Изобретение относится к санитарной и клинической микробиологии и может быть использовано для обнаружения и учета Е.coli и колиформных бактерий в воде, пищевых продуктах, клиническом материале и т.д.
Ведущими зарубежными фирмами выпускаются лактозный агар с тергитолом 7, либо Тергитол 7 агар на основе пептона или смеси панкреатических гидролизатов тканей животных и казеина, дрожжевого экстракта, мясного экстракта и лактозы, а так же содержат Тергитол 7, агар и индикатор - бромтимоловый синий Merck «Микробиология, 2004/2005, стр.168), HiMedia (HiMedia Laboratories Pvt. Limited (Индия), 1993, стр.223), Fluka (Scientific research 2003/2004, стр.1483), ООО «ГЕМ» (Среды бактериологические. Каталог 2009-2010, стр.88).
Недостатком коммерческих сред является сложность приготовления: требуется раздельная стерилизация базовой среды автоклавированием и стерилизация раствора 2,3,5-трифенилтетразолия хлорид (ТТХ) методом мембранной фильтрации, т.к. ТТХ при повышенных температурах разрушается, что приводит к отсутствию дифференциации в отношении лактозоотрицательных, но восстанавливающих ТТХ бактерий.
В России нет коммерческой сухой питательной среды для обнаружения и учета Е.coli и колиформных бактерий с тергитолом 7. ГОСТ Р 52426-2005 (ИСО 9308-1:2000) «Вода питьевая», часть 1 « Метод мембранной фильтрации» регламентирует для обнаружения и количественного учета Е.coli и колиформных бактерий использование Лактозного ТТХ агара с гептадецилсульфатом натрия (среда с тергитолом 7) - лабораторного приготовления. Компонентное содержание в г/л представлено в табл.1.
Недостатком лактозного ТТХ агара с гептадецилсульфатом натрия (среда с тергитолом 7) лабораторного изготовления является сложность в приготовлении включающая раздельную подготовку базовой среды, растворов гептадецилсульфата натрия и 2,3,5-трифенилтетразолиум хлорида (ТТХ) с последующей раздельной стерилизацией и приготовление среды полного состава с соблюдением правил асептики, нестандартность.
Наиболее близкой к предлагаемой дифференциально-диагностической питательной среде для обнаружения и учета Е.coli и колиформных бактерий (лактозному агару с тергитолом 7) является селективная дифференциальная среда для выделения и учета Е.coli и колиформных бактерий в воде методом мембранной фильтрации лактозный агар с тергитолом 7 и ТТХ фирмы Merck, которая состоит из следующих компонентов, г/л:
Лактоза |
20,0 |
Пептон |
10,0 |
Дрожжевой экстракт |
6,0 |
Мясной экстракт |
5,0 |
Бромтимоловый синий |
0,05 |
Тергитол 7 |
0,1 |
Агар |
12,7 |
|
Дополнительно готовится стерильный раствор 2,3,5-трифенилтетразолия хлорида (ТТХ), который затем вносится в базовую стерильную среду.
Недостатком этой среды является сложность приготовления и наличие специального оборудования для стерилизации мембранной фильтрацией.
До настоящего времени в России, в связи с отсутствием отечественной коммерческой среды с тергитолом 7, контроль воды методом мембранной фильтрации для обнаружения и учета Е.coli и колиформных бактерий проводят на среде Эндо, применение которой предусмотрено до 2010 г., на период, необходимый для накопления статистических данных по применению среды с тергитолом 7. (3)
Техническим результатом изобретения является создание отечественной сухой питательной среды, простота приготовления с сохранением стерильности не менее 10 суток, стабильность результатов по ростовым и дифференцирующим свойствам.
Технический результат достигается сбалансированностью компонентного состава среды, которая содержит панкреатический гидролизат рыбной муки, высушенный с расчетным количеством тергитола 7, дрожжевой экстракт, лактозу, 2,3,5-трифенилтетразолия хлорид (ТТХ), бромтимоловый синий, натрий углекислый, агар микробиологический и дополнительно натрий додецилсульфат при следующем соотношении компонентов, г/л:
Панкреатический гидролизат рыбной муки с |
|
тергитолом 7 (ПГРМ с тергитолом 7) |
5,5-6,7 |
Дрожжевой экстракт |
4,0-6,0 |
Д(+)-лактоза, 1-водная |
8,0-12,0 |
Бромтимоловый синий |
0,07-0,09 |
Натрий додецилсульфат |
0,08-0,12 |
2,3,5-трифенилтетразолия хлорид |
0,023-0,026 |
Натрий углекислый |
0,14-0,16 |
Агар микробиологический |
8,0-14,0 |
pH |
7,4±0,2 |
|
Отличием предлагаемой среды от прототипа является использование в качестве белковой основы панкреатического гидролизата рыбной муки с тергитолом 7 (ПГРМ с тергитолом 7), дополнительное содержание натрия додецилсульфата и отсутствие мясного экстракта. Количественное соотношение компонентов питательной среды, ее рН, обеспечивают среде сохранение стерильности готовой среды не менее 10 суток, ингибирующий эффект в отношении грамположительных микроорганизмов, хороший рост и первичную дифференциацию колиформных бактерий и Е.coli.
