ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ СПОСОБ УНИЧТОЖЕНИЯ ПАТОГЕННЫХ И УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

Изобретение относится к области дезинфекции и может найти широкое применение в здравоохранении, пищевой и фармацевтической промышленности, на предприятиях коммунального хозяйства, для обеззараживания и консервации питьевой воды, для дезинфекции плавательных бассейнов.

Известен патент РФ №2414912, в котором по первому способу предложен для дезинфекции водный раствор, содержащий ионы серебра, полученные путем электролиза, дистиллированную воду и пищевую кислоту, отличающийся тем, что он содержит в качестве пищевой кислоты молочную кислоту, а также 33%-ную перекись водорода при следующем соотношении компонентов, г/л: ионы серебра Ag⁺ 0,01-1,5; молочная кислота - 1-50; перекись водорода 33%-ная - 0,1-3; дистиллированная вода -остальное, при этом электролиз осуществляют с использованием двух серебряных электродов при периодической смене их полярности.

По второму способу предложен дезинфицирующий водный раствор, содержащий ионы серебра, полученные путем электролиза, дистиллированную воду и пищевую кислоту, отличающийся тем, что он содержит в качестве пищевой кислоты молочную кислоту, ионы меди, полученные путем электролиза, а также 33%-ную перекись водорода при следующем соотношении компонентов, г/л: ионы серебра Ag^+- 0,01-1,5; ионы меди Cu^+- 0,04-4; молочная кислота - 1-50; перекись водорода 33%-ная -0,1-3; дистиллированная вода - остальное, при этом электролиз осуществляют с использованием серебряного и медного электродов при периодической смене их полярности.

Недостатком данного способа является то, что при длительном хранении бактерицидность этого раствора уменьшается и теряется его прозрачность. Это объясняется тем, что ионы серебра взаимодействуют с веществами, находящимися в воде, в результате чего концентрация ионов серебра падает, а продукты взаимодействия выпадают в осадок.

Известен патент РФ №2176505, в котором предложен способ уничтожения патогенных и условно-патогенных микроорганизмов с помощью водорастворимого противовирусного и антибактериального лекарственного средства широкого спектра действия на основе комплекса препаратов ионного серебра и ионного золота с тиазиновым красителем (метиленовый синий) при следующем мольном соотношении: N,N'-тетраметилтиазин:Ag:Au=2:1:1, отвечающим составу: C₃₂H₃₆N₉О₉S₂ClAgAu. Синтез препарата был осуществлен следующим образом: при мольном соотношении реагентов N,N'-тетраметилтиазина нитрат:Ag:Au:C₂H₅ОH=2:1:1:1 в воде растворяли метиленовый синий (N,N'-тетраметилтиазина хлорид), который переводился в нитратную форму добавлением раствора нитрата серебра (AgNO₃). Затем осадок AgCl фильтровали, и к полученному раствору нитрата метиленового синего вновь добавляли раствор нитрата серебра, затем препарат ионного золота (АuСl₃ или HAuCl₄·3H₂O) и этиловый спирт, нагрев проводили до температуры 80-95°С, с последующим направлением реакционной массы, содержащей 10-20 вес.% твердых реагентов на распылительную сушилку или вакуумный ротационный испаритель.

Недостатком данного способа является то, что получение данного лекарственного вещества представляет определенные технические трудности.

