Результат интеллектуальной деятельности: РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS LICHENIFORMIS - ПРОДУЦЕНТ ТЕРМОСТАБИЛЬНОЙ ЛИПАЗЫ

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и касается штамма Bacillus lichensformis - продуцента фермента термостабильной липазы.

Липазы - ферменты, осуществляющие гидролиз триацилглицеридов с образованием жирных кислот и глицерина, находят применение в пищевой промышленности, бытовой химии, косметике и многих других областях. При этом большинство промышленных процессов, в которых используются липазы, проводят при температурах, превышающих 45°С, следовательно, особый интерес вызывают термостабильные липазы. Кроме того, так как липазы, наряду с протеазами и целлюлазами, входят в состав экологичных моющих средств, для них важна способность к работе в щелочной области pH.

Высокотермостабильные липазы, температурный оптимум которых превышает 70°C и достигает 95°C и найдены у экстремально термофильных анаэробных бактерий Thermosyntropha lipolytica [Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. - 2009. - V.36. - N.10. - P.1281-71], Caldanaerobacter subterraneus, Thermounuerobacler thermohydrosulfwicus [Extremophiles. - 2009. - V.13. - N.5. - P.769-83]. Fervidobacterium changbaicum [Appi Microbiol Biotechnol. - 2011. - V.89. - N.5. - P.1463-73]. Однако, существенным недостатком охарактеризованных ферментов, является их низкая удельная активность - менее 60 ед./мг белка.

Термофильные липазы, оптимум активности которых лежит в диапазоне температур 55-70°C и pH 8-10 выделены из умеренно термофильных аэробных бактерий родов Bacillus [Molecular and Cellular Biochemistry. - 2006. - V.290. - N.1-2. - P.17-22, Protein Expr Purif. - 2009. - V.68. - N.2. - P.161-6] и Geobacillus (ранее классифицируемые как Bacillus): [Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. - 2003. - V.22. - N.5-6. - P.307-13, Methods in Enzymology. - 1997. - V.284. - P.194-220. Molecular Biotechnology. - 2008. - V.42. - N.1. - P.75-83].

Из описанных в литературе термостабильных липаз наибольшей удельной активностью обладает липаза BTL2 из штамма Geobacillus thermocalenulatus DSM 730, температурный оптимум специфической активности которой лежит в диапазоне 60-75°С, Липаза отличается высокой стабильностью в присутствии детергентов (кроме SDS) и органических растворителей (метанол, ацетон, изопропанол). Удельная активность очищенного фермента составляет 55000 единиц/мг белка. Однако, продукция липазы природным штаммом очень мала, в связи с чем для получения ферменты целесообразно использовать рекомбинантные продуценты

Экспрессия гена липазы в клетках E.coli под контролем сильного температуроиндуцибельного промотора λP_L. приводит к тому, что большая часть фермента транспортируется в периплазму [Journal of Biotechnology. - 1997. - V.56. - P.89-102]. Активность фермента достигает 590 единиц/мл по трибутирину. Однако для получения фермента требуется стадия разрушения клеток, что приводит к удорожанию стоимости конечного продукта.

Экспрессия гена термостабильной липазы в P.pastoris приводит к секреции активного фермента в культуральную жидкость (до 309 ед/мл) [Protein Expression and Purification. - 2003. - V.28. - N.1. - P.102-1]. Однако при этом удельная активность фермента по трибутирату составляет 23000 единиц/мг (против 55000 единиц/мл у нативного фермента), а культивирование этого продуцента требует присутствия метанола в качестве индуктора и дорогих сред, что делает его использование не выгодным.

Интерес к созданию высокоэффективных продуцентов липазы на основе Bacillus licheniformis связан с достаточно хорошей генетической изученностью этого объекта и тем, что данный вид бактерий удобен для промышленной ферментации. В. licheniformis привлекает внимание биотехнологов и генетиков также своей термотолерантностью, открывающей возможность культивирования при повышенных температурах (до 60°C), что препятствует контаминации культуры в производственном ферментере.

Кроме того, работа со штаммами В. licheniformis не требует специальных мер предосторожности, так как данный вид бактерий относится к микроорганизмам, непатогенным для человека.

Технической задачей заявляемого изобретения является расширение арсенала рекомбинантных микроорганизмов, продуцирующих термостабильную липазу.

Задача решена путем конструирования рекомбинантного штамма бактерий Bacillus lichemformis ВКПМ В-11302 - продуцента термостабильной липазы.

Рекомбинантный штамм Bacillus lichemformis ВКПМ В-11302 получен из штамма Bacillus lichemformis 28KA (ВКПМ В-3039) посредством трансформации последнего экспрессионной репликативной плазмидой, полученной на основе вектора pHY300PLK (J. Bacteriol (1983), 153, 813-821), названной p-bt1 и содержащей ген btl2, кодирующий термостабильную липазу BTL2 из штамма Geohacillus thermocatenulatus DSM 730.

Заявляемый штамм Bacillus lichemformis депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) по адресу 117545 Москва, 1-ый Дорожный проезд, д.1 и имеет регистрационный номер ВКПМ В-11302.

Штамм Bacillus lichemformis ВКПМ В-11302 характеризуется следующими признаками:

Культурально-морфологические признаки.

Грамм-положительная спорообразующая палочковидная бактерия. Суточная культура в жидкой LB среде (мас.%: дрожжевой экстракт - 0,5, пептон - 1, NaCl - 1, вода - остальное) представлена подвижными цепочками из 2-3-х клеток палочковидными клетками размером 0,6-0,8 и 0,2-0,3 мкм. К третьим суткам цепочки распадаются и образуются овальные споры, не превышающие размер клетки, расположенные центрально. При росте на агаризованной LB среде образует колонии неправильной формы, слизистые, гладкие, непрозрачные, 2-5 мм в диаметре.

Физиолого-биохимические признаки. Облигатный аэроб. Сахара не сбраживает. Ассимилирует: сахарозу, D-глюкозу, L-арабинозу, D-ксилозу. D-маннитол. Гидролизует казеин и крахмал. Отличается пониженной протеолитической активностью и способностью к восстановлению нитрата.

Оптимальное значение pH для роста 5,5-8,0. Способен к расту при 55°C. Оптимальная температура роста 30-40°C.

Заявляемый штамм при выращивании в колбах на среде LB. способен продуцировать термостабильную липазу с активностью до 250 ЕД/мл культуральной жидкости, при выращивании в лабораторном ферментере - с активностью до 500 ЕД/мл культуральной жидкости

Изобретение проиллюстрировано следующими фигурами графического изображения:

Фиг.1 Электрофореграмма ПЦР-анализа исследуемых штаммов с помощью проверочных праймеров.

Фиг.2 График зависимости активности рекомбинантной и нативной термостабильной липазы от температуры

Фиг.3 График зависимости активности рекомбинантной и нативной термостабильной липазы от pH инкубационной среды

Получение и культивирование штамма Bacillus licheniformis ВКПМ В-11302 подтверждено следующими примерами.

Пример 1. Получение штамма Bacillus licheniformis ВКПМ В-11302. Трансформацию Bacillus licheniformis осуществляют методом введения молекул ДНК в бактериальные протопласты под воздействием осмотического давления раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ).(Harwood, С.R. & Cutting, S.М. (1990). Molecular Biological Methods for Bacillus. New York: Wiley.)

Для приготовления компетентных клеток используют штамм Bacillus licheniformis 28KA ВКПМ В- 3039. В качестве ДНК используют 1 мкг ДНК плазмиды p-bt1 Селекцию трансформантов ведут на агаризованной питательной среде LB с добавлением антибиотика эритромицина.

Наличие целевого рекомбинантного гена в составе плазмид трансформантов подтверждают методом ПЦР-анализа.

Из бактериальныех клонов, полученных в результате генетической трансформации, стандартными методами выделяют плазмидную ДНК, используемую в качестве матрицы для проведения полимеразной цепной реакции с использованием специфических проверочных праймеров.

Последовательность проверочных праймеров:

bt1-f AAACATATGATGAAAGGCTGCCGGGTGATGGTT

bt1-r AAATCGCGAATACAACTCAGGTGCTTGCT

Режим реакции ПЦР:

95°С - 3 мин. - 1 цикл

35 циклов:

95°С - 30 сек.

60°С - 30 сек.

72°С - 60 сек.

72°С - 5 мин - 1 цикл.

Для контроля величины фрагментов ДНК при электрофорезе используют молекулярный маркер O'GeneRuler 100 bp DNA Ladder (фиг.1 линия 1 размер фрагментов 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1700, 2000. 3000 п.н, сверху вниз)

Наработка фрагментов размером 420 п.н. при использовании проверочных праймеров bt1-f и bt1-r подтверждает присутствие целевого рекомбинантного гена btl в составе плазмид полученных клонов Bacillus Ucheniformis 28KA/ p-bt1 (фиг.1, линии 2 и 3)

Трансформаные клоны культивируют в жидкой среде в пробирках. Ферментацию проводят при 37°С на качалке (250 об/мин) в питательнй среде LB в пробирках (50 мл) с рабочим объемом 10 мл. Посев осуществляют бактериологической петлей.

Ферментацию продолжают в течение 24 часов. Специфическую активность термостабильной липазы определяют спектрофотометрическим методом по гидролизу хромогенного субстрата пира-нитрофенилбутирата (FEMS Yeast Res - 2002 - N.2 - Р.371-379).

Липолитическая активность характеризует способность фермента катализировать расщепление субстрата иара-нитрофенилбутирата до иорд-нитрофенола и бутановой кислоты.

За единицу липолитической активности принимают такое количество фермента, которое за 1 мин гидролизует 1 мкМоль субстрата с выделением эквимолярного количества нитрофенола и жирных кислот

По результатам ферментации отбирают заявляемый штамм Bacillus licheniformis ВКПМ В-11302, который при культивировании в среде LB. позволяет получать термостабильную липазу с активностью 240 ЕД/мл культуральной жидкости.

Пример 2. Культивирование штамма Bacillus licheniformis ВКПМ B-l 1302 в лабораторных условиях.

Культуру Bacillus licheniformis ВКПМ В-11302. наращивают в 5 мл среды LB в течение 20 часов при 37°C с аэрацией на качалке (250 об/мин)

Инокулят переносят в колбу объемом 750 мл с 45 мл свежей среды LB и растят при 37°C в течении 24 часов с аэрацией на качалке (250 об/мин).

Через 5, 10, 15, 20 и 24 часа культивирования отбирают пробы растущей бактериальной культуры, осаждают клетки методом центрифугирования и культуральную жидкость используют для проведения анализа специфической липазной активности.

При ферментации в колбах в питательной среде штамм Bacillus licheniformis ВКПМ B-11302 синтезирует термостабильную липазу обладающую активностью 240 ЕД/мл культуральной жидкости.

Пример 3. Культивирование штамма Bacillus licheniformis ВКПМ B-11302 в 3 л лабораторном ферментере.

Для получения посевного материала в пробирках культуру Bacillus licheniformis ВКПМ B-11302. наращивают в 5 мл среды LB в течение примерно 20 часов при 37°C с аэрацией (250 об/мин). Затем культуру из пробирки переносят в колбу с 50 мл среды LB. Культивируют в шейкере-инкубаторе (250 об/мин) при 37°С в течение 24 часов.

Полученный посевной материал переносят в 3 л ферментер и растят 48 часов в 1 литре LB среды.

Через 12, 24, 36 и 48 часов культивирования отбирают пробы растущей бактериальной культуры, осаждают клетки методом центрифугирования и культуральную жизкость используют для проведения анализа специфической липазной активности.

При ферментации в 3 л лабораторном ферментере штамм ВКПМ B-11302 синтезирует термостабильную липазу с активностью 500 ЕД/мл культуральной жидкости.

Пример 4. Исследование температурного оптимума рекомбинантной термостабильной липазы.

Для определения температурного оптимума рекомбинантной термостабильной липазы измеряют специфическую активности фермента при разных значениях температур по гидролизу пара-нитрофенилбутирата. Полученные результаты приведены на фиг.2 (кривая 2) в сравнении с аналогичными значениями нативной термостабильной липазы BTL2 из Geobacillus thermocatenulatus DSM 730 (кривая 1).

Показано, что температурный оптимум действия рекомбинантной термостабильной липазы находится в диапазоне 45-60°С, в то время как температурный оптимум нативной термостабильной липазы лежит в диапазоне 65-72°С.

Пример 5. Исследование оптимума pH рекомбинантной термостабильной липазы.

Активность термостабильной липазы измеряют при разных значениях pH инкубационной среды по гидролизу пара-нитрофенилбутирата. Полученные данные приведенные на фиг.3 (кривая 2) в сравнении с аналогичными значениями нативной термостабильной липазы BTL2 из Geobacillus thermocatenulatus DSM 730 (кривая 1). показывают, что оптимум действия pH рекомбинантной термостабильной липазы находится в диапазоне pH от 7,5 до 8,5 и практически совпадает с оптимумом рН нативной термостабильной липазы.

Таким образом, заявляемый штамм Bacillus lichemformis ВКПМ В-1130 продуцирует термостабильную липазу обладающую активностью до 500 ед/мл культуральной жидкости, при этом полученный фермент сохраняет промышленно ценные свойства нативного фермента.