Пример 1. Для приготовления среды на стадии производства жидкого ПГРМ, в осветленный панкреатический гидролизат рыбной муки вносится тергитол 7 из расчета 0,1 г тергитола 7 на 6,0 г ПГРМ в пересчете на сухое вещество и высушивается на сушильной установке с виброкипящим слоем А1-ФМУ. Берут навески следующих ингредиентов, г/л:
Панкреатический гидролизат рыбной муки с |
|
тергитолом 7 (ПГРМ с тергитолом 7) |
5,5 |
Дрожжевой экстракт |
4,0 |
Д(+)-лактоза, 1-водная |
8,0 |
Бромтимоловый синий |
0,07 |
Натрий додецилсульфат |
0,08 |
2,3,5-трифенилтетразолия хлорид |
0,023 |
Натрий углекислый |
0,14 |
Агар микробиологический |
8,0 |
рН |
7,4±0,2 |
|
Навески размешивают в 1 л дистиллированной воды, нагревают до кипения и кипятят при постоянном перемешивании в течение 3-4 мин на медленном огне до полного расплавления агара. Охлаждают до температуры 40-50°С и разливают в чашки Петри. Перед посевом чашки подсушивают при комнатной температуре, соблюдая правила асептики в течение 40-60 мин.
Предлагаемая среда обеспечивает рост следующих тест-штаммов при посеве по 0,1 мл микробной взвеси из разведения 10-6:
Escherichia coli 3912/41 (055:К59),
Escherichia coli ATCC 25922,
Klebsiella pneumoniae 418,
Shigella sonnei «S-form,
Salmonella typhimurium 79
и ингибицию S.aureus Wood-46 из разведения 10-3 через 20-24 ч инкубации при температуре (37±1)°С.
При этом колонии Е.coli 3912/41(055:К59), Е.coli АТСС 25922 - круглые желто-оранжевого цвета с желтой зоной, диаметром 2,0-3,0 мм; колонии К.pneumoniae 418 - круглые, слизистые, оранжевого цвета, диаметром 2,5-4,0 мм; колонии S.sonnei «S-form» - круглые, красно-коричневого цвета с синей зоной, диаметром 1,5-2,5 мм; колонии S. typhimurium 79 - красно-коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной, диаметром 2,0-3,5 мм.
Дифференциально-диагностические свойства проверяют методом посева смеси равных объемов тест-штаммов Е.coli 3912/41(055:К59) и S. typhimurium 79 из разведения 10-6.
Ингибирующие свойства среды проверяют посевом 0,1 мл микробной взвеси тест-штамма S. aureus Wood-46 из разведения 10-3.
Результаты биологического контроля представлены в табл.2
Пример 2. Среду готовят в соответствии с примером 1.
Панкреатический гидролизат рыбной муки с |
|
тергитолом 7 (ПГРМ с тергитолом 7) |
6,1 |
Дрожжевой экстракт |
5,0 |
Д(+)-лактоза, 1-водная |
10,0 |
Бромтимоловый синий |
0,08 |
Натрий додецилсульфат |
0,1 |
2,3,5-трифенилтетразолия хлорид |
0,025 |
Натрий углекислый |
0,15 |
Агар микробиологический |
11,0 |
рН |
7,4±0,2 |
|
Результаты биологического контроля представлены в таблице 2 и аналогичны результатам проверки по примеру 1.
Пример 3. Среду готовят в соответствии с примером 1.
Панкреатический гидролизат рыбной муки с |
|
тергитолом 7 (ПГРМ с тергитолом 7) |
6,7 |
Дрожжевой экстракт |
6,0 |
Д(+)-лактоза, 1-водная |
12,0 |
Бромтимоловый синий |
0,09 |
Натрий додецилсульфат |
0,12 |
2,3,5-трифенилтетразолия хлорид |
0,026 |
Натрий углекислый |
0,16 |
Агар микробиологический |
14,0 |
pH |
7,4±0,2 |
|
Результаты биологического контроля представлены в таблице 2 и аналогичны результатам проверки по примеру 1.