Наиболее близким аналогом, выбранным в качестве прототипа, является способ уничтожения патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, описанный в патенте России №2430756, опубликованный 10.10.2011 г., характеризующийся тем, что одновременно обрабатывают область, содержащую микроорганизмы, композицией фотосенсибилизатора и фотокатализатора, выдерживают в течение периода времени, необходимого для эффективного связывания композиции с клетками микроорганизмов;

затем воздействуют на указанную область оптическим излучением с длинами волн, соответствующими максимуму поглощения фотосенсибилизатора и фотокатализатора, и плотностью мощности для активации композиции, при этом в качестве фотосенсибилизатора используют метиленовый синий или/и бриллиантовый зеленый, а в качестве фотокатализатора используют наночастицы диоксида титана, при этом воздействуют широкополосным светом, лазерным или светодиодным оптическим излучением, длины волн излучения выбирают в диапазоне от 390 до 440 нм и от 600 до 670 нм, плотность мощности излучения выбирают в диапазоне от 15 до 50 мВт/см², длительность облучения составляет от 1 до 30 мин, концентрация метиленового синего составляет от 0,0025 до 0,0001%, концентрация бриллиантового зеленого составляет от 0,000125 до 0,00001%, концентрация наночастиц диоксида титана составляет от 0,1 до 0,01%, период времени, необходимый для эффективного связывания композиции с клетками микроорганизмов, составляет от 10 до 20 мин.

Недостатком данного способа является его недостаточная эффективность, обусловленная тем, что осуществление данного способа представляет определенные технические трудности связанные с применением лазерного или светодиодного оптического излучения, а применение метиленового синего негативно влияет на нормальный микробный состав среды на которую оказывают воздействие.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа для эффективной и селективной инактивации патогенных и условно-патогенных микроорганизмов-возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных.

Технический результат заключается в селективности инактивации патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (в отсутствии негативного влияния на нормальную флору и собственные клетки организма) и в повышении эффективности инактивации патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

Технический результат достигается тем, что в способе уничтожения патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, характеризующемся тем, что среду, содержащую патогенные и условно-патогенные микроорганизмы, обрабатывают дезинфицирующей композицией, согласно изобретения, дезинфицирующей композицией является гель оксигидрата металла, который получают путем щелочного осаждения из раствора соли хлоридов металла 2%-ным раствором аммиака в реакторе объемом не менее 5 л, свежеприготовленный гель оксигидрата металла объемом 20·10^-6 м³ помещают в электрохимическую ячейку с графитовыми электродами прибора для формирования заряженных кластерных частиц металла и добавляют бактериальный раствор среды 10⁵ микробных тел в 1 мл, разбавленный 10 мл дистиллированной воды, воздействуют на среду поляризационными потоками кластерных оксигидратных частиц геля оксигидрата металла от 2-х до 6 часов, при этом для образования гелей оксигидратов металлов в качестве соли хлоридов металлов выбраны соли хлоридов циркония или железа, расстояние между электродами не более 70 мм.

За счет того, что в способе уничтожения патогенных и условно-патогенных микроорганизмов дезинфицирующей композицией является гель оксигидрата металла, который получают путем щелочного осаждения из раствора соли хлоридов металла 2%-ным раствором аммиака в реакторе объемом не менее 5 л, свежеприготовленный гель оксигидрата металла объемом 20·10^-6 м³ помещают в электрохимическую ячейку с графитовыми электродами прибора для формирования заряженных кластерных частиц металла и добавляют бактериальный раствор среды 10⁵ микробных тел в 1 мл, разбавленный 10 мл дистиллированной воды, воздействуют на среду поляризационными потоками кластерных оксигидратных частиц геля оксигидрата металла от 2-х до 6 часов, при этом для образования гелей оксигидратов металлов в качестве соли хлоридов металлов выбраны соли хлоридов циркония или железа, расстояние между электродами не более 70 мм, повышается селективность инактивации патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (отсутствие негативного влияния на нормальную флору и собственные клетки организма) и повышается эффективность инактивации патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

Указанный технический результат обеспечивается совместным действием совокупности используемых в способе уничтожения патогенных и условно-патогенных микроорганизмов гелей оксигидратов металлов и поляризационных импульсных токов самоорганизации геля оксигидрата металла от 2-х до 6 часов

Заявляемое изобретение не известно из уровня техники, данное решение обладает новизной.

