек, ТВ 14 сек, MHO 0,9, активность фибринолиза 120 сек, РФМК 28 мг/100 мл, AT III 87%, Д-димер 4.8 нг/мл). При УЗДГ - признаки тромбоза подвздошной вены слева. Учитывая наличие одышки и признаков тромбинемии выполнена илеокава-графия, где обнаружены признаки флотации тромба. При молекулярно-генетическом исследовании - PAI-1 675 4G/4G. Начата антикоагулянтная терапия. Назначена продленная терапия варфарином. Наблюдается в лаборатории гемостаза и атеротромбоза в ГКБ №1 г.Архангельска. Исход - выздоровление.

2. Пациент А., 47 лет, №истории болезни 11403, поступила в клинику ГКБ №1 г.Архангельска 20.04. 2012 г.с диагнозом: острый тромбоз левой нижней конечности. Показатели системы гемостаза при поступлении о наличии гиперкоагуляции с депрессией фибринолиза - (тромбоциты 263×10⁹/л, фибриноген 7,1 г/л, АЧТВ - 30 сек, MHO 0,8, РФМК - 26 мг/100 мл, AT III 76%, ФА 135 сек, Д-димер 5.7 нг/мл). При УЗДГ - признаки тромбоза левой бедренной вены с признаками флотации тромба. При молекулярно-генетическом исследовании - PAI-1 675 4G/4G. Начата антикоагулянтная терапия надропарином, свежезамороженная плазма. Назначена продленная терапия варфарином. Наблюдается в лаборатории гемостаза и атеротромбоза в ГКБ №1 г.Архангельска. Исход - выздоровление.

3. Пациентка Г., 28 лет, №истории болезни 12227, поступила в клинику ГКБ №1 г.Архангельска 28.04.2012 г. с диагнозом: острый илеофеморальный тромбоз левой нижней конечности. 5 сутки послеродового периода. Показатели гемостазиограммы свидетельствовали о тромбинемии в стадии хронометрической гиперкоагуляции (тромбоциты 214×10⁹/л, фибриноген 2,8 г/л, АЧТВ - 27 сек, MHO 0,8, РФМК - 26 мг/100 мл, Д-димер - 8.5 нг/мл, AT III 68%, ФА 158 сек). При илеокаваграфии - признаки тромбоза левой подвздошной вены с признаками флотации тромба в нижней полой вены, учитывая угрозу ТЭЛА, установлен кава-фильтр типа «зонтик» ниже устьев почечных сосудов. При молекулярно-генетическом исследовании - PAI-1 675 4G/4G. Назначена заместительная антикоагулянтная терапия. Назначена продленная терапия варфарином. Наблюдается в лаборатории гемостаза и атеротромбоза в ГКБ №1 г.Архангельска. Исход - выздоровление.

4. Пациент В., 53 лет, №истории болезни 11679, поступил в клинику ГКБ №1 г.Архангельска 18.04. 2012 г.с диагнозом: острый илеофеморальный тромбоз правой нижней конечности. Показатели гемостазиограммы - (тромбоциты 441×10⁹/л, фибриноген 4,9 г/л, АЧТВ - 27 сек, MHO 0,8, РФМК - 26 мг/100 мл, Д-димер 17.2 нг/мл AT III 63%, ФА 148 сек). При илеокава-графии - признаки тромбоза правой подвздошной вены с признаками флотации тромба в нижней полой вены, установлен кава-фильтр типа «зонтик» ниже устьев почечных сосудов. При молекулярно-генетическом исследовании - PAI-1 675 4G/4G. Назначена заместительная антикоагулянтная терапия, стимуляторы фибринолиза. Назначена продленная терапия варфарином. Наблюдается в лаборатории гемостаза и атеротромбоза в ГКБ №1 г.Архангельска. Исход - выздоровление.

