СПОСОБ МУЛЬТИПЛЕКСНОГО ПЦР-АНАЛИЗА И НАБОР ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Изобретение относится к медицине и биологии и предназначено для использования при проведении ПЦР-исследований.

Из практики лабораторных исследований известно, что мультиплексная ПЦР имеет ряд преимуществ перед стандартной, более простой униплексной ПЦР: снижение риска контаминации образца, возможность контроля ложноотрицательных результатов, уменьшение расхода реактивов, сокращение времени подготовки, более высокое качество эталона, количество которого можно определить в образце (Edwards M.C., Gibbs R.A. Multiplex PCR: advantages, development, and applications // PCR methods and applications. - 1994. - Vol.3, №4. - P.S65-S75; Multiplex PCR [Электронный ресурс]. - URL: http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/multiplex-pcr.html (дата обращения: 03.09.2011); Elnifro E.M., Ashshi A.M., Cooper R.J., Klapper P.E. Multiplex PCR: optimization and application in diagnostic virology // Clinical microbiology reviews. - 2000. - Vol.13, №4. - P.559-570).

Продолжительность (время проведения) мультиплексной ПЦР при использовании известных способов длительная и составляет 1,5-8 часов (Successful PCR Guide. 3^rd Edition. Takara [Электронный ресурс] // Scientifix. - URL: http://www.scientifix.com.au/pdf/catalogues/TaKaRa%20Successful%20PCR% 20Guide%203rd%20ed.pdf (дата обращения: 14.11.2011); Performing Fast PCR Using Bio-Rad Thermal Cyclers [Электронный ресурс] // Bio-Rad. - URL: http://www3.bio-rad.com/gexp/html/applications/profiling/ap 12_fastpcr.pdf (дата обращения: 14.11.2011); Techne TC-PLUS thermal cycler is ideal for new fast PCR protocols [Электронный ресурс] // Techne. - URL: http://www.techne.com/news.asp?dsl=590 (дата обращения: 15.11.2011); Fast PCR [Электронный ресурс] // Invitrogen. - URL: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Nucleic-Acid-Amplification-and-Expression-Profiling/PCR/PCR-Misc/Fast-PCR.html (дата обращения: 15.11.2011)).

Вне зависимости от используемых праймеров в мультиплексной ПНР преимущественно используется буфер на основе трис-HCl в различных разведениях (патент RU 2164532 от 27.03.2001; Mahony J.B., Song X., Chong S. [et al.]. Evaluation of the NucliSens Basic Kit for detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in genital tract specimens using nucleic acid sequence-based amplification of 16S rRNA // Journal of clinical microbiology. - 2001. - Vol.39, №4. - P.1429-1435; патент US 2009111134 от 30.04.2009).

Основными недостатками известных наиболее широко используемых вариантов мультиплексной ПЦР являются возможность получения ложных результатов при достаточных различиях концентраций нуклеотидных последовательностей-мишеней, сравнительно большая продолжительность ПЦР и отсутствие оптимизации состава буфера для постановки реакции с комплексным учетом особенностей состава основных реагентов ПЦР: свойств и соотношения неблокированных и блокированных праймеров и Taq-полимеразы.

Применение быстрого ПЦР (fast PCR) ограничено в диагностических целях в связи с неэффективной амплификацией низкокопийных мишеней (Hilscher С., Vahrson W., Dittmer D.P. Faster quantitative real-time PCR protocols may lose sensitivity and show increased variability // Nucleic Acids Research. - 2005. - Vol.33, №21. - e182 doi: 10.1093/nar/gni181).