Учитывая вышеизложенное, можно сделать вывод, что предлагаемый способ уничтожения патогенных и условно-патогенных микроорганизмов явным образом не следует из уровня техники и вся совокупность существенных признаков проявляет новое свойство, позволяющее достичь указанный технический результат, то есть изобретение соответствует критерию охраноспособности - «изобретательский уровень».

Заявляемое изобретение соответствует критерию «промышленная применимость», так как найдет широкое применение в здравоохранении, пищевой и фармацевтической промышленности, на предприятиях коммунального хозяйства, для обеззараживания и консервации питьевой воды, для дезинфекции плавательных бассейнов.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Изобретение поясняется чертежами:

фиг.1 - схема процесс разведения микробной культуры в стерильной дистиллированной воде и геле;

фиг.2 - установка экспериментальная коллоидно-химическая ячейка с графитовыми электродами для исследования спайковых всплесков нанокластеров (тока самоорганизации) оксигидратных гелей в бактериальной среде.

В способе уничтожения патогенных и условно-патогенных микроорганизмов предложено использование оксигидратных гелей циркония, железа для обеззараживания водных сред от бактериальной компоненты, а именно бактерицидного действия гелей оксигидрата циркония, железа на кишечную и синегнойную палочки, а также на возбудитель дизентерии.

Прибор для установления и измерения кластерных частиц - экспериментальная коллоидно-химическая ячейка с графитовыми электродами для исследования спайковых всплесков нанокластеров (тока самоорганизации) оксигидратных гелей в бактериальной среде представляет собой прямоугольную электрохимическую ячейку, на концах которой закреплены графитовые электроды. Расстояние между электродами 70 мм или меньше (фиг.2). Контакты электродов подключены к электронному регистрирующему блоку (если это необходимо). Установка описана в патенте России №2300161, опубликованном 27.05.2007 г.

Свежеприготовленный гель вместе с бактериальной средой помещали в такую электрохимическую ячейку. Получение геля оксигидрата металла путем щелочного осаждения из раствора соли хлоридов металла 2%-ным раствором аммиака в реакторе подробно описано в этом же патенте.

В свежеприготовленный гель оксигидрата металла объемом 20·10^-6 м³ добавляли бактериальный раствор среды 10⁵ микробных тел в 1 мл, разбавленный 10 мл дистиллированной воды, и воздействовали на среду поляризационными импульсными токами самоорганизации геля оксигидрата металла от 2-х до 6 часов. Ячейка замыкалась практически накоротко, величина выходного сопротивления была незначительной. Наноток, возникающий в системе, замеряли на специальном электронном оборудовании с частотой опроса системы 5 раз в секунду. Эксперимент проводили в течение 5-6 часов.

Для бактериологических исследований использовали такие культуры условно-патогенных бактерий, как Escherichia coli (кишечная палочка), Shigella Flexneri (Шигелла Флекснера - возбудитель дизентерии) и Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка).

Определение количества засеваемых бактериальных клеток проводилось по оптическому стандарту мутности. Сущность метода заключается в сравнении мутности используемой бактериальной взвеси с мутностью контрольного оптического стандарта. Сравниваемые взвеси находились в пробирках с одинаковым внутренним диаметром, толщиной и цветом стекла. В каждой исходной культуре содержалось условно 10 микробных тел в 1 мл взвеси (м.т./мл).

Из этой суспензии проводили последовательные 10-кратные разведения в стерильной дистиллированной воде (ДВ).

Для этого брали 3 стерильных пробирки, помечали их ДВ №1, ДВ №2, ДВ №3 и в каждую из них наливали по 9 мл стерильной дистиллированной воды. В пробирку ДВ №1 вносили 1,0 мл из пробирки со стотысячной взвесью микробных клеток по оптическому стандарту, взвесь тщательно перемешивали. Для дальнейшего разведения из пробирки ДВ №1 переносили 1,0 мл в ДВ №2, тщательно перемешивали и отсюда 1,0 мл переносили в следующую пробирку.

