СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛУТАТИОНА В МОДЕЛЬНЫХ ВОДНЫХ РАСТВОРАХ МЕТОДОМ ЦИКЛИЧЕСКОЙ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИИ НА ГРАФИТОВОМ ЭЛЕКТРОДЕ, МОДИФИЦИРОВАННОМ КОЛЛОИДНЫМИ ЧАСТИЦАМИ СЕРЕБРА

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам определения содержания глутатиона в водных растворах методом циклической вольтамперометрии.

Предложена методика вольтамперометрического определения глутатиона в модельных растворах на платиновом электроде в растворе фонового электролита 0,05 М H2SO4 при сканировании потенциала от 0,0 до 1,3 В со скоростью развертки потенциала 20 мВ/с. Нижняя граница определяемых содержаний глутатиона составляет 1,9·10⁵ М. [Будников Г.К., Зиятдинова Г.К., Валитова Я.Р. Электрохимическое определение глутатиона // Журнал аналитической химии. - 2004. - Т.59. - №6. - С.645-648]. Недостатком является низкая чувствительность определения глутатиона и использование дорогостоящего индикаторного платинового электрода.

Предложена методика электрохимического определения глутатиона в водных растворах биологически активных веществ в режиме катодной вольтамперометрии на ртутно-пленочном электроде в боратном буферном растворе фонового электролита при рН 9,18 и сканировании потенциала от 0,0 до -0,8 В со скоростью развертки потенциала 20 мВ/с. Предел обнаружения составляет 6,3·10^-5 моль/л. [Короткова Е.И., Дорожко Е.В. Патент №2441225 от 27.01.2012. Бюл. №3 // Способ определения глутатиона в биологически активных добавках методом катодной вольтамперометрии]. Недостатком является низкая чувствительность определения глутатиона и использование токсичного индикаторного ртутно-пленочного электрода.

Предложен способ определения глутатиона методом циклической вольтамперометрии в модельных растворах, имитирующих состав вина, состоящий из 12% этанола, 0,05 М винной кислоты с добавлением NaOH до pH 3,6 на угольно-пастовых электродах из различных углеродсодержащих материалов в растворе фонового электролита 0,1 М КС1 при сканировании потенциала от -0,5 до+1,3 В со скоростью 100 мВ/с. Предел обнаружения глутатиона на угольно-пастовом электроде, приготовленном из графита, составляет 4,47·10^-6 М; на угольно-пастовом электроде, приготовленном из микросфер, составляет 6,32·10^-6 М; на угольно-пастовом электроде, приготовленном из нанотрубок, равен 5,48·10^-6 М. [Apetrei С., Apetrei I.M., De Saja J. A. and Rodriguez -Mendez M. L. Carbon paste electrodes made from different carbonaceous materials: application in the study of antioxidants. // Sensors. - 2011. - V.11. - P. 328-1344]. Недостатком является низкая чувствительность определения глутатиона для всех предложенных модификаций графитового электрода и использование сложносоставного фонового электролита.

Предложен способ определения глутатиона методом циклической вольтамперометрии в растворе фонового электролита 0.05 М Na₂B₄O₇ при pH 9.2 на ртутно-капающем электроде, при сканировании потенциала от -0,8 до -0,2 В со скоростью 5 мВ/с. Нижняя граница определяемых содержаний составляет 1,5·10^-4 моль/л [D. Huska, О. Zitka, V. Adam, М. Beklova, S. Kfizkova, L. Zeman, А. Нота, L. Havel, J. Zehnalek, R. Kizek A sensor for investigating the interaction between biologically important heavy metals and glutathione // Czech J. Anim. Sci., 52, 2007 (2): 37-43]. Недостатком является низкая чувствительность определения глутатиона и использование токсичного индикаторного ртутно-капающего электрода.

Предложена методика определения глутатиона методом циклической вольтамперометрии в эритроцитах человека на стеклянном электроде, модифицированном фталоцианидом кобальта в поли-1-лизин пленке в 0,1 моль буферном растворе при рН 7,4 n-1-пиперазин-К, N-бис (2-этансульфокислоте). Предел обнаружения составляет 15 нмоль/л. [Luz, R. Cassia Silva; Damos, Flavio Santos; Gandra, Paulo Guimares; De Macedo, Denise Vaz; Tanaka, Auro Atsushi; Kubota, Lauro Tatsuo Electrocatalytic determination of reduced glutathione in human erythrocytes // Analytical and Bioanalytical Chemistry. - 2007. - V. 387. - №5. - P. 1891]. Недостатком является использование стеклянного электрода с трудно модифицируемой поверхностью и использование сложного фонового электролита.