Известно использование для репликации нуклеиновых кислот реакционной буферной композиции, содержащей неорганическую соль и сульфат аммония в молярных соотношениях от 5:1 до 240:1, соответственно (патент US 2008038782 от 14.02.2008). В известной композиции в качестве неорганических солей, например, могут использоваться сульфат калия, хлористый калий, азотнокислый калий, хлористый магний, хлорид цезия и нитрат цезия. Кроме того, известная композиция может дополнительно содержать трис-сульфатный буфер, сульфат магния и тритон Х-100. Согласно описанию данного аналога известная реакционная буферная композиция позволяет использовать в ПЦР более высокую (до 25 раз) концентрацию ДНК-полимеразы (Pfu или Taq-полимеразы), за счет чего увеличивается выход продукта амплификации и ускоряется кинетика реакции.

Основными недостатками данного аналога являются возможность получения ложных результатов при достаточных различиях концентраций нуклеотидных последовательностей-мишеней, увеличение расхода реагентов и отсутствие оптимизации состава буфера для постановки реакции с комплексным учетом особенностей состава основных реагентов ПЦР: свойств и соотношения неблокированных и блокированных праймеров и Taq-полимеразы.

Для повышения качества ПЦР (в том числе мультиплексной ПЦР) предложено в состав буфера для постановки реакции на основе трис-HCl буфера или трис-гепес буфера включать глютамат калия, который обеспечивает усиление взаимодействия между ферментом и ДНК и, соответственно, увеличение продукта ПЦР-амплификации (Knorr A., Turner R.T., Bolander M.E., Sarkar G. Stimulatory effect of potassium glutamate in PCR // PCR methods and applications. - 1993. - Vol.3, №1. - P.73-74; патент WO 03048391 от 12.06.2003).

Основными недостатками данного аналога являются возможность получения ложных результатов при достаточных различиях концентраций нуклеотидных последовательностей-мишеней и отсутствие оптимизации состава буфера для постановки реакции с комплексным учетом особенностей состава основных реагентов ПНР: свойств и соотношения неблокированных и блокированных праймеров и Taq-полимеразы.

Наиболее близким аналогом заявляемого технического решения - прототипом - является способ модуляции амплификации последовательностей-мишеней в мультиплексном температурном цикле синтеза ДНК полимеразой с использованием реакционной смеси, включающей одну или более неблокированную пару праймеров и один или более модифицированный праймер (патент US 6057134 от 02.05.2000). При этом модифицированные праймеры изменены так, чтобы предотвращать их включение в синтез ДНК полимеразой. Согласно прототипу у модифицированных праймеров 3'-концевая гидроксильная группа химически изменена добавлением фосфата, биотина, дигоксигенина, флуоресценина, дидезоксинуклеотида, амина, тиола, азо-(N₃) группы или фтора. Известный способ при мультиплексной ПЦР позволяет регулировать эффективность амплификации, имеющейся в изобилии мишени, не подавляя амплификацию других мишеней. В соответствии с прототипом в качестве буфера в мультиплексной ПЦР с неблокированными и модифицированными праймерами используется ПНР-буфер, содержащий 10 мМ трис-HCl pH 8,3, 50 мМ KCl, l,5 мМ MgCl₂.

Основными недостатками прототипа являются сравнительно большая продолжительность мультиплексной ПЦР и отсутствие оптимизации состава буфера для постановки реакции с комплексным учетом особенностей состава основных реагентов ПЦР: свойств и соотношения неблокированных и модифицированных (блокированных) праймеров и Taq-полимеразы.

Главной задачей, решаемой заявляемым техническим решением, является уменьшение продолжительности мультиплексной ПЦР без повышения концентрации Taq-полимеразы, при предотвращении получения ложных результатов, связанных с различиями концентраций нуклеотидных последовательностей-мишеней.