Схема разведения культуры по стандарту от 10⁵ микробных клеток представлена в таблице 1.

Далее проводили посев 0,02 мл бактериальных взвесей в стерильной дистиллированной воде из пробирок ДВ №1 - ДВ №3 через 2, 4 и 6 часов после нахождения бактериальных культур в дистиллированной воде и получали контрольные опыты.

Затем готовили разведения в оксигидратных гелях. Для этого помещали по 9 мл геля в 3 пробирки (Г №1 - Г №3) и делали следующее: 1 мл бактериальной взвеси из пробирки с концентрацией бактерий 10⁵ добавляли в пробирку с гелем (Г №1) и получали соответственно разведение 10^-1.

Затем 1 мл бактериальной взвеси из пробирки ДВ №1 с разведением 10^-1 добавили в пробирку с гелем (Г №2) и получали соответственно разведение 10^-2. То же совершали с пробиркой ДВ №2 и получали разведение 10^-3 в геле (Г №3). Процесс разведения представлен на фиг.2.

Далее делали посев 0,02 мл бактериальных взвесей из каждой пробирки с гелем через 2,4 и 6 часов после нахождения бактериальных культур в геле.

Затем готовили бактериальные среды в оксигидратных гелях, исследуя влияние электрохимической ячейки. Для этого помещали по 9 мл геля в 3 кюветы прибора (П №1 - П №3) и делали следующее: 1 мл бактериальной взвеси из пробирки с концентрацией бактерий 10⁵ добавляли в кювету ячейку с гелем (П №1) и получали соответственно разведение 10^-1.

Затем 1 мл бактериальной взвеси из пробирки ДВ №1 с разведением 10^-1 добавили в кювету прибора с гелем (П №2) и получали соответственно разведение 10^-2. То же совершали с пробиркой ДВ №2 и получали разведение 10^-3 в ячейке прибора с гелем (П №3).

Далее проводили посев 0,02 мл бактериальных взвесей из каждой кюветы прибора с гелем через 2,4 и 6 часов после нахождения бактериальных культур в кювете прибора с гелем.

Посев производили на питательной среде Эндо в чашках Петри. Затем чашки термостатировали в течение суток при температуре 37°С, и производили подсчет выросших бактериальных колоний (КОЕ).

При анализе действия гелей оксигидратов на бактерии, действия прибора с гелем оксигидрата на бактерии сравнивали количество выросших колоний соответственно из проб ДВ№1 - Г№1 - П№1, ДВ№2 - Г№2 - П№2, ДВ№3 - Г№3 - П№3. Электрохимическая ячейка - установка, используемый в исследованиях, представлен на фиг.2

Результаты исследования антимикробной активности геля оксигидрата циркония.

Для изучения антимикробного действия геля оксигидрата циркония использовали культуры таких бактерий, как Escherichia coli (кишечная палочка), Shigella Flexneri (Шигелла Флекснера - возбудитель дизентерии и Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка) по вышеописанной методике.

Пример №1 Экспериментальные результы исследования количества выросших колоний бактерий синегнойной палочки (Pseudomonas aeruginosa) представлены в таблице 2

Известно, что синегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa) обладает низкой чувствительностью к большинству антибиотиков. Как видно из таблицы 2, ни дистиллированная вода, ни исследуемый гель оксигидрата циркония не обладают антимикробным действием против данной культуры бактерий. Численность колоний с течением времени нахождения в геле уменьшается лишь для самой маленькой исходной концентрации бактерий 10² под воздействием импульсного поляризационного тока самоорганизации в электрохимической ячейке.

Пример №2 Экспериментальные результаты исследования количества выросших колоний бактерий кишечной палочки (Escherichia coli).

В таблице 3 приводятся результаты влияния геля (в том числе в электрохимической ячейке) на бактерии Escherichia coli (кишечная палочка).

