Результат интеллектуальной деятельности: РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Yarrowia lipolytica - ПРОДУЦЕНТ ФИТАЗЫ

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и касается штамма дрожжей Yarrowia lipolytica - продуцента фермента фитазы.

Фитазы катализируют гидролиз фитатов с отщеплением неорганического фосфата. Фитаты (мио-инозитол гексакисфосфаты), в виде которых растения запасают фосфор, практически не усваиваются организмом животных с однокамерным желудком и домашней птицей. Значительная доля неусвоенного фосфора, попадая в почву и водоемы, вызывает загрязнение окружающей среды. Кроме того, фитаты являются хелатирующими агентами и способны образовывать комплексы с дивалентными катионами, а также с белками, что снижает доступностиь белков и микроэлементов в кормах.

В связи с этим фитазы, отщепляющие фосфатные группы от фитатов, с успехом используются в животноводстве в качестве кормовой добавки, значительно повышая усвояемость фосфора.

Основными требованиями к препаратам фитаз, используемых на практике, являются высокая удельная активность, устойчивость к кратковременному (5-10 мин) действию высоких температур (60-80°С) в ходе гранулирования комбикормов, способность работать в физиологических условиях желудочно-кишечного тракта (температурный оптимум около 42°С, рабочий профиль в интервале рН 3-5).

Ниже приведены основные характеристики известных фитаз.

Фитаза phyA из Aspergillus niger [Appi Environ Microbiol., 1998, v.64, p.4446-4451] имеет оптимальную температуру работы 55°С, высокую термостабильность (не теряет активность после воздействия на нее температуры 70°С в течение 30 минут), способна работать в условиях низких рН в гастроэнтеральном тракте животных. На основе дрожжей Pichia pastoris были разработаны штаммы-продуценты фитазы phyA из Aspergillus niger [Arch Biochem Biophys, 1999, 364:83-90]. При культивировании указанных штаммов продукция фитазы достигает 64 Ед/мл культуральной жидкости, продуктивность составлят 593 Ед/(л·час). Полученная фитаза обладает низкой удельной актиностью 25-65 Ед/мг белка.

Фитаза Escherichia coli [Can J Microbiol, 2000, 46:59-71] имеет температурный оптимум, равный 60°С, и рН оптимум, равный 4,5. Продукция фитазы при культивировании бактерий Escherichia coli достигает уровня 650 Ед/мл культуральной жидкости. На основе актиномицетов Streptomyses lividans получены штаммы-продуценты, уровень продукции фитазы которых значительно выше, а именно 950 Ед/мл культуральной жидкости [Biotechnol Lett, 2003, 25:827-831].

Наибольшей удельной активностью 3000 Ед/мг среди изученных фитаз обладает фитаза phyA, выделенная из Citrobacter freundii [Биотехнология, 2003, №2, с.3-10]. Однако указанный фермент характеризуется низкой термостабильностью:

сохраняет 10% активности после прогрева в течение 10 минут при 60°С. При культивировании в колбах штамма Pichia pastoris продуцента phyA С.freundii фитазная активность в культуральной жидкости составляет 700 Ед/мл [RU 2388823].

Бактериальная фитаза phyA, выделенная из Obesumbacterium proteus [FEMS Microbiol Lett. 2004 Jul 15; 236(2):283-90] характеризуется удельной активностью, равной 310 Ед/мг. Фермент остается активным в широком диапазоне значений рН 1,5-6,5, оптимум рН - 4,9. Температурный оптимум фермента равен 45°С. При культивировании в колбах штамма Pichia pastoris продуцента phyA О.proteus фитазная активность в культуральной жидкости составляет 500 Ед/мл [RU 2388823].

В работе [Тезисы Международной школы-конференции "Генетика микроорганизмов и биотехнология", 2006 г., с 212-214] приведен сравнительный анализ экспрессии генов phyA Citrobacter freundii и phyA Obesumbacterium proteus в дрожжах Yarrowia lipolytica, а также выполнен сравнительный анализ термостабильности указанных фитаз в различных системах экспрессии: Y. lipolytica, Р. pastoris, E.coli.

Средняя фитазная активность в культуральной жидкости составляет 30 Ед/мл и 55 Ед/мл в случаях экспрессии генов фитаз С.freundii и О.proteus соответственно. Показано, что фитаза О.proteus более устойчива к кратковременному воздействию высоких температур по сравнению с фитазой С.freundii.

Приведенные данные позволяют считать, что фитаза О.proteus является перспективной для использования в дальнейших разработках.

