Результат интеллектуальной деятельности: ТКАНЕИНЖЕНЕРНЫЙ СОСУДИСТЫЙ ГРАФТ МАЛОГО ДИАМЕТРА И СПОСОБ ЕГО ИЗГОТОВЛЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к области медицины и тканевой инженерии, а именно к сердечно-сосудистой хирургии и может быть использовано при аорто-коронарном шунтировании, а также хирургической реконструкции периферических сосудов.

В настоящее время для хирургического лечения сердечно-сосудистых заболеваний, связанных с атеросклеротической окклюзией периферических сосудов и коронарных артерий, используют аутологичные артерии и вены либо сосуды, изготовленные из ксеноматериала. При этом срок эффективного функционирования биологических шунтов в среднем составляет 5 лет, что приводит к необходимости проведения операций реваскуляризации (Бокерия Л.А., Высокий процент повторных операций у больных ишемической болезнью сердца - современное состояние проблемы / Бокерия Л.А., Беришвили И.И., Солнышков и др. // Бюллетень НЦССХ им. Бакулева РАМН. - 2009. - №10(3). - С.5-27). Применение синтетических материалов для изготовления сосудистых протезов, таких как политетрафторэтилен (PTFE) или Dacron, позволяет решить эту проблему, однако при диаметрах графтов менее 6 мм происходит быстрое образование тромбов в просвете протеза.

Альтернативой использования аутологичных и ксеногенных вен и артерий, а также синтетических кровеносных сосудов для сердечнососудистой хирургии могут стать тканеинженерные графты. Основная идея тканевой инженерии заключается в создании полноценного сосудистого графта для применения в сердечно-сосудистой хирургии, что привело к попыткам создания абсорбируемых графтов с клетками, полученными из организма пациента.

Известен тканеинженерный кровеносный сосуд, состоящий из биосовместимой, биодеградируемой матрицы, покрытой аутоклетками одного, либо нескольких видов, полученные из костного мозга или периферической крови пациента (заявка США 20090275129 А1, МПК C12N 5/08, C12N 5/06, опубл. 05.11.2009). Биосовместимая матрица имеет пористую структуру и изготовлена из природных, либо синтетических биодеградируемых полимеров. Клетки, полученные у пациента для заселения сосудистого графта, культивируют в стерильных условиях до увеличения массы, а затем «садят» на матрицу. Для дальнейшей клеточной пролиферации и формирования внеклеточного матрикса матрицы помещают в биореактор.

Недостатком данного тканеинжененного кровеносного сосуда является сложность забора достаточного количества клеточного материала у пациента, а также длительность процесса культивирования и посадки клеток на матрицу для формирования целостного сосуда до его имплантации.

Наиболее близким к заявленному техническому решению является тканеинженерный сосудистый графт малого диаметра, предназначенный для имплантации в кровеносное русло пациента (заявка США 2010/0221304 «Bionanocomposite Materials and Methods For Producing and Using the Same», завл. 26.02.2010 г , опубл. 02.09.2010 г., МПК - A61F 2/06, A61L 27/34, A61F 2/82). Графт изготовлен методом двойного электроспининга и состоит из двух биосовместимых бионанокомпозитных материалов, сердцевина которого включает поликапронолактон (PCL), а во внешний слой стенки матрицы инкорпорируют ангиогенные факторы роста, такие как трансформирующий фактор роста (TGF-b) и фактор роста фибробластов (FGF-b).

Недостатком известного технического решения является то, что core-структура волокна, в которой PCL комбинируют с природными полимерами (коллаген, хитозан, эластин), или синтетическими полимерами с коротким сроком биодеградации (PLA, PLGA, PGA, PDLLA), приведет к ранней потере прочности графта после его имплантации в кровеносном русле, что делает изделие непригодным для долгого функционирования. Кроме того, совместное использование TGF-beta и bFGF может спровоцировать активное образование элементов соединительной ткани, так как TGF-beta стимулирует экспрессию компонентов внеклеточного матрикса, таких как эластин, коллаген, фибронектин, протеогликаны, что приведет к гиперплазии неоинтимы и непроходимости графта, особенно в графтах малого диаметра.

Техническим результатом изобретения является создание тканеинженерного сосудистого графта малого диаметра для биоремоделирования поврежденных сосудов in vivo, обладающего высокой проходимостью, биогемосовместимостимостью и долговечностью.

Поставленная задача решается за счет изготовления пористой трубчатой матрицы сосудистого графта из биодеградируемого полимера методом двухфазного электроспининга, при этом в стенку матрицы инкорпорированы биологически активные молекулы, стимулирующие процессы регенерации стенки сосуда в организме.

В качестве материала для изготовления матрицы сосудистого графта используют синтетический полимер с длительным периодом биодеградации - поликапролактон (poly(e-caprolactone (PCL)), который хорошо известен как достаточно прочный и эластичный полимер. Кроме того, данный полимер биосовместим и биорезистентен, а скорость деградации волокна PCL, полученного методом электроспиннинга, в организме составляет от трех месяцев до года. Такая скорость деградации PCL способствует достаточно длительному поддержанию необходимых механических свойств графта до завершения процесса формирования нативного сосуда, при этом процессы гидролиза полимера и регенерации сосуда скоординированны во времени и идут параллельно. В результате биодеградации образуются нетоксичные вещества: вода и капроновая кислота. Заявленный сосудистый графт состоит только из PCL, который представляет собой очень прочный, эластичный полимер с длительным сроком деградации, тем самым он способен выдерживать давление тока крови долгое время, до формирования собственных тканей сосуда.