Анализ таблицы 3 показал, что кишечная палочка (Escherichia coli) очень чувствительна к действующему на нее гелю оксигидрата циркония в отдельности и в совокупности с поляризационными импульсными токами.

Антимикробная эффективность геля в электрохимической ячейке наблюдается для всех исходных концентраций бактерий. Антимикробная активность одного чистого геля отмечена только при самой малой концентрации бактерий. В геле оксигидрата циркония под воздействием импульсных частичных нанокластеров оксигидрата циркония концентрация бактерий уменьшилась в 10 и более раз, а в последнем разведении роста колоний бактерий вообще не наблюдается.

Пример №3 Экспериментальные результаты исследования количества выросших колоний бактерий шигелла Флекснера - возбудитель дизентерии (Shigella Flexneri) представлены в таблице 4.

В геле оксигидрата циркония в электрохимической ячейке рост бактерий шигеллы Флекснера существенно замедляется и практически полностью прекращается после длительного (шестичасового) воздействия на относительно малые концентрации бактерий. Однако антимикробный эффект действия геля оксигидрата циркония на культуру шигеллы Флекснера - возбудитель дизентерии меньше по сравнению с действием на кишечную палочку, как без электрохимической ячейки, так и с электрохимической ячейкой.

Выводы: действие геля оксигидрата циркония на синегнойную палочку достаточно слабое; антимикробное действие геля на кишечную палочку очень эффективно, приводит к полному прекращению ее роста. Для шигеллы Флекснера-возбудитель дизентерии действие геля лучше по сравнению с синегнойной палочкой, но полного прекращения роста бактериальной культуры в растворе добиться удалось только после 6 часового выдерживания раствора в электрохимической ячейке.

Результаты исследования антимикробной активности геля оксигидрата железа.

Для изучения антимикробного действия геля оксигидрата железа использовали культуры таких бактерий, как Escherichia coli (кишечная палочка), Shigella Flexneri (Шигелла Флекснера) и Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка) по вышеописанной методике.

Пример №4. Экспериментальные результаты исследования количества выросших колоний бактерий синегнойной палочки (Pseudomonas aeruginosa) представлены в таблице 5.

Из данных таблицы следует, что рост колоний синегнойной палочки уменьшался под воздействием геля на протяжении всего времени исследования. Большее воздействие на этот процесс оказала электрохимическая ячейка. После 6 часового воздействия рост микробных тел уменьшился до 18 м.т./мл. Однако и электрохимическая ячейка с гелем оксигидрата железа не привела к полному уничтожению синегнойной палочки. Вероятно при более длительном воздействии и меньшей концентрации бактерий возможно добиться полного уничтожения бактериальной культуры синегнойной палочки в растворе.

Пример №5. В таблице 6 приводятся результаты влияния геля оксигидрата железа (в том числе в электрохимической ячейке) на бактерии Escherichia coli (кишечная палочка), экспериментальные результаты исследования количество выросших колоний бактерий кишечной палочки (Escherichia coli).

На протяжении всего времени эксперимента рост колоний культуры Escherichia coli (кишечная палочка) уменьшался (особенно в электрохимической ячейке). Можно полагать, что гель оксигидрата железа в ячейке подавляет развитие и рост бактерий данной культуры, но не столь эффективно, как гель оксигидрата циркония.

Пример №6. В таблице 7 содержатся результаты исследований изучения антимикробной активности геля оксигидрата железа по отношению к культуре бактерий шигеллы Флекснера, экспериментальные результаты исследования количество выросших колоний бактерий шигелла Флекснера (Shigella Flexneri).

По данным развития бактериальных колоний шигеллы Флекснера можно сказать, что и в этом случае концентрация бактериальной культуры сильно уменьшается в ячейке с гелем оксигидрата железа при длительном шестичасовом воздействии геля оксигидрата железа.