Предложена методика определения сульфгидридных (тиоловых) и дисульфидных групп в цельной крови в режиме инверсионно-вольтамперометрического титрования на платиновом электроде в фоновом растворе аммиачного буфера с рН 9,5 при сканировании потенциала от -0,1 до 0,4 В со скоростью развертки потенциала 250 мВ/с. Нижняя граница определяемых содержаний сульфгидридных (тиоловых) соединений составляет 1,5·10^-4 моль/л, дисульфидных - 4,6·10^-3. [Захарчук Н.Ф., Борисова Н.С., Титова Т.В. Исследование тиолсульфидного равновесия в цельной крови и ее фракциях методом инверсионно-вольтамперометрического титрования // Журнал аналитической химии. - 2008. - Т.63. - №2. - С.189-198, прототип.]

В работе была поставлена задача, снизить предел и нижнюю границу определяемых содержаний глутатиона по величине анодного максимума на циклической кривой? полученного на графитовом электроде (ГЭ), модифицированном коллоидными частицами серебра методом циклической вольтамперометрии.

Поставленная задача достигается тем, что проводят электроокисление глутатиона на поверхности модифицированного ГЭ. Модифицирование поверхности ГЭ коллоидными частицами серебра проводят из золя серебра (мольное соотношение HAuCl₄:Na₃C₆H₅O₇ 1:1) в течение 300 с при потенциале электролиза Е_э=-1,0 В. Вольтамперные зависимости регистрируют в растворе фонового электролита 0,1 М NaOH при скорости развертки? равной 100 мВ/с в диапазоне потенциалов от -1,0 до 1,0 В относительно насыщенного хлоридсеребряного электрода (нас.х.э.). Концентрацию глутатиона определяют по высоте анодного максимума на вольтамперных кривых в диапазоне потенциалов от 0,3 до 0,6 В. Новым в способе является то, что для получения полезного сигнала, зависящего от концентрации глутатиона, используется ГЭ, модифицированный коллоидными частицами серебра, позволяющий увеличить каталитическую активность за счет увеличения рабочей поверхности электрода увеличением числа активных центров и большей электрокаталитической активностью коллоидных частиц серебра по сравнению с поверхностью платинового электрода.

В предлагаемом способе впервые установлена способность глутатиона окисляться на ГЭ, модифицированном коллоидными частицами серебра, полученными по цитратной методике.

В качестве индикаторного электрода применяли ГЭ, модифицированный коллоидными частицами серебра (в прототипе применяли платиновый электрод).

Использование таких электродов обусловлено высокой химической и электрохимической устойчивостью графита, широкой областью рабочих потенциалов, простотой нанесения модификатора, механического обновления поверхности и требованиями техники безопасности (не используются опасные или вредные вещества при работе с электродом).

В данном изобретении предлагается способ модифицирования поверхности электрода коллоидными частицами серебра из золя (мольное соотношение HAuCl₄:Na₃C₆H₅O₇ 1:1). Модифицированная поверхность электрода чувствительна к присутствию глутатиона в растворе, что позволяет судить о его наличии.

Предлагаемый в заявляемом изобретении фон 0,1 М NaOH позволяет определять низкие содержания глутатиона с хорошей воспроизводимостью концентрацию равной 1·10^-12 моль/л, что соответствует минимально определяемой концентрации (в прототипе предел обнаружения 4,47·10^-6 М).

На фиг.1 представлены циклические вольтамперные кривые глутатиона с поверхности графитового электрода, предварительно электрохимически модифицированного коллоидными частицами серебра. Кривая 1ан, 1кат ветвь - фон 0,1 М NaOH; кривая 2ан, 2кат ветвь - C_GSH=2·10^-12 моль/л; кривая 3ан, 3кат ветвь - C_GSH=4·10^-12 моль/л.

Таким образом, установленные условия впервые позволили количественно определять содержание глутатиона на основе реакции электрокаталитического окисления глутатиона на поверхности графитового электрода, предварительно электрохимически модифицированного коллоидными частицами серебра. Кривая 1 - фон 0,1 М NaOH, кривая 2 - C_GSH=2·10^-12 моль/л, кривая 3 - C_GSH=4·10^-12 моль/л (фиг.2).