Пример 4. Среду готовят в соответствии с примером 1.
Панкреатический гидролизат рыбной муки с |
|
тергитолом 7 (ПГРМ с тергитолом 7) |
4,9 |
Дрожжевой экстракт |
3,0 |
Д(+)-лактоза, 1-водная |
6,0 |
Бромтимоловый синий |
0,06 |
Натрий додецилсульфат |
0,06 |
2,3,5-трифенилтетразолия хлорид |
0,023 |
Натрий углекислый |
0,13 |
Агар микробиологический |
5,0 |
рН |
7,4±0,2 |
|
Нарушение количественного соотношения ингредиентов среды ведет к резкому ухудшению ростовых, а следовательно, и дифференцирующих свойств среды.
Результаты биологического контроля представлены в таблице 2.
Пример 5. Среду готовят в соответствии с примером 1.
Панкреатический гидролизат рыбной муки с |
|
тергитолом 7 (ПГРМ с тергитолом 7) |
7,3 |
Дрожжевой экстракт |
7,0 |
Д(+)-лактоза, 1-водная |
14,0 |
Бромтимоловый синий |
0,1 |
Натрий додецилсульфат |
0,14 |
2,3,5-трифенилтетразолия хлорид |
0,027 |
Натрий углекислый |
0,17 |
Агар микробиологический |
17,0 |
рН |
7,4±0,2 |
|
Результаты биологического контроля представлены в таблице 2 и показывают ухудшение ростовых и дифференцирующих свойств среды.
Из таблицы видно, что предлагаемая питательная среда приготовленная в соответствии с примерами 1, 2, 3, обладает хорошими ростовыми свойствами, высокой точностью дифференциации Е.coli и колиформных бактерий от других энтеробактерий, подавляет рост стафилококка.
Изменение количественного соотношения компонентов среды ведет к нарушению биологических показателей качества предложенной среды.
Так, в случае приготовления среды в соответствии с примерами 4, 5 наблюдается резкое снижение чувствительности, изменение диаметра и морфологии колоний энтеробактерий.
Таким образом, по сравнению со средой-прототипом предлагаемая питательная среда имеет ряд преимуществ:
- для ее изготовления впервые разработана сухая питательная основа, содержащая панкреатический гидролизат рыбной муки с тергитолом 7;
- проста в приготовлении, не требует стерилизации автоклавированием, стерилизуется кипячением в течение 3-4 мин и может быть использована в течение 10-12 суток при условии хранения при температуре 2-8°С, при этом сохраняет дифференцирующие свойства в отношении лактозоотрицательных, но восстанавливающих ТТХ бактерий, которые окрашиваются в красно-коричневый цвет;
- не требует дробного внесения компонентов и отдельной стерилизации гепта-децилсульфата натрия (тергитола 7) автоклавированием в течение 15 мин при температуре 121°С и раствора 2,3,5-трифенилтетразолия хлорид (ТТХ) методом мембранной фильтрации;
- не требует наличия специального оборудования и расходных материалов для стерилизации компонентов методом мембранной фильтрации;
- на предлагаемой среде энтеробактерий через 20 ч инкубации посевов при температуре (37±1)°С формируют колонии большего диаметра, что обеспечивает более точную дифференциацию и, как следствие, достоверную интерпретацию результатов.