По результатам изучения воздействия оксигидратного геля железа на кишечную палочку и на шигеллу Флекснера можно сделать вывод, что только после длительного воздействия геля оксигидрата железа наблюдается незначительное уменьшение роста бактериальных культур. Действие геля оксигидрата железа на синегнойную палочку намного эффективнее действия геля оксигидрата циркония.

Таким образом, антимикробное действие увеличивается в ряду оксигидрат железа - оксигидрат циркония. Наиболее высокую чувствительность по отношению к гелям оксигидрата циркония и железа показывает кишечная палочка.

Механизм воздействия гелей оксигидратов следующий.

Соединения циркония и других тяжелых металлов обладают известным антимикробным воздействием сами по себе. Ионы циркония, например, могут включаться в жизненный цикл бактерий, нарушая процесс их жизнедеятельности.

При формировании оксигидратной матрицы в бесструктурной коллоидной среде происходит образование спиралевидных частиц. Спиральные частицы состоят из параллельно расположенных полимерных цепей (или слоев), формирующих в пространстве винтовые образования, которые обладают мезафазоподобной упорядоченностью. В также геле находятся бесструктурные агрегаты, представляющие собой низкомолекулярные полимерные частицы без выраженной упорядоченности.

Спиралеобразные фрагменты оксигидратов металов формируют на своей поверхности системы двойных электрических слоев. В результате дрейфа коллоидных частиц оксигидратов и ионов среды между электродами возникает разность потенциалов. Поток ионных кластеров сопровождается разрушением адсорбционных (по Штерну) и диффузионных слоев ДЭС (двойной электрический слой) оксигидратных фрагментов, что повлечет за собой поляризацию двойного электрического слоя. Данная поляризация ДЭС в результате периодических диссоциативных и конформационных перестроек, протекающих в макромполекулах оксигидратов металлов, может разрушаться с выбросом ионных кластеров.

Как было сказано ранее, ионы, отбрасываемые системой в результате конформационных перестроек, протекающих в оксигидратах металлов, колеблются с определенной частотой и интенсивностью (в условиях далеких от равновесия). Они способны создавать завихрения в реакционной системе. Возможно, эти завихрения распространяются на цитоплазму бактерии (бактериальную реакционную среду), затрудняя ее жизненную функцию, кроме того, эти заряженные оксигидратные кластеры меняют при этом заряд болезнетворных бактерий, что приводит к их гибели.

Таким образом, антимикробное действие нанокластеров оксигидратов увеличивается в ряду оксигидрат железа - оксигидрат циркония. Меньшее воздействие гелей оксигидрата циркония и железа показывает синегнойная палочка, а наиболее высокое - кишечная палочка (Сухарев Ю.И., Апаликова И.Ю., Лебедева И.Ю., Кузнецова А. В. Воздействие нанокластеров оксигидратных коллоидов на бактериальные культуры. Бутлеровские сообщения. 2011. Т.27. №15. - С.34-48.).

В заявляемом способе уничтожения патогенных и условно-патогенных микроорганизмов повышается селективность инактивации патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (отсутствие негативного влияния на нормальную флору и собственные клетки организма) и повышается эффективность инактивации патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, за счет того, что дезинфицирующей композицией является гель оксигидрата металла, который получают путем щелочного осаждения из раствора соли хлоридов металла 2%-ным раствором аммиака в реакторе объемом не менее 5 л, свежеприготовленный гель оксигидрата металла объемом 20·10^-6 м³ помещают в электрохимическую ячейку с графитовыми электродами прибора для формирования заряженных кластерных частиц металла и добавляют бактериальный раствор среды 10⁵ микробных тел в 1 мл, разбавленный 10 мл дистиллированной воды, воздействуют на среду поляризационными потоками кластерных оксигидратных частиц геля оксигидрата металла от 2-х до 6 часов, при этом для образования гелей оксигидратов металлов в качестве соли хлоридов металлов выбраны соли хлоридов циркония или железа, расстояние между электродами не более 70 мм.