Метод электроспиннинга для изготовления матрицы позволяет получать микро- и нанотонкие волокна и пористые структуры из растворов и расплавов полимеров различного строения. Принцип метода заключается в образовании волокон в сильном электрическом поле, возникающем между двумя электродами противоположной зарядности, при этом один электрод помещают в раствор или расплав полимерного материала, второй размещают на приемном металлическом коллекторе. Сосудистые графты изготавливают на установке для электроспиннинга, при этом раствор полимера помещают в шприц, на поршень которого медленно давит памп с заданной скоростью. К шприцу присоединена игла, имеющая тупой конец, к которой подведен электрический потенциал. Полимер при выходе из шприца застывает, образуя волокно. Полимерные нити собираются на вращающийся коллектор, к которому подведен второй электрод, образуя пористый материал. Размеры пор не превышают 20 мкм во избежание кровотечения через стенку протеза.

Для изготовления сосудистого графта используют следующие параметры электроспиннинга: напряжение - 10-50 кВ, скорость подачи раствора полимера - 1-10 мл/ч, расстояние между иглой и коллектором - 1-20 см, скорость вращения коллектора - 10-300 об/мин.

В процессе электроспиннинга в полимерное волокно инкорпорируют такие биологические молекулы, как сосудистый эндотелиальный фактор роста (vascular endothelial growth factor (VEGF)), фактор роста фибробластов (fibroblast growth factor beta (b-FGF)), фактор стромальных клеток (stromal derived factor-1 alpha (SDF-1α)), а также молекулы гепарина. Введение VEGF в структуру графта, способствует его более быстрой эндотелиализации, так как этот ростовой фактор играет важную роль в регуляции миграции и пролиферации эндотелиальных клеток. Кроме того в качестве индуктора пролиферации эндотелиальных клеток и фибробластов применяется bFGF. В свою очередь, SDF-1α активирует направленную миграцию аутологичных стволовых клеток в места повреждения, способствуя регенерации стенки сосуда. Инкорпорирование молекул гепарина в стенку матрицы обеспечивает снижение риска тромбообразования в просвете кондуита.

Инкорпорирование указанных ростовых факторов и гепарина в стенку графта, осуществляют путем смешивания раствора биодеградируемого полимера с раствором биологических молекул в фосфатно-солевом буфере, в соотношении 20:1, после чего вополняют электроспининг. Так как каждый вид используемых биомолекул обладает широким спектром действия на клетки организма, то предлагаемый сосудистый графт может иметь в своем составе или один вид молекул, или их комбинации.

Заявленный сосудистый графт, содержит комбинацию ростовых факторов: VEGF, bFGF и SDF-1a, что способствует оптимальному формированию стенки графта и эндотелиального слоя.

В процессе биодеградации полимера инкорпорированные молекулы выходят в окружающие ткани и осуществляют свои биологические функции, стимулируя и регулируя процесс формирования нового сосуда. Кроме того молекулы «запаяны» в полимерное волокно и не имеют контакта с внешней средой, что обеспечивает сохранение их функций достаточно длинный период, что позволяет проводить стерилизацию данных графтов перед имплантацией. Использование поликапролактона для изготовления кондуита, исключает иммунные и аллергические реакций со стороны организма после имплантации. Благодаря низкой скорости биодеградации полимера обеспечивается длительная непрерывная доставка биоактивных молекул в окружающие ткани.

Сущность изобретения поясняется чертежами, где на фиг.1 изображена структура сосудистого графта, а - общий вид сосудистого графта в виде полой трубки, b - пористая структура стенки графта, образованная волокнами биополимера в процессе электроспининга, с -биомолекулы, инкорпорированные в полимерное волокно.

Исследование функционирования сосудистых PCL-графтов проведено на базе The Louis Stokes Cleveland Veterans Affairs Medical Center, Кливленд, Огайо, США.

Пример 1.

Сосудистые графты (внутренним диаметром 2 мм, толщина 100 мкм) из биодеградирующего полимера поликапролактона (poly(caprolactone), PCL) (М=80.000), были изготовлены методом электроспиннинга и имплантированы пяти самцам крыс линии Wistar (400-450 г). PCL-графт имплантировали в брюшную аорту между почечной артерией и бифуркацией аорты. После снятия зажимов ток крови через графт оценивали с помощью допплерографии. Через 6 недель животных выводили из эксперимента, и проводили оценку состояния анастомоза и самого графта по гистологическим препаратам с окраской гематоксилин-эозин, Маллори и Ван-Гизон.

При гистологическом исследовании в просвете графта и зонах анастомозов был выявлен сплошной слой неоинтимы. Внутренняя поверхность графта была покрыта эндотелиальными клетками, большинство которых имело увеличенные гиперхромные ядра и уменьшенный ядерно-цитоплазматический индекс по сравнению с эндотелиальными клетками собственной аорты. Графт был инфильтрирован клетками с морфологическими признаками миофибробластов и макрофагов. Участки накопления коллагена, богатые гликозаминогликанами, ламинином и фибронектином, были выявленны по всей толщине и длине графта. При макроскопической оценке имплантированного кондуита в периваскулярной ткани не было обнаружено признаков кровотечения.

Таким образом, проведенное исследование показало образование структур на PCL-графтах, характерных для кровеносного сосуда, что делает данные полимерные графты перспективными для использования в сердечно-сосудистой хирургии в качестве тканеинженерного сосудистого кондуита.