Таблица 1. |
Компонентный состав питательных сред различных фирм производителей, г/л |
№ п/п |
Компонентный состав питательных сред |
Лактозный ТТХ агар с гептадецил-сульфатом натрия (среда с Тергито-лом-7) ГОСТ Р 52426-2005; ИСО 9308-1,2000 |
Лактозный агар с Тергито-лом-7 и ТТХ Merck |
Тергитол-7 агар HiMedi» |
Лактозный ТТС агар с Тергито-лом-7 ООО «ГЕМ» |
Tergitol@-7 agar Fluka |
1 |
Пептон |
10,0 |
10,0 |
5,0 |
10,0 |
5,0 |
2 |
Пептический гидролизат тканей животных |
- |
- |
- |
- |
- |
3 |
Панкреатический гидролизат казеина |
- |
- |
- |
- |
- |
4 |
Мясной экстракт |
5,0 |
5,0 |
- |
5,0 |
- |
5 |
Дрожжевой эксракт |
6,0 |
6,0 |
3,0 |
6,0 |
3,0 |
6 |
Лактоза |
20,0 |
20,0 |
10,0 |
20,0 |
10,0 |
7 |
Бромтимоловый синий |
0,05 |
0,05 |
0,025 |
0,05 |
|
8 |
Агар |
15,0-20,0 |
12,7 |
15,0 |
12,0 |
15,0 |
9 |
Тергитол-7 |
5 мл 0,2%-ного раствора на 100 мл |
0.1 |
0,1 |
0,1 |
0,1 |
10 |
ТТХ |
5 мл 0,05%-ного раствора на 100 мл |
0,025 |
|
0,025 |
|
|
Таблица 2. |
Сравнительная характеристика биологических показателей Лактозного ТТХ агара с тергитолом 7 |
п/п |
Наименование тест-штаммов |
Предлагаемая среда по примеру |
Среды сравнения |
Контроль роста тест-штаммов на ГРМ агаре |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
Lactose TTC agar with Tergitol 7, Merck |
Tergitol-7 Agar, Fluka |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
1 |
E.coli 055 3912/41 |
74 |
81 |
72 |
65 |
34 |
77 |
80 |
85 |
2,5-3,0 |
2,5-3,0 |
2,5-3,0 |
2,3-2,5 |
1,0-1,5 |
2,2-2,5 |
1,4-1,8 |
2,0-3,0 |
Круглые, желто-оранжевые с желтой зоной вокруг |
Круглые, желто-оранжевые с желтой зоной вокруг |
Круглые, желто-оранжевые с желтой зоной вокруг |
Круглые, светло-желтые со слабой желтой зоной вокруг |
Круглые, желто-оранжевые с желтой зоной вокруг |
Круглые, желто-оранжевые с желтой зоной вокруг |
Круглые, желто-оранжевые с желтой зоной вокруг |
Круглые, бесцветные, гладкие |
2 |
E.coliATCC 25922 |
82 |
79 |
85 |
36 |
28 |
68 |
81 |
96 |
2,5-3,2 |
2,5-3,2 |
2,5-3,2 |
2,0-2,7 |
0,8-1,4 |
2,5-3,0 |
1,4-1,6 |
2,2-2,8 |
Круглые, желто-оранжевые с желтой зоной вокруг |
Круглые, желто-оранжевые с желтой зоной вокруг |
Круглые, желто-оранжевые с желтой зоной вокруг |
Круглые, светло-желтые со слабой желтой зоной вокруг |
Круглые, желто-оранжевые с желтой зоной вокруг |
Круглые, желто-оранжевые с желтой зоной вокруг |
Круглые, желто-оранжевые с желтой зоной вокруг |
Круглые, бесцветные,гладкие |
3 |
S.enteritidis 11276 |
60 |
65 |
63 |
60 |
60 |
60 |
64 |
71 |
2.3-2,7 |
2,3-2,7 |
2,3-2,7 |
2,3-2,7 |
1,2-1,4 |
3,0-3,5 |
1,4-2,0 |
1,2-1,5 |
красно-коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной |
красно-коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной |
красно-коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной |
Бледно-коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной |
красно-коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной |
красно-коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной |
красно-коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной |
Круглые, бесцветные, гладкие |
|
Продолжение таблицы 2 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
4 |
S.typhimurium |
69 |
75 |
65 |
39 |
26 |
72 |
84 |
96 |
79 |
2,5-3,5 |
2,8-3,5 |
2,5-3,2 |
3,0-4,0 |
1,5-2,0 |
2,5-3,0 |
1,8-2,2 |
2,0-3,0 |
красно- |
красно- |
красно- |
Светло- |
красно- |
красно- |
красно- |
коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной |
коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной |
коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной |
коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной |
коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной |
коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной |
коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной |
Круглые, бесцветные, гладкие |
5 |
К.pneumonia 418 |
53 |
58 |
59 |
43 |
26 |
49 |
61 |
53 |
3,0-4,0 |
3,0-4,0 |
3,0-3,5 |
2,5-4,0 |
3,0-3,5 |
2,5-3,7 |
1,8-2,0 |
3,0-3,5 |
Круглые, слизистые, оранж., слабая желтая зона |
Круглые, слизистые, оранж., слабая желтая зона |
Круглые, слизистые, оранж., слабая желтая зона |
Круглые, слизистые, желтые, слабая желтая зона |
Круглые, слизистые, желтые, слабая желтая зона |