Повышенный интерес к созданию высокоэффективных продуцентов фитаз на основе Yarrowia lipolytica связан с достаточно хорошей генетической изученностью этого объекта и тем, что данный вид дрожжей удобен для промышленной ферментации [FEMS Microbiology Reviews, 1997, vol. 19, pp.219-237].

Задачей заявляемого изобретения является расширение арсенала рекомбинантных микроорганизмов, продуцирующих фитазы.

Задача решена путем конструирования рекомбинантного штамма дрожжей Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3852 - продуцента фитазы.

Рекомбинантный штамм Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3852 получен из штамма Yarrowia lipolytica Polf (ATCC MYA-2613) посредством трансформации интегративной плазмидой, полученной на основе плазмиды pUC19, названной рmс-Ор и содержащей ген фитазы phyA Obesumbacterium proteus.

Полученный штамм Yarrowia lipolytica депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) по адресу 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, д.1 и имеет регистрационный номер ВКПМ Y-3852.

Штамм Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3852 характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки. Суточная культура в жидкой YPD среде (мас.%: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, глюкоза - 2, вода - остальное) представлена овальными, удлиненно-овальными, округлыми клетками размером 4,6-6,0×4,5-12,5 мкм. Почкование полярное или латеральное, на узком основании. К третьим суткам большинство клеток почкуются и образуют псевдомицелий.

Клетки хорошо растут на простых питательных средах. Колонии на мальто-агаре [J.A.Bamett et al. "Yeasts characteristics and identification", Cambridge, 1983] (возраст 1 неделя) кремового цвета, пастообразные, слегка приподнятые в центре, морщинистые, с фестончатым краем. Штрих на мальто-агаре непрерывный, плоский, блестящий, кремово-белого цвета, пастообразный, края ровные, со временем становится складчатым. Спор не образует.

Физиолого-биохимические признаки. Облигатный аэроб. Сахара не сбраживает. Ассимилирует: сахарозу, глюкозу, D-галактозу (медленно), L-сорбозу, D-рибозу, этанол, глицерин, эритрит, адонит, D-маннит, сорбит и молочную, янтарную, лимонную, глюконовую кислоты. Не ассимилирует: мальтозу, лактозу, целлобиозу, трегалозу, мелибиозу, раффинозу, мелицитозу, инулин, крахмал, D-ксилозу, L- и D- арабинозу, раммозу, дульцит, инозит, D-глюкозамин и глюкуроновую, 2-кетоглюконовую, 5-кетоглюконовую кислоты. Не ассимилирует нитраты. Не растет в безвитаминной среде, требует присутствия в среде тиамина, не требует биотина.

Оптимальное значение рН для роста 5,5-7,0. Не растет при 37°С. Максимальная температура роста 35°С. Разжижает желатин. Растет на алканах. Гидролизует мочевину.

Заявляемый штамм при выращивании в колбах способен продуцировать фитазу, с активностью до 900 Ед/мл культуральной жидкости.

Изобретение проиллюстрировано следующими фигурами графического изображения:

Фиг.1. Электрофореграмма очищенной фитазы в 12% ПААГ. Фиг.2. График зависимости активности фитазы от значения рН.

Получение и культивирование штамма Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3852 подтверждено следующими примерами.

Пример 1. Получение штамма Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3852.

Трансформацию Yarrowia lipolytica осуществляют методом электропорации. Штамм Yarrowia lipolytica Polf (ATCC MYA-2613), используемый для трансформации, предварительно комплементируют по гену LEU2. Для этого штамм Polf трансформируют плазмидой pNB268 (ATCC 69355) линеаризованной эндонуклеазой Mlul. Трансформанты отбирают на среде YNB (Himedia) с добавлением глюкозы (2 мас.%) и урацила (0,01 мас.%). Фенотип трансформантов подтверждают рассевом на той же среде.

В качестве ДНК при трансформации полученного штамма Yarrowia lipolytica Polf(leu+) используют 1 мкг ДНК, полученной после экстракции из агарозного геля большего из фрагментов, образованных при обработке плазмиды рmс-ОР эндонуклеазой рестрикции NotI. Селекцию трансформантов ведут по комплементации ауксотрофности по урацилу на агаризованной минимальной среде YNB (Himedia) с добавлением глюкозы (2 мас.%).

Фитазную активность трансформантов первоначально оценивают в чашечном тесте с добавлением фитата кальция по зонам гидролиза. В тесте используют агаризованную среду LA (мас.%: дрожжевой экстракт - 0,5, пептон - 1, агар - 2, вода - остальное) с добавлением глюкозы (2 мас.%) и фитата кальция (2 мас.%). В качестве контроля используют штамм Yarrowia lipolytica Polf с комплементированной ауксотрофностью по лейцину.

15 трансформантов, показавших наибольшее соотношение диаметра зоны гидролиза к диаметру колонии на чашках с фитатом, культивируют в жидкой среде в пробирках. Ферментацию проводят при 30°С на качалке в питательнй среде LB (мас.%: дрожжевой экстракт - 0,5, пептон - 1, вода - остальное) с добавлением глюкозы (7 мас.%) в пробирках (50 мл) с рабочим объемом 10 мл. Посев осуществляют бактериологической петлей. Ферментацию продолжают в течение 5 суток.

Фитазную активность определяют по накоплению в реакционной смеси свободного фосфат-иона, детектируемого методом Фиске-Субарроу (J. Biol. Chem., 1925, vol.66, p:375-400). За единицу фитазной активности принимают количество фермента, способного высвободить 1 μмоль неорганического фосфата из фитата натрия в минуту при 37°С и рН 4.

По результатам ферментации отобран заявляемый штамм ВКПМ Y-3852, который является трансформантом №32 Yarrowia lipolytica Polf(leu+;pmc-OP) и при культивировании в пробирках позволяет получать фитазу с активностью 570 Ед/мл культуральной жидкости.

Пример 2. Культивирование штамма Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3852

Культуру выращивают при 30°С в течение 1 суток в чашках Петри с агаризованной средой YPD (мас.%: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, глюкоза - 2, агар - 2, вода - остальное).

Инокулят (жидкую посевную культуру) выращивают в колбах (750 мл) с 50 мл жидкой питательной среды для инокулята YPD (мас.%: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, глюкоза - 2, вода - остальное).

Засев колб осуществляют посевной культурой, выращенной на твердой агаризованной среде YPD. Колбы инкубируют на качалке (250 об/мин) при 30°С в течение 24 ч.

В колбу с 45 мл ферментационной среды YPD (мас.%: дрожжевой экстракт - 1,1, пептон - 2,2, глюкоза - 2,2, вода - остальное) засевают 5 мл инокулята.

Культивирование осуществляют на качалке со скоростью 250 об/мин при температуре 30°С. Пробы отбирают каждый день стерильно по 1 мл для определения концентрации биомассы, фитазной активности в культуральной жидкости, контроля стерильности. Ферментацию проводят в течение 3 суток. При ферментации в колбах в питательной среде штамм ВКПМ Y-3852 синтезирует фитазу с активностью 900 ЕДд/мл культуральной жидкости.

Пример 3. Очистка белка и определение удельной активности фитазы.

После окончания ферментации биомассу осаждают цетрифугированием, при этом доля нативного раствора в культуральной жидкости составляет 60-75%. Белок очищают методом ультрафильтрации через мембрану 30 кДа (Владисарт, Россия), нативный раствор концентрируют в 10 раз.

Количество белка в концентрате определяют методом Бредфорда (Anal. Biochem. 72, 248-254, 1976), фитазную активность определяют методом Фиске-Субарроу. Удельная активность фитазы составляет 1650 Ед/мг белка.

На фиг.1 приведена электрофореграмма очищенной фитазы в 12% полиакриламидном геле. Молекулярная масса очищенного белка соответствует массе PhyA Obesumbacterium proteus [FEMS Microbiol Lett. 2004 Jul 15;236(2):283-90] и равна 45 кДа.

Пример 4. Определение термостабильности фитазы.

Образец фитазы, полученный после ультрафильтрации, переносят в тонкостенные пробирки (SSI, кат №3320, США) по 50 мкл. Пробирки прогревают в течение 5 минут при различных температурах, используя ДНК-амплификатор с функцией градиента температур и подогреваемой крышкой для пробирок (Eppendorf, Mastercycler gradient, Германия). После прогрева пробирки с исследуемыми образцами переносят в ледяную баню для быстрого охлаждения и инкубируют в течение 30 минут с целью ренатурации белка.

Относительная остаточная фитазная активность составляет 86%, 47%, 12% и 7% после прогрева при 55°С, 60°С, б5°С и 70°С соответственно.

Пример 5. Определение рН-оптимума фитазы. Изучение влияния значения рН на активность фитазы выполняют согласно работе (FEMS Microbiol Lett. 2004 Jul 15; 236(2):283-90). Полученные результаты приведены на фиг.2.

Фитаза, синтезируемая штаммом BKFIM-3852, имеет оптимум активности при рН равном 4,5, также остается активной в широком диапазоне рН 2,0-6,5.