Предлагаемый вольтамперометрический способ позволил улучшить метрологические характеристики анализа глутатиона, повысить чувствительность определения (1-10 моль/л), что на несколько порядков ниже по сравнению с прототипом (табл.1).

Примеры конкретного выполнения

Пример 1. Измерения были проведены в модельном растворе. Графитовый электрод помещают в электрохимическую ячейку (кварцевый стаканчик), заполненную 10 мл золя серебра (мольное соотношение HAuCl₄:Na₃C₆H₅O₇ 1:1). Проводят электролиз раствора для модификации ГЭ коллоидными частицами серебра при условии: Е_э=-1,0 В, τ_э=300 с. Для проверки работы электрода снимают вольтамперную кривую электроокисления серебра при скорости развертки 50 мВ/с в диапазоне от -0,50 до 1,00 В. На кривой регистрируется волна окисления серебра при Е=0,0±0,1 В. Наличие волны серебра свидетельствует об электроконцентрировании серебра из цитратного золя серебра на поверхности графитового электрода. Затем проводят электролиз еще раз при тех же условиях, но не проводят развертку вольтамперной кривой. Полученный модифицированный графитовый электрод ополаскивают бидистиллированной водой и помещают в другую электрохимическую ячейку (кварцевый стаканчик), заполненную 10 мл 0,1 М раствора NaOH. Не проводя накопления регистрируют анодную ветвь, а затем катодную ветвь циклической вольтамперной кривой фонового электролита при скорости развертки 100 мВ/с, начиная с потенциала минус 1,0 и до плюс 1,0 В. На анодной ветви вольтамперной кривой фонового электролита не наблюдается максимум в диапазоне потенциалов от 0,3 до 0,6 В. При добавлении раствора глутатиона происходит увеличение высоты максимума в диапазоне потенциалов от 0,3 до 0,6 В.

Пример 2. Измерения были проведены в водопроводной воде.

Графитовый электрод помещают в электрохимическую ячейку (кварцевый стаканчик), заполненную 10 мл золя серебра (мольное соотношение HAuCl₄:Na₃C₆H₅O₇ 1:1). Проводят электролиз раствора для модификации ГЭ коллоидными частицами серебра при условии: Е_э=-1,0 В, τ^э=300 с. Для проверки работы электрода снимают вольтамперную кривую электроокисления серебра при скорости развертки 50 мВ/с в диапазоне от -0,50 до 1,00 В. На кривой регистрируют волну окисления серебра при Е=0,0±0,1 В. Наличие волны серебра свидетельствует об электроконцентрировании серебра из цитратного золя серебра на поверхности графитового электрода. Затем проводят электролиз еще раз при тех же условиях, но не проводят съемку вольтамперной кривой. Потом полученный модифицированный графитовый электрод ополаскивают бидистиллированной водой и помещают в другую электрохимическую ячейку (кварцевый стаканчик), заполненную 10 мл водопроводной воды с добавлением 1 мл 1 М раствора NaOH. Не проводя накопления регистрируют анодную ветвь, а затем катодную ветвь циклической вольтамперной кривой фонового электролита при скорости развертки 100 мВ/с, начиная с потенциала минус 1,0 и до плюс 1,0 В. На анодной ветви вольтамперной кривой фонового электролита не наблюдается максимум в диапазоне потенциалов от 0,3 до 0,6 В.

Затем добавляют 0,02 мл аттестованной смеси глутатиона концентрации 1·10^-12 моль/дм³ и не проводя накопления регистрируют анодную ветвь, а затем катодную ветвь циклической вольтамперной кривой фонового электролита при скорости развертки 100 мВ/с, начиная с потенциала минус 1,0 и до плюс 1,0 В. На анодной ветви вольтамперной кривой фонового электролита наблюдается максимум в диапазоне потенциалов от 0,3 до 0,6 В. (относительно нас.х.э.).

Делают 0,02 мл добавку аттестованной смеси глутатиона и снова регистрируют аналитический сигнал. По разнице высоты анодного максимума пробы и добавки вычисляют концентрацию глутатиона в растворе.

Таким образом, впервые установлена способность количественного определения глутатиона по анодным максимумам.

Предложенный способ прост, не используются токсические вещества из-за их отрицательного физиологического действия. Способ может быть применен в любой химической лаборатории, имеющей компьютеризированные анализаторы типа ТА или полярограф. Предложенный способ может быть использован для определения глутатиона в водных растворах.

Способ определения глутатиона в модельных водных растворах методом циклической вольтамперометрии на графитовом электроде, модифицированном коллоидными частицами серебра