СУХАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ И УЧЕТА E.coli И КОЛИФОРМНЫХ БАКТЕРИЙ

Изобретение относится к санитарной и клинической микробиологии и может быть использовано для обнаружения и учета Е.coli и колиформных бактерий в воде, пищевых продуктах, клиническом материале и т.д.

Ведущими зарубежными фирмами выпускаются лактозный агар с тергитолом 7, либо Тергитол 7 агар на основе пептона или смеси панкреатических гидролизатов тканей животных и казеина, дрожжевого экстракта, мясного экстракта и лактозы, а так же содержат Тергитол 7, агар и индикатор - бромтимоловый синий Merck «Микробиология, 2004/2005, стр.168), HiMedia (HiMedia Laboratories Pvt. Limited (Индия), 1993, стр.223), Fluka (Scientific research 2003/2004, стр.1483), ООО «ГЕМ» (Среды бактериологические. Каталог 2009-2010, стр.88).

Недостатком коммерческих сред является сложность приготовления: требуется раздельная стерилизация базовой среды автоклавированием и стерилизация раствора 2,3,5-трифенилтетразолия хлорид (ТТХ) методом мембранной фильтрации, т.к. ТТХ при повышенных температурах разрушается, что приводит к отсутствию дифференциации в отношении лактозоотрицательных, но восстанавливающих ТТХ бактерий.

В России нет коммерческой сухой питательной среды для обнаружения и учета Е.coli и колиформных бактерий с тергитолом 7. ГОСТ Р 52426-2005 (ИСО 9308-1:2000) «Вода питьевая», часть 1 « Метод мембранной фильтрации» регламентирует для обнаружения и количественного учета Е.coli и колиформных бактерий использование Лактозного ТТХ агара с гептадецилсульфатом натрия (среда с тергитолом 7) - лабораторного приготовления. Компонентное содержание в г/л представлено в табл.1.

Недостатком лактозного ТТХ агара с гептадецилсульфатом натрия (среда с тергитолом 7) лабораторного изготовления является сложность в приготовлении включающая раздельную подготовку базовой среды, растворов гептадецилсульфата натрия и 2,3,5-трифенилтетразолиум хлорида (ТТХ) с последующей раздельной стерилизацией и приготовление среды полного состава с соблюдением правил асептики, нестандартность.

Наиболее близкой к предлагаемой дифференциально-диагностической питательной среде для обнаружения и учета Е.coli и колиформных бактерий (лактозному агару с тергитолом 7) является селективная дифференциальная среда для выделения и учета Е.coli и колиформных бактерий в воде методом мембранной фильтрации лактозный агар с тергитолом 7 и ТТХ фирмы Merck, которая состоит из следующих компонентов, г/л:

Дополнительно готовится стерильный раствор 2,3,5-трифенилтетразолия хлорида (ТТХ), который затем вносится в базовую стерильную среду.

Недостатком этой среды является сложность приготовления и наличие специального оборудования для стерилизации мембранной фильтрацией.

До настоящего времени в России, в связи с отсутствием отечественной коммерческой среды с тергитолом 7, контроль воды методом мембранной фильтрации для обнаружения и учета Е.coli и колиформных бактерий проводят на среде Эндо, применение которой предусмотрено до 2010 г., на период, необходимый для накопления статистических данных по применению среды с тергитолом 7. (3)

Техническим результатом изобретения является создание отечественной сухой питательной среды, простота приготовления с сохранением стерильности не менее 10 суток, стабильность результатов по ростовым и дифференцирующим свойствам.

Технический результат достигается сбалансированностью компонентного состава среды, которая содержит панкреатический гидролизат рыбной муки, высушенный с расчетным количеством тергитола 7, дрожжевой экстракт, лактозу, 2,3,5-трифенилтетразолия хлорид (ТТХ), бромтимоловый синий, натрий углекислый, агар микробиологический и дополнительно натрий додецилсульфат при следующем соотношении компонентов, г/л:

Отличием предлагаемой среды от прототипа является использование в качестве белковой основы панкреатического гидролизата рыбной муки с тергитолом 7 (ПГРМ с тергитолом 7), дополнительное содержание натрия додецилсульфата и отсутствие мясного экстракта. Количественное соотношение компонентов питательной среды, ее рН, обеспечивают среде сохранение стерильности готовой среды не менее 10 суток, ингибирующий эффект в отношении грамположительных микроорганизмов, хороший рост и первичную дифференциацию колиформных бактерий и Е.coli.

Пример 1. Для приготовления среды на стадии производства жидкого ПГРМ, в осветленный панкреатический гидролизат рыбной муки вносится тергитол 7 из расчета 0,1 г тергитола 7 на 6,0 г ПГРМ в пересчете на сухое вещество и высушивается на сушильной установке с виброкипящим слоем А1-ФМУ. Берут навески следующих ингредиентов, г/л:

Навески размешивают в 1 л дистиллированной воды, нагревают до кипения и кипятят при постоянном перемешивании в течение 3-4 мин на медленном огне до полного расплавления агара. Охлаждают до температуры 40-50°С и разливают в чашки Петри. Перед посевом чашки подсушивают при комнатной температуре, соблюдая правила асептики в течение 40-60 мин.

Предлагаемая среда обеспечивает рост следующих тест-штаммов при посеве по 0,1 мл микробной взвеси из разведения 10^-6:

Escherichia coli 3912/41 (055:К59),

Escherichia coli ATCC 25922,

Klebsiella pneumoniae 418,

Shigella sonnei «S-form,

Salmonella typhimurium 79

и ингибицию S.aureus Wood-46 из разведения 10^-3 через 20-24 ч инкубации при температуре (37±1)°С.

При этом колонии Е.coli 3912/41(055:К59), Е.coli АТСС 25922 - круглые желто-оранжевого цвета с желтой зоной, диаметром 2,0-3,0 мм; колонии К.pneumoniae 418 - круглые, слизистые, оранжевого цвета, диаметром 2,5-4,0 мм; колонии S.sonnei «S-form» - круглые, красно-коричневого цвета с синей зоной, диаметром 1,5-2,5 мм; колонии S. typhimurium 79 - красно-коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной, диаметром 2,0-3,5 мм.

Дифференциально-диагностические свойства проверяют методом посева смеси равных объемов тест-штаммов Е.coli 3912/41(055:К59) и S. typhimurium 79 из разведения 10^-6.

Ингибирующие свойства среды проверяют посевом 0,1 мл микробной взвеси тест-штамма S. aureus Wood-46 из разведения 10^-3.

Результаты биологического контроля представлены в табл.2

Пример 2. Среду готовят в соответствии с примером 1.

Результаты биологического контроля представлены в таблице 2 и аналогичны результатам проверки по примеру 1.

Пример 3. Среду готовят в соответствии с примером 1.

Результаты биологического контроля представлены в таблице 2 и аналогичны результатам проверки по примеру 1.

Пример 4. Среду готовят в соответствии с примером 1.

Нарушение количественного соотношения ингредиентов среды ведет к резкому ухудшению ростовых, а следовательно, и дифференцирующих свойств среды.

Результаты биологического контроля представлены в таблице 2.

Пример 5. Среду готовят в соответствии с примером 1.

Результаты биологического контроля представлены в таблице 2 и показывают ухудшение ростовых и дифференцирующих свойств среды.

Из таблицы видно, что предлагаемая питательная среда приготовленная в соответствии с примерами 1, 2, 3, обладает хорошими ростовыми свойствами, высокой точностью дифференциации Е.coli и колиформных бактерий от других энтеробактерий, подавляет рост стафилококка.

Изменение количественного соотношения компонентов среды ведет к нарушению биологических показателей качества предложенной среды.

Так, в случае приготовления среды в соответствии с примерами 4, 5 наблюдается резкое снижение чувствительности, изменение диаметра и морфологии колоний энтеробактерий.

Таким образом, по сравнению со средой-прототипом предлагаемая питательная среда имеет ряд преимуществ:

- для ее изготовления впервые разработана сухая питательная основа, содержащая панкреатический гидролизат рыбной муки с тергитолом 7;

- проста в приготовлении, не требует стерилизации автоклавированием, стерилизуется кипячением в течение 3-4 мин и может быть использована в течение 10-12 суток при условии хранения при температуре 2-8°С, при этом сохраняет дифференцирующие свойства в отношении лактозоотрицательных, но восстанавливающих ТТХ бактерий, которые окрашиваются в красно-коричневый цвет;

- не требует дробного внесения компонентов и отдельной стерилизации гепта-децилсульфата натрия (тергитола 7) автоклавированием в течение 15 мин при температуре 121°С и раствора 2,3,5-трифенилтетразолия хлорид (ТТХ) методом мембранной фильтрации;

- не требует наличия специального оборудования и расходных материалов для стерилизации компонентов методом мембранной фильтрации;

- на предлагаемой среде энтеробактерий через 20 ч инкубации посевов при температуре (37±1)°С формируют колонии большего диаметра, что обеспечивает более точную дифференциацию и, как следствие, достоверную интерпретацию результатов.