Блестящие, слизистые, оранж., желтая зона,S -ф |
Блестящие, слизистые, оранж., |
Круглые, слизистые, бесцветные |
6 |
К.oxytoca 2102 |
64 |
68 2,3-2,7 Круглые, желтые с желтой зоной вокруг |
59 2,3-2,7 Круглые, желтые с желтой зоной вокруг |
24 2,3-2,7 Круглые, светло-желтые со слабой желтой зоной вокруг |
14 |
61 |
48 |
72 |
2,3-2,7 |
2,3-2,7 |
2,0-2,3 |
2,5-3,2 |
2,5-3,0 |
Круглые, желтые с желтой зоной вокруг |
Круглые, желтые с желтой зоной вокруг |
Круглые, желто-оранжевые с желтой зоной вокруг |
Круглые, желто-оранжевые с желтой зоной вокруг |
Круглые, слизистые, бесцветные |
|
Продолжение таблицы 2 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
7 |
K pneumonia 3534/51 |
46 |
52 |
43 |
26 |
16 |
45 |
42 |
63 |
3,0-4,0 |
3,0-4,0 |
3,0-4,0 |
3,0-4,5 |
1,5-2,5 |
3,0-3,5 |
2,0-2,5 |
2,5-3,5 |
Круглые, красно-коричневые с синей зоной вокруг |
Круглые, красно-коричневые с синей зоной вокруг |
Круглые, красно-коричневые с синей зоной вокруг |
Круглые, красно-коричневые с синей зоной вокруг |
Круглые, красно-коричневые с синей зоной вокруг |
Круглые, красно-коричневые с синей зоной вокруг |
Круглые, красно-коричневые с синей зоной вокруг |
Круглые, слизистые, бесцветные |
8 |
S.sonnei "S-form" |
58 |
55 |
52 |
25 |
15 |
45 |
43 |
64 |
2,0-2,5 |
2,0-2,5 |
2,0-2,5 |
2,0-3,0 |
1,0-1,5 |
3,5-3,7 |
1,6-2,0 |
|
Круглые, красно-коричневые с синей зоной вокруг |
Круглые, красно-коричневые с синей зоной вокруг |
Круглые, красно-коричневые с синей зоной вокруг |
Круглые, светло-коричневые со слабой синей зоной вокруг |
Круглые, красно-коричневые с синей зоной вокруг |
Круглые, красно-коричневые с синей зоной вокруг SR-форма |
Круглые, красно-коричневые с синей зоной вокруг SR-форма |
1,5-2,0 |
Круглые, бесцветные, гладкие |
9 |
С.freundii 101/57 |
51 |
57 |
53 |
53 |
53 |
48 |
51 |
56 |
1,6-1,8 |
1,6-1,8 |
1,6-1,8 |
1,2-1,5 |
0,8-1,2 |
1,8-2,0 |
1,2-1,5 |
|
Круглые, желто-оранжевые с желтой зоной вокруг |
Круглые, желто-оранжевые с желтой зоной вокруг |
Круглые, желто-оранжевые с желтой зоной вокруг |
Круглые, желтые - со слабой желтой зоной вокруг |
Круглые, желто-оранжевые с желтой зоной вокруг |
Круглые, желто-оранжевые с желтой зоной вокруг |
Круглые, желто-оранжевые с желтой зоной вокруг |
1,5-2,0 |
Круглые, слизистые, бесцветные |
|
Продолжение таблицы 2 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
10 |
P.aervginosa 27/99 |
48 |
46 |
50 |
38 |
18 |
22 |
30 |
59 |
1,2-2,0 |
1,2-2,0 |
1,2-2,0 |
0,8-1,6 |
1,2-2,0 |
1,6-2,5 |
0,6-1,0 |
2,0-3,0 |
красно-коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной |
красно-коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной |
красно-коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной |
светло-коричневого цвета с неровным краем и со слабой синей зоной |
красно-коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной |
красно-коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной R-форма |
красно-коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной R-форма |
Круглые, полупрозрачные, серо-зеленые |
11 |
P.mirabilis 3177 |
51 |
58 |
53 |
21 |
15 |
50 |
Нет роста |
Сплошное роение |
1,2-1,8 |
1,2-1,8 |
1,2-1,8 |
0,8-1,2 |
0,5-1,0 |
красно-коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной Очаговое роение |
красно-коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной |
красно-коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной |
красно-коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной |
Светло-коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной |
красно-коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной |
|
Сухая дифференциально-диагностическая питательная среда для обнаружения и учета Е.coli и колиформных бактерий, содержащая питательную основу, дрожжевой экстракт, лактозу, 2,3,5-трифенилтетразолия хлорид, бромтимоловый синий, агар микробиологический, отличающаяся тем, что в качестве питательной основы она содержит панкреатический гидролизат рыбной муки, высушенный с тергитолом 7 из расчета 0,1 г тергитола 7 на 6 г сухого панкреатического гидролизата рыбной муки, и дополнительно натрий додецилсульфат, натрий углекислый, при следующем количественном соотношении компонентов, г/л: