Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОЧИСТКИ ПОЧВЫ ОТ УГЛЕВОДОРОДНЫХ ЗАГРЯЗНЕНИЙ

Изобретение относится к области биотехнологии и экологии и может быть использовано для очистки почвы от широкого спектра нефтепродуктов и газового конденсата.

Очистка почвы от углеводородных загрязнений является актуальной и сложной задачей защиты окружающей среды. Для ликвидации углеводородных загрязнений в настоящее время успешно применяются различные технологии, которые можно условно разделить на механические, физические, химические, биотехнологические и фитомелиоративные. Наиболее перспективным направлением решения этой задачи является очистка загрязненных почв с помощью биологических препаратов (биодеструкторов), при обработке которыми происходит разрушение углеводородов нефти за счет интродукции в загрязненную экосистему нефтеокисляющих микроорганизмов. Известны биопрепараты, состоящие из одной или более культур микроорганизмов, входящих в состав препаратов.

Известен способ рекультивации почв (патент РФ №2077397, B09C 1/10, опубл. 20.04.1997) путем обработки почвы бактериальным препаратом на основе природного штамма бактерий Bacillus species ВНИИСХМ 132.

Известен способ очистки почвы от нефти и нефтепродуктов (патент РФ №2419089, B09C 1/10, опубл. 20.09.2011) аэробными нефтеокисляющими бактериями Mycobacterium sp.5 KB, в котором для интенсификации процесса очистки используют азот-фосфорно-калийное минеральное удобрение и рыбную муку.

Известен способ очистки нефтезагрязненых почв и почвогрунтов (патент РФ №2398640, B09C 1/10, опубл. 10.09.2010), в котором в загрязненную почву вносят избыточный активный ил сооружений биологической очистки нефтесодержащих сточных вод в смеси с биопрепаратом «Дестройл».

Известен способ очистки нефтезагрязненных подземных вод (патент РФ №2312719, B09C 1/10, опубл. 20.12.2007), в котором используют консорциум штаммов углеводородокисляющих бактерий Pseudomonas aeruginosa НД К3-1 и Pseudomonas fluorescens НД К3-2 для деструкции нефти.

Одним из существенных недостатков способов очистки почвы от углеводородных загрязнений с помощью биопрепаратов является длительность процесса очистки от 1 до 5 месяцев, а при больших концентрациях загрязнителя длительность процесса очистки составляет 2-3 летних сезона.

При использовании химических технологий очистки почвы от нефтепродуктов процесс очистки протекает в течение минут, но эти технологии часто сопровождаются повторным загрязнением окружающей среды продуктами химических реакций, которые по своему воздействию на окружающую среду могут оказаться более вредными, чем углеводороды.

Наиболее «безопасными» с этой точки зрения являются технологии с использованием пероксидных соединений, в процессе которых не появляются вредные продукты химических реакций.

Известен способ очистки загрязненного нефтью и нефтепродуктами грунта (патент РФ №2184626, B09C 1/02, опубл. 10.07.2002), включающий смешивание грунта с подогретой до 70°-75°C водой, введение пероксидного соединения, перемешивание смеси и отделение нефтезагрязнения. В качестве пероксидного соединения используют пероксосольват натрия Na₂CO₃ 1,5 H₂O₂ в количестве 20-50 г/л. Недостатком известного способа является трудоемкость его осуществления и высокая стоимость, обусловленные необходимостью выемки грунта, его транспортировки, нагрева воды почти до кипения, утилизации нефтезагрязнения и возврата грунта к месту выемки. Кроме того, возникает необходимость использования установки для отмывки нефтезагрязненного грунта.

Наиболее близким аналогом к предлагаемому способу (прототипом) является способ рекультивации отбеливающей земли, загрязненной нефтепродуктами (патент РФ №2183142, B09C 1/10, опубл. 10.06.2002), в котором для активации процесса биодеградации нефтепродуктов в почве используют активный ил биологических очистных сооружений с добавками оксигенных соединений: суперфосфата или перекиси водорода, взятых в количестве, масс.%: 6,4 и 11,3 соответственно, по отношению к активному илу. Недостатком указанного способа является низкая эффективность очистки от углеводородов в результате одновременного внесения в почву любых микроорганизмов и перекиси водорода, взятой в указанном количестве, что приводит к резкому уменьшению количества живых клеток. Перекись водорода является очень сильным окислителем и способна разрушать оболочку микроорганизмов, что ведет к гибели клеток и, как следствие, к снижению скорости окисления углеводородов и увеличению времени очитски. Нами проведено исследование влияния количества перекиси водорода на жизнеспособность микроорганизмов, для чего был проведен эксперимент по определению количества жизнеспособных клеток Rhodococcus sp. ВКПМ Ac-1258 в процессе очистки почвы, загрязненной дизельным топливом в количестве 10% от массы почвы. В загрязненную почву внесли суспензию микроорганизмов Rhodococcus sp. ВКПМ Ас-1258 в количестве 0,2% от массы дизельного топлива. Количество живых клеток микроорганизмов в почве составило 2,3×10⁶ кл/г. Затем внесли в почву 30%-ный водный раствор перекиси водорода, содержащего активное вещество (перекись водорода) в количестве 3% от массы загрязнителя. Через три часа после внесения перекиси водорода количество живых клеток микроорганизмов составило 1,7×10⁵ кл/г, а через один, два, три дня 8,4×10⁴ кл/г, 3,5×10⁴ кл/г, 3,7×10⁴ кл/г соответственно.

Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является разработка способа очистки почвы от углеводородных загрязнений, сочетающего в себе две технологии очистки: химическую, с применением пероксидальных соединений, и биотехнологическую, с применением углеводородокисляющих микроорганизмов.

Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является повышение эффективности очистки почвы от углеводородных загрязнений за счет увеличения скорости и сокращения времени очистки, а также за счет расширения спектра утилизируемых углеводородов. Дополнительный технический результат заключается в повышении экологической безопасности и упрощении процесса очистки почвы от углеводородных загрязнений.

Указанный технический результат достигается за счет того, что в предлагаемом способе очистки почвы от углеводородных загрязнений путем внесения в очищаемую почву углеводородокисляющих микроорганизмов и пероксидного соединения очистку почвы осуществляют поэтапно. На первом этапе очистки в очищаемую почву вносят пероксидное соединение в количестве от 3% до 10% от массы углеводородного загрязнения, на втором этапе очистки в очищаемую почву вносят углеводородокисляющие микроорганизмы с одновременным внесением минеральной питательной среды, причем второй этап очистки осуществляют не ранее, чем через три дня после первого этапа.

В качестве пероксидного соединения используют или перекись водорода, или пероксид кальция в виде водных растворов. Необходимый объем упомянутых растворов содержит активное вещество (перекись водорода или пероксид кальция) в количестве 3%÷10% от массы загрязнителя. В качестве углеводородокисляющих микроорганизмов используют, например, консорциум штаммов Candida maltose ВКПМ Y-3446 и Dietzia maris ВКПМ Ac-1824. Минеральная питательная среда включает компоненты, содержащие азот, фосфор и калий.

Штамм дрожжей Candida maltosa ВКПМ Y-3446 выделен из образцов загрязненного углеводородами грунта селекционным путем. Способ размножения штамма - ферментация. Оптимальный состав минеральной среды для размножения штамма: H₃PO₄ (70%) - 2,6 г/л, KCl - 1,14 г/л, MgSO₄ - 0,55 г/л, FeSO₄×7H₂O - 0,045 г/л, ZnSO₄×7H₂O - 0,031 г/л, MnSO₄×7H₂O - 0,031 г/л, CuSO₄ - 0,004 г/л; при pH 4,0-4,2. В качестве источника углерода использовали парафин C₁₃÷C₁₇. Культивирование данного штамма проводили в колбах на круговых качалках при скорости вращения 220 об/мин и температуре окружающей среды 30°C.

Морфологические особенности штамма оценивали с помощью фазово-контрастной микроскопии.

Клетки данного штамма имеют форму от удлиненно-овальной до сильно вытянутой. Выделенный штамм образует колонии кремового цвета, матовые, шероховатые, с приподнятой серединой и неровными краями (на седьмые сутки культивирования на сусле агара).

Штамм непатогенный и нетоксичный. Культуру хранят в пробирках на скошенном агаризованном сусле при температуре 4°C. Жизнеспособность штамма поддерживается регулярным пересевом (2-3 раза в год) на среде сусла агара и жидкой минеральной среде, содержащей азот, фосфор, калий, магний, микроэлементы и н-парафины в качестве источника углерода и энергии.

Штамм бактерий Dietzia maris ВКПМ Ac-1824 получен автоселекционным путем в условиях длительной непрерывной ферментации в стерильных условиях штамма Rhodococcus sp. ВКПМ Ac-1258. Способ размножения штамма - ферментация. Оптимальный состав минеральной среды для размножения штамма: KNO₃ - 4,0 г/л, KH₂PO₄ - 0,4 г/л, Na₂HPO₄×12H₂O - 1,4 г/л, MgSO₄ - 0,8 г/л, FeSO₄×7H₂O - 0,045 г/л, ZnSO₄×7H₂O - 0,031 г/л, MnSO₄×7H₂O - 0,031 г/л, CuSO₄ - 0,004 г/л; при pH 7,0. В качестве источника углерода использовали парафин C₁₃÷C₁₇. Культивирование данного штамма проводили в колбах на круговых качалках при скорости вращения 220 об/мин и температуре окружающей среды 30°C.

Морфологические особенности штамма оценивали с помощью фазово-контрастной микроскопии.

Клетки данного штамма имеют коротко-овальную форму. Штамм образует колонии клеток розоватого цвета, гладкие, выпуклые, с ровным краем, диаметром 3 мк (на третьи сутки культивирования на L-агаре).

Штамм непатогенный и нетоксичный. Культура хранится в пробирках на скошенной агаризованной среде при температуре 4°C. Жизнеспособность штамма поддерживается регулярным пересевом (2-3 раза в год) на среде L-arapa и жидкой минеральной среде, содержащей азот, фосфор, калий, магний, микроэлементы и н-парафины.

Способ осуществляют следующим образом.

На первом этапе очистки в очищаемую почву вносят пероксидное соединение, в качестве которого используют, например, перекись водорода либо пероксид кальция, для чего готовят 30%-ный водный раствор перекиси водорода либо 20%-ный водный раствор пероксида кальция, расчитанные объемы которых содержат активное вещество в количестве 3%-10% от массы углеводородного загрязнения. Затем очищаемую почву перемешивают. Далее, не ранее, чем через три дня, в очищаемую почву вносят углеводородокисляющие микроорганизмы с одновременным внесением минеральной питательной среды. Культуры штаммов Candida maltosa ВКПМ Y-3446 и Dietzia maris ВКПМ Ac-1824, входящих в состав консорциума микроорганизмов, выращивают раздельно на жидкой питательной среде. При необходимости полученную биомассу высушивают, например в сушилке, для получения порошковой формы каждой из культур. Далее, в зависимости от вида загрязнений и условий применения биопрепарата (температура окружающей среды, pH очищаемой среды, источник азота), составляют консорциум из штаммов микроорганизмов. Перед применением порошковую форму биопрепарата разводят водным раствором минеральной питательной среды, включающей азот, фосфор, калий, после чего биопрепарат вносят в очищаемую почву в количестве 0,5%÷1% (сухого вещества) от массы загрязнителя.

Ниже приводятся примеры, подтверждающие высокую эффективность предлагаемого способа.

Пример 1. В качестве пероксидного соединения использовали 30%-ную перекись водорода.

В три прямоугольных лотка, каждый объемом 5 дм³, вносили по 4 кг субпесчаной почвы и по 400 г углеводородов (УГВ), после чего почву перемешивали. Далее вносили в очищаемую почву 40 г 30%-ного водного раствора перекиси водорода, который содержит 12 г активного вещества (3% от массы загрязнителя). Перемешивали почву. Затем вносили через один день в первый лоток, через два дня - во второй лоток, через три дня - в третий лоток суспензию биопрепарата в количестве 2 г сухого вещества и минеральное питание в количестве: [(NH₄)⁺+(NO₃)^-] - 200 мг/кг, P₂O₅ - 300 мг/кг, K₂O - 350 мг/кг, с последующим перемешиванием почвы. Влажность почвы поддерживали периодическим орошением на уровне 60% от влагоемкости почвы. Аэрацию осуществляли путем периодического перемешивания почвы, при этом поддерживали температуру 18°÷22°C. Содержание углеводородов в очищаемой почве определяли методом ИК спектрометрического определения.

Пример 2. Осуществляли так же, как пример 1, но перекись водорода в очищаемую почву вносили в количестве 10% от массы углеводородов.

Сравнительные данные по очистке почвы с использованием перекиси водорода приведены в таблицах 1 и 2.

Пример 3. В качестве пероксидного соединения использовали 20%-ный пероксид кальция.

В три прямоугольных лотка, каждый объемом 5 дм³, вносили по 4 кг субпесчаной почвы и по 400 г углеводородов, после чего почву тщательно перемешивали. Далее вносили в очищаемую почву 60 г 20%-ного водного раствора пероксида кальция, который содержит 12 г активного вещества (10% от массы углеводородного загрязнения), с последующим перемешиванием почвы. Затем вносили через один день в первый лоток, через два дня - во второй лоток, через три дня - в третий лоток суспензию биопрепарата в количестве 2 г сухого вещества и минеральное питание в количестве: [(NH₄)⁺+(NO₃)^-] - 200 мг/кг, P₂O₅ - 300 мг/кг, K₂O - 350 мг/кг, с последующим перемешиванием почвы. Влажность почвы поддерживали периодическим орошением на уровне 60% от влагоемкости почвы. Аэрацию осуществляли путем периодического перемешивания почвы, при этом поддерживали температуру 18°÷22°C. Содержание углеводородов в очищаемой почве определяли методом ИК спектрометрического определения.

Пример 4. Осуществляли так же, как пример 3, но пероксид кальция в очищаемую почву вносили в количестве 10% от массы углеводородов.

Сравнительные данные по очистке почвы с использованием пероксида кальция приведены в таблицах 3 и 4.

Преимуществами предлагаемого способа являются:

- быстрое окисление на первом этапе очистки части углеводородов и разрушение сложноокисляемых микробиологическим путем полициклических ароматических углеводородов на более простые формы ароматических соединений, которые легче утилизируются микробиологическим путем, что позволяет расширить спектр утилизируемых углеводородов;

- внесение суспензии углеводородокисляющих микроорганизмов через три дня после внесения оксигенных соединений, что позволяет предотвратить губительное воздействие оксигенных соединений на живые клетки микроорганизмов и сократить уменьшение численности микробной популяции в начале процесса очистки и в результате увеличить скорость процессов биоокисления, т.е. скорость очистки почвы;

- возможность проводить очистку без выемки почвы «in suit», что позволяет существенно сократить время на очистку почвы.

Таким образом, предлагаемый способ сочетает в себе две технологии очистки: химическую, с применением пероксидальных соединений, и биотехнологическую, с применением углеводородокисляющих микроорганизмов и позволяет повысить эффективность очистки почвы за счет расширения спектра трудноутилизируемых углеводородов, увеличения скорости и сокращения времени очистки.