Поставленная задача реализуется за счет того, что после выделения ДНК из биологического или клинического материала проводят мультиплексную ПЦР с первыми 5-10 циклами амплификации в виде трехшаговой ПЦР и с последующими 25-35 циклами амплификации в виде двухшаговой ПЦР при соотношении количества молекул неблокированных праймеров и количества молекул гомологичных им блокированных праймеров с некомплементарным участком из 1-8 нуклеотидов на 3'-конце, выбранных из ряда: некомплементарный первый нуклеотид, некомплементарный второй нуклеотид, некомплементарный третий нуклеотид, некомплементарный четвертый нуклеотид, некомплементарный пятый нуклеотид, некомплементарный шестой нуклеотид, некомплементарный седьмой нуклеотид, некомплементарный восьмой нуклеотид или их сочетания, составляющем от 2:1 до 4:1, при отсчете номера нуклеотида с 3'-конца. Мультиплексную ПЦР проводят в буфере для постановки реакции, содержащем катионы калия (I) и катионы магния (II), на основе буферной системы с pH 7,0-7,5 при 40-85°C, включающей соль глутаминовой кислоты, трис(гидроксиметил)аминометан и ортофосфорную кислоту, при соотношении количества молекул неблокированных праймеров и количества молекул гомологичных им блокированных праймеров с некомплементарным участком из 1-8 нуклеотидов на 3'-конце, выбранных из ряда: некомплементарный первый нуклеотид, некомплементарный второй нуклеотид, некомплементарный третий нуклеотид, некомплементарный четвертый нуклеотид, некомплементарный пятый нуклеотид, некомплементарный шестой нуклеотид, некомплементарный седьмой нуклеотид, некомплементарный восьмой нуклеотид или их сочетания, составляющем от 2:1 до 4:1, при отсчете номера нуклеотида блокированного праймера с 3'-конца. Набор для осуществления заявляемого способа включает в качестве основных компонентов неблокированные прямые и обратные праймеры, гомологичные им прямые и обратные блокированные праймеры с некомплементарным участком из 1-8 нуклеотидов на 3'-конце, выбранных из ряда: некомплементарный первый нуклеотид, некомплементарный второй нуклеотид, некомплементарный третий нуклеотид, некомплементарный четвертый нуклеотид, некомплементарный пятый нуклеотид, некомплементарный шестой нуклеотид, некомплементарный седьмой нуклеотид, некомплементарный восьмой нуклеотид или их сочетания, при отсчете номера нуклеотида блокированного праймера с 3'-конца. Набор также включает буфер для постановки реакции, содержащий катионы калия (I) и катионы магния (II), на основе буферной системы с pH 7,0-7,5 при 40-85°C, включающей соль глутаминовой кислоты, трис(гидроксиметил)аминометан и ортофосфорную кислоту.

При этом один из основных компонентов буферной системы - трис(гидроксиметил) аминометан - используют в известных, применяемых в ПЦР концентрациях (Компоненты PCR смеси [Электронный ресурс]. -URL: http://molbiol.edu.ru/protocol/12_01.html (дата обращения: 05.09.2011); PCR Buffers (A to W) [Электронный ресурс]. - URL: http://york-bio.com/pcr%20related.htm (дата обращения: 05.09.2011); 5Х Long PCR Buffer [Электронный ресурс]. - URL: http://130.15.90.245/5x_long_pcr_buffer.htm (дата обращения: 05.09.2011); GeneAmp PCR Buffers [Электронный ресурс]. - URL: http://www6.appliedbiosystems.com/support/techtools/pcropt/ (дата обращения: 05.09.2011); productPDF_50328 [Электронный ресурс]. - URL: http://www.thermo.fr/eThermo/CMA/PDFs/Product/productPDF_50328.pdf (дата обращения: 05.09.2011); 10х PCR Buffer [Электронный ресурс]. -URL: http://www.allelebiotech.com/content/pdf/10x_PCR_Buffer.pdf (дата обращения: 05.09.2011); 10Х Buffer Cfr9I [Электронный ресурс]. - URL: http://www.fermentas.com/en/products/all/conventional-restriction-enzymes/buffers/b02-buffer-cfr9i (дата обращения: 05.09.2011); Knorr A., Turner R.T., Bolander M.E., Sarkar G. Stimulatory effect of potassium glutamate in PCR // PCR methods and applications. - 1993. - Vol.3, №1. - P.73-74; патент WO 03048391 от 12.06.2003; патент WO 2008013885 от 31.01.2008; патент US 2009325278 от 31.12.2009).

Другие основные ингредиенты буферной системы - ортофосфорную кислоту и соль глутаминовой кислоты - используют в концентрациях, обеспечивающих pH 7,0-7,5 при 40-85°C с учетом концентрации трис(гидроксиметил)амино-метана, а соль глутаминовой кислоты выбирают из ряда: глутамат калия, глутамат натрия или их смесь.

В качестве известных, применяемых в ПЦР донаторов катионов калия (I) используют в известной концентрации, по меньшей мере, одну соль, выбранную из ряда: хлорид калия, сульфат калия и ацетат калия. В качестве известных, применяемых в ПЦР донаторов катионов магния (II) используют в известной концентрации, по меньшей мере, одну соль, выбранную из ряда: хлорид магния, сульфат магния и ацетат магния. В состав буфера для постановки реакции могут быть дополнительно включены любые другие известные реагенты, используемые в ПЦР-буфере (Компоненты PCR смеси [Электронный ресурс]. - URL: http://molbiol.edu.ru/protocol/12_01.html (дата обращения: 05.09.2011); PCR Buffers (A to W) [Электронный ресурс]. - URL: http://york-bio.com/pcr%20related.htm (дата обращения: 05.09.2011); 5Х Long PCR Buffer [Электронный ресурс]. - URL: http://130.15.90.245/5x_long_pcr_buffer.htm (дата обращения: 05.09.2011); GeneAmp PCR Buffers [Электронный ресурс]. - URL: http://www6.appliedbiosystems.com/support/techtools/pcropt/ (дата обращения: 05.09.2011); productPDF_50328 [Электронный ресурс]. - URL: http://www.thermo.fr/eThermo/CMA/PDFs/Product/productPDF_50328.pdf (дата обращения: 05.09.2011); 10х PCR Buffer [Электронный ресурс]. - URL: http://www.allelebiotech.com/content/pdf/10x_PCR_Buffer.pdf (дата обращения: 05.09.2011); 10Х Buffer Cfr9I [Электронный ресурс]. - URL: http://www.fermentas.com/en/products/all/conventional-restriction-enzymes/buffers/b02-buffer-cfr9i (дата обращения: 05.09.2011); 10Х PCR Buffer [Электронный ресурс]. - URL: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?D7=0&N5⁼SEARCH_ CONCAT_PNO|BRAND_KEY&N4=P2192|SIGMA&N25=0&QS=ON&F=SPEC (дата обращения: 06.09.2011); PCR Amplification [Электронный ресурс]. - URL: http://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/pcr-amplification/ (дата обращения: 06.09.2011); Knorr A., Turner R.T., Bolander M.E., Sarkar G. Stimulatory effect of potassium glutamate in PCR // PCR methods and applications. - 1993. - Vol.3, №1. - P.73-74; патент WO 03048391 от 12.06.2003; патент WO 2008013885 от 31.01.2008; патент US 2009325278 от 31.12.2009).