5. Пациент В., 53 лет, №истории болезни 11354, поступил в клинику ГКБ №1 г.Архангельска 20.04. 2012 г.с диагнозом: острый тромбоз правой нижней конечности. Считает себя больной в течении недели. Показатели гемостазиограммы - тромбоциты 347×10⁹/л, фибриноген 8,9 г/л, АЧТВ - 29 сек, MHO 0,9, РФМК - 28 мг/100 мл, Д-димер 9.2 нг/мл AT III 83%, ФА 112 сек). При илеокаваграфии - признаки тромбоза левой подвздошной вены с признаками флотации тромба в нижней полой вены, установлен кава-фильтр типа «зонтик» ниже устьев почечных сосудов. При молекулярно-генетическом исследовании - PAI-1 675 4G/5G. Назначена заместительная антикоагулянтная терапия гепаринами, стимуляторы фибринолиза - трентал. Назначена продленная терапия варфарином. Наблюдается в лаборатории гемостаза и атеротромбоза в ГКБ №1 г.Архангельска. Исход - выздоровление.

Вышеизложенный материал клинически подтверждает полезность предложенного способа прогнозирования флотации тромба. Также наличие подтвержденной генетически детерминированной депрессии фибринолиза позволяет целенаправленно использовать медикаментозную коррекцию данного нарушения. Вышеизложенное подтверждает адекватность и полезность предложенного метода для прогнозирования и диагностики флотации тромба в системе нижней полой вены.

Сведения об известных аналогах

1. Борсов М.Х., Шуков Р.А., Воротынцев В.Г. МСКТ-флебография у пациентов с тромбозами глубоких вен нижних конечностей // Электронный журнал ANGIOLOGIA.ru - 2010. - №2

2. Воробьева Н.А. ДВС-синдром - что нового в строй проблеме // 2006. - Архангельск. - С.186

3. Золкин В.Н., Тищенко И.С. Антикоагулянтная терапия в лечении острых тромбозов глубоких и поверхностных вен нижних конечностей «Трудный пациент» №15-16-2007

4. Лобанова М.В. Оптимизация клинико-диагностической и лечебной тактики у больных острыми тромбозами глубоких вен нижних конечностей // Автореферат дис.… канд. мед. наук. - Москва 2011

5. Раптанова Т.А., Волгина Е.В., Вахлаков А.Н. Ультразвуковая диагностика венозного тромбоза в амбулаторных условиях // "SonoAce-Ultrasound" N17, 2008

6. Сидор Н.В. Роль фактора XIII в формировании тромбогенной опасности при различных видах тромбофилий // автореферат дис… канд. мед. наук. - 2003 Барнаул

7. Капустин С.И. Молекулярно-генетические аспекты патогенеза венозного тромбоэмболизма: диссертация… доктора биологических наук: Санкт-Петербург 2007. - 294 с

8. Капустин С.И. Генетические детерминанты наследственной тромбофилий в патогенезе венозного тромбоза / Капустин С.И., Блинов М.Н., Каргин В.Д., Филановская Л.И., Салтыкова Н.Б., Белязо О.Е., Головина О.Г., Шмелева В.М., Паншина A.M., Папаян Л.П. // Терапевтический архив. - 2003. - №10. - С.78-80

9. Капустин С.И. Генетическая предрасположенность к венозному тромбозу: роль полиморфизмов компонентов плазменного и тромбоцитарных звеньев гемостаза / Капустин С.И., Шмелева В.М., Паншина A.M., Филановская Л.И., Блинов М.Н., Папаян Л.П. // Ученые записки СПбГМУ им.акад. И.П.Павлова. - 2004. - Том XI, №3. - С.10-15

10. Чуриков Д.А., Кириенко А.И. Ультразвуковая диагностика болезней вен. Руководство практикующих врачей. Москва. Изд-во «Литтерра» 2006; 35-46

11. Huber S., McMaster K..J, Voelkerding K.V. Analytical evaluation of primer engineered multiplex polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism for detection of factor V Leiden and prothrombin G20210A. J Mol Diagnostics 2000; 2: 153-7

12. Mostbeck G.H. Duplex and color doppler imaging of the venous system: Spriger 2003; 170

13. Kapustin S.I. APOE gene polymorphism can modify the risk of venous thromboembolism / S.I.Kapustin, Y.S.Drizhum, V.M.Shmeleva, N.B.Saltykova // J.Thrombosis & Haemostasis - 2007. Vol.5, suppl. 2. - P-T-471

14. Lensing A., Davidson В., Prins M., Buller H. Diagnosis of deep-vein thrombosis with ultrasound imaging in symptomatic patients and asymptomatic high-risk patients / In: Hull R, Raskob G, Pineo G, editors. Venous thromboembolism: an evidence-based atlas. Armonk, NY: Futura Publishing Co; 1996. p.115-24