В основу заявляемого изобретения положена обеспечивающая решение поставленной задачи новая совокупность оригинальных отличительных признаков. Во-первых, это новые варианты блокированных праймеров с некомплементарным участком из 1-8 нуклеотидов на 3'-конце, выбранных из ряда: некомплементарный первый нуклеотид, некомплементарный второй нуклеотид, некомплементарный третий нуклеотид, некомплементарный четвертый нуклеотид, некомплементарный пятый нуклеотид, некомплементарный шестой нуклеотид, некомплементарный седьмой нуклеотид, некомплементарный восьмой нуклеотид или их сочетания, при отсчете номера нуклеотида блокированного праймера с 3'-конца, расширяющие перечень используемых праймеров, снижающее конкуренцию праймеров за Taq-полимеразу и нуклеозидтрифосфаты, что в сочетании, в свою очередь, дает возможность повысить скорость мультиплексной ПНР без повышения концентрации ДНК-полимеразы при предотвращении получения ложных результатов. Во-вторых, это подобранное с учетом свойств буферной системы и концентрации Taq-полимеразы соотношение количества молекул неблокированных праймеров и количества молекул гомологичных им прямых и обратных блокированных праймеров с некомплементарным участком. В-третьих, это впервые использованное на стандартном термоциклере сочетание трехшаговой ПЦР, позволяющей накопить начальные мишени, и двухшаговой ПЦР, при которой отжиг и элонгация происходят одновременно, позволяющей снизить время проведения амплификации, в том числе при использовании неблокированных прямых и обратных праймеров и гомологичных им прямых и обратных блокированных праймеров с некомплементарным участком. В-четвертых, это новая, оригинальная буферная система для мультиплексной ПЦР, которая за счет более стабильной pH при смене температур этапов (шагов) циклов амплификации расширяет температурный интервал как отжига неблокированных прямых и обратных праймеров, так и гомологичных им прямых и обратных праймеров с некомплементарным участком, поддерживая также высокую активность Taq-полимеразы. Другие обязательные компоненты (K⁺ и Mg²⁺) нового буфера для постановки мультиплексной ПЦР усиливают эти полезные свойства оригинальной буферной системы при использовании смеси неблокированных прямых и обратных праймеров и гомологичных им прямых и обратных блокированных праймеров с некомплементарным участком.

Из патентно-технической литературы и практики ПЦР-исследований неизвестно о способе мультиплексного ПЦР-анализа и наборе для его осуществления, которые были бы идентичны заявляемым.

Отсюда правомерен вывод о соответствия заявляемого решения критерию «новизна».

Указанная выше совокупность существенных признаков необходима и достаточна для получения технического результата - уменьшения продолжительности мультиплексной ПЦР без повышения концентрации Taq-полимеразы, при предотвращении получения ложных результатов, связанных с различиями концентраций нуклеотидных последовательностей-мишеней. Между существующими признаками и решаемой задачей существует причинно-следственная связь, где каждый признак необходим и влияет на получение технического результата, а вместе взятые признаки достаточны для его получения. Правомерен вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «изобретательский уровень».

Предлагаемый способ может быть реализован многократно, а, значит, заявляемое техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость».

Предлагаемый способ апробирован в лаборатории иммунологии и вирусологии, группе молекулярной биологии Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательского института медицинской приматологии Российской академии медицинских наук.

Сущность изобретения поясняется на следующих примерах, полученных при апробации предлагаемого способа, показывающих повышение скорости мультиплексной ПЦР без повышения концентрации ДНК-полимеразы, при предотвращении получения ложных результатов, связанных с различиями концентраций нуклеотидных последовательностей-мишеней, при использовании заявляемого способа. При этом приведенные примеры мультиплексного ПЦР-анализа и вариантов набора для его осуществления показывают конкретную реализацию заявляемого изобретения, но не ограничивают объем притязаний формулы заявляемого изобретения.

Пример 1. Первоначально выделяли ДНК из биологического материала (материала слизистой оболочки цервикального канала шейки матки обезьяны вида Павиан анубис, инфицированной Ureaplasma urealyticum, Candida albicans, Chlamydia trachomatis и Gardnerella vaginalis с превалированием в микст-инфекции в качестве инфекционного агента Chlamydia trachomatis). Затем проводили мультиплексную ПЦР с первыми 10 циклами амплификации в виде трехшаговой ПЦР и с последующими 25 циклами амплификации в виде двухшаговой ПЦР, с использованием набора, содержащего неблокированные прямые и обратные праймеры для Ureaplasma urealyticum, Candida albicans, Chlamydia trachomatis и Gardnerella vaginalis, гомологичные им прямые и обратные блокированные праймеры с некомплементарным участком нуклеотидов на 3'-конце:

праймеры для выявления Ureaplasma urealyticum:

прямой неблокированный -

u5 5'-САА TCT GCT CGT GAA GTA TTA C-3',

обратный неблокированный -

u4 5'-ACG ACG TCC ATA AGC AAC T-3',

прямой, блокированный -

u5u1 5'-САА TCT GCT CGT GAA GTA TTA G-3',

обратный, блокированный -

u4u1 5'-ACG ACG TCC ATA AGC AAC G-3';

праймеры для выявления Candida albicans:

прямой неблокированный -

ITS3 5'-GCA TCG ATG AAG AAC GCA GC-3',

обратный неблокированный -

ITS4 5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3',

прямой, блокированный -

ITS3u12 5'-GCA TCG ATG AAG AAC GCA CG-3',

обратный, блокированный -

ITS4u12 5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT CG-3';

праймеры для выявления Chlamydia trachomatis:

прямой неблокированный -

u1 5'-CAC GAG CTG ACG АСА ACC ATG CA-3',

обратный неблокированный -

ch1 5' -AAA GGG CGT GTA GGC GGA AAG-3',

прямой, блокированный -

u1u12 5'-CAC GAG CTG ACG АСА АСС ATG GT-3',

обратный, блокированный -

ch1u1 5'-AAA GGG CGT GTA GGC GGA AAC-3';

праймеры для выявления Gardnerella vaginalis:

прямой неблокированный -

gg1 5'-TCG TGG AGG GTT CGA TTC TG-3',

обратный неблокированный -

gg2 5'-GAC CAT GCA CCA CCT GTG AA-3',

прямой, блокированный -

gg1u1 5'-TCG TGG AGG GTT CGA TTC TC-3',

обратный, блокированный -

gg2u1 5'-GAC CAT GCA CCA CCT GTG AT-3',

Набор также содержал термостабильный фермент Taq-полимеразу, смесь четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP и dTTP), положительные контроли, отрицательные контроли, воск, масло для проведения ПЦР и буфер для постановки реакции, содержащий катионы калия (I) и катионы магния (II), на основе буферной системы с pH 7,0-7,5 при 40-85°C, включающей глутамат калия в качестве соли глутаминовой кислоты, трис(гидроксиметил)аминометан и ортофосфорную кислоту. Мультиплексную ПЦР проводили при соотношении количества молекул неблокированных праймеров и количества молекул гомологичных им праймеров с некомплементарным участком нуклеотидов на 3'-конце, составляющем 2:1.

При этом концентрация Taq-полимеразы, используемая в мультиплексной ПЦР, не превышала ее концентрации, требуемой для проведения униплексной ПЦР с аналогичными парами праймеров, и составила 1,5 е.а. в реакционной смеси.

Продолжительность (время проведения) мультиплексной ПЦР при использовании многоканального амплификатора «Терцик» (Многоканальный амплификатор «Терцик» [Электронный ресурс]. - URL: http://www.dna-technology.ru/dnaproducts/equipments/mamplificators/tercik/ дата обращения: 17.11.2011)) составила 60 минут.

В результате проведения мультиплексной ПЦР по заявляемому способу и с использованием заявляемого набора была установлена положительная ПНР с праймерами для Ureaplasma urealyticum, Candida albicans, Chlamydia trachomatis и Gardnerella vaginalis.

Пример 2. Первоначально выделяли ДНК из биологического материала (материала слизистой оболочки цервикального канала шейки матки обезьяны вида Павиан гамадрил, инфицированной Ureaplasma urealyticum, Candida albicans, Chlamydia trachomatis и Gardnerella vaginalis с превалированием в микст-инфекции в качестве инфекционного агента Candida albicans). Затем проводили мультиплексную ПЦР с первыми 5 циклами амплификации в виде трехшаговой ПЦР и с последующими 30 циклами амплификации в виде двухшаговой ПЦР, с использованием набора, содержащего неблокированные прямые и обратные праймеры для Ureaplasma urealyticum, Candida albicans, Chlamydia trachomatis и Gardnerella vaginalis, гомологичные им прямые и обратные блокированные праймеры с некомплементарным участком нуклеотидов на 3'-конце:

праймеры для выявления Ureaplasma urealyticum:

прямой неблокированный -

u5 5'-САА ТСТ GCT CGT GAA GTA ТТА С-3',

обратный неблокированный -

u4 5'-ACG ACG ТСС АТА AGC ААС Т-3',

прямой, блокированный -

u5u48 5'-САА ТСТ GCT CGT GAT GTA АТА С-3,'

обратный, блокированный -

u4u2 5'-ACG ACG TCC ATA AGC AAG T-3';

праймеры для выявления Candida albicans:

прямой неблокированный -

ITS3 5'-GCA TCG ATG AAG AAC GCA GC-3',

обратный неблокированный -

ITS4 5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3',

прямой, блокированный -

ITS3u12 5'-GCA TCG ATG AAG AAC GCA CG-3',

обратный, блокированный -

ITS4u12 5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT CG-3';

праймеры для выявления Chlamydia trachomatis:

прямой неблокированный -

u1 5'-CAC GAG CTG ACG АСА ACC ATG CA-3',

обратный неблокированный -

ch1 5'-AAA GGG CGT GTA GGC GGA AAG-3',

прямой, блокированный -

u1u137 5'-CAC GAG CTG ACG АСА AGC АТС СТ-3',

обратный, блокированный -

chlu56 5'-ААА GGG CGT GTA GGC CCA AAG-3';

праймеры для выявления Gardnerella vaginalis:

прямой неблокированный -

gg1 5'-TCG TGG AGG GTT CGA TTC TG-3',

обратный неблокированный -

gg2 5'-GAC CAT GCA CCA CCT GTG AA-3',

прямой, блокированный -

gg1u1 5'-TCG TGG AGG GTT CGA TTC TC-3',

обратный, блокированный -

gg2u1 5'-GAC CAT GCA CCA CCT GTG AT-3',

Набор также содержал термостабильный фермент Taq-полимеразу, смесь четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP и dTTP), положительные контроли, отрицательные контроли, воск, масло для проведения ПЦР и буфер для постановки реакции, содержащий катионы калия (I) и катионы магния (II), на основе буферной системы с pH 7,0-7,5 при 40-85°C, включающей глутамат натрия в качестве соли глутаминовой кислоты, трис(гидроксиметил)аминометан и ортофосфорную кислоту. Мультиплексную ПЦР проводили при соотношении количества молекул неблокированных праймеров и количества молекул гомологичных им праймеров с некомплементарным участком нуклеотидов на 3'-конце, составляющем 3:1.

При этом концентрация Taq-полимеразы, используемая в мультиплексной ПЦР, не превышала ее концентрации, требуемой для проведения униплексной ПЦР с аналогичными парами праймеров, и составила 0,5 е.а. в реакционной смеси.

Продолжительность (время проведения) мультиплексной ПЦР при использовании термоциклера TC-PLUS (TC-PLUS [Электронный ресурс]. - UR.L: http://www.techne.com/adminimages/TC_PLUS_V_1_6.pdf (дата обращения: 17.11.2011)) составила 35 минут.

В результате проведения мультиплексной ПЦР по заявляемому способу и с использованием заявляемого набора была установлена положительная ПЦР с праймерами для Ureaplasma urealyticum, Candida albicans, Chlamydia trachomatis и Gardnerella vaginalis.

Пример 3. Первоначально выделяли ДНК из биологического материала (материала слизистой оболочки прямой кишки обезьяны вида Павиан гамадрил, инфицированной Ureaplasma urealyticum, Candida albicans, Chlamydia trachomatis и Gardnerella vaginalis с превалированием в микст-инфекции в качестве инфекционного агента Chlamydia trachomatis). Затем проводили мультиплексную ПЦР с первыми 7 циклами амплификации в виде трехшаговой ПЦР и с последующими 35 циклами амплификации в виде двухшаговой ПЦР, с использованием набора, содержащего неблокированные прямые и обратные праймеры для Ureaplasma urealyticum, Candida albicans, Chlamydia trachomatis и Gardnerella vaginalis, гомологичные им прямые и обратные праймеры блокированные праймеры с некомплементарным участком нуклеотидов на 3'-конце:

праймеры для выявления Ureaplasma urealyticum:

прямой неблокированный -

u5 5'-САА TCT GCT CGT GAA GTA TTA C-3',

обратный неблокированный -

u4 5'-ACG ACG TCC ATA AGC AAC T-3',

прямой, блокированный -

u5u48 5'-CAA TCT GCT CGT GAT GTA ATA C-3',

обратный, блокированный -

u4u2 5'-ACG ACG TCC ATA AGC AAG T-3';

праймеры для выявления Candida albicans:

прямой неблокированный -

ITS3 5'-GCA TCG ATG AAG AAC GCA GC-3',

обратный неблокированный -

ITS4 5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3',

прямой, блокированный -

ITS3u12345678 5'-GCA TCG ATG AAG CGA CGC AA-3',

обратный, блокированный -

ITS4u12 5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT CG-3';

праймеры для выявления Chlamydia trachomatis:

прямой неблокированный -

u1 5'-CAC GAG CTG ACG АСА ACC ATG CA-3',

обратный неблокированный -

ch1 5'-AAA GGG CGT GTA GGC GGA AAG-3',

прямой, блокированный -

u1u137 5'-CAC GAG CTG ACG АСА AGC АТС CT-3',

обратный, блокированный -

ch1u56 5'-AAA GGG CGT GTA GGC CCA AAG-3';

праймеры для выявления Gardnerella vaginalis:

прямой неблокированный -

gg1 5'-TCG TGG AGG GTT CGA TTC TG-3',

обратный неблокированный -

gg2 5'-GAC CAT GCA CCA CCT GTG AA-3',

прямой, блокированный -

gg1u1 5'-TCG TGG AGG GTT CGA TTC TC-3',

обратный, блокированный -

gg2u1 5'-GAC CAT GCA CCA CCT GTG AT-3',

Набор также содержал термостабильный фермент Taq-полимеразу, смесь четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP и dTTP), положительные контроли, отрицательные контроли, воск, масло для проведения ПЦР и буфер для постановки реакции, содержащий катионы калия (I) и катионы магния (II), на основе буферной системы с pH 7,0-7,5 при 40-85°C, включающей смесь глутамата калия и глутамата натрия в качестве соли глутаминовой кислоты, трис(гидроксиметил)аминометан и ортофосфорную кислоту. Мультиплексную ПЦР проводили при соотношении количества молекул неблокированных праймеров и количества молекул гомологичных им праймеров с некомплементарным участком нуклеотидов на 3'-конце, составляющем 4:1.

При этом концентрация Taq-полимеразы, используемая в мультиплексной ПЦР, не превышала ее концентрации, требуемой для проведения униплексной ПЦР с аналогичными парами праймеров, и составила 2,5 е.а. в реакционной смеси.

Продолжительность (время проведения) мультиплексной ПЦР при использовании термоциклера TC-PLUS (TC-PLUS [Электронный ресурс]. - URL: http://www.techne.com/adminimages/TC_PLUS_V_1_6.pdf (дата обращения: 17.11.2011)) составила 45 минут.

В результате проведения мультиплексной ПЦР по заявляемому способу и с использованием заявляемого набора была установлена положительная ПЦР с праймерами для Ureaplasma urealyticum, Candida albicans, Chlamydia trachomatis и Gardnerella vaginalis.

Таким образом в примерах показаны преимущества заявляемого технического решения по сравнению с прототипом, заключающиеся в повышении скорости мультиплексной ПЦР без повышения концентрации ДНК-полимеразы, при предотвращении получения ложных (ложноотрицательных) результатов, связанных с различиями концентраций нуклеотидных последовательностей-мишеней, при использовании заявляемого способа и заявляемого набора, что в совокупности упростит ПЦР-исследования и повысит их качество.