СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ОЛИГОСАХАРИДОВ, СОДЕРЖАЩИХ СИАЛОВУЮ КИСЛОТУ, И ПОЛУЧАЕМЫЕ В СВЯЗИ С ЭТИМ КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ ОЛИГОСАХАРИДЫ, СОДЕРЖАЩИЕ СИАЛОВУЮ КИСЛОТУ

Изобретение относится к способу выделения олигосахаридов, которые содержат заместитель, образованный от сиаловой кислоты (далее в данном описании - олигосахариды, содержащие сиаловую кислоту), и предпочтительно, композициям, содержащим сиалиллактозу, и в особенности, таким композициям, в которых отношение содержащих сиаловую кислоту олигосахаридов к фосфору, и предпочтительно, отношение сиалиллактозы к фосфору является относительно высоким. Кроме того, изобретение относится к получению и полученным композициям и применению таких композиций, в особенности, в продуктах детского питания.

Сиалиллактоза представляет собой молочный олигосахарид, который находится в молоке млекопитающих. Известно, что концентрация такого молочного олигосахарида, например в коровьем молоке, очень низкая; в женском молоке сиалиллактоза находится в концентрациях, которые безусловно значительно выше.

Сиалиллактоза имеет ряд важных функций. Так, известно, что она обладает пребиотической активностью, и описано ее бифидогенное действие. Кроме того, сиалиллактоза является антиадгезивом, что позволяет ей играть важную роль в ингибировании или предупреждении кишечных инфекций путем связывания патогенных бактерий и/или вирусов, и/или высвобождающихся токсинов, так что может быть предотвращена, с одной стороны, колонизация и, с другой стороны, может быть предотвращено действие токсинов. Также имеются сообщения, что сиалиллактоза может промотировать развитие головного мозга у детей.

Такие положительные действия также приписываются другим олигосахаридам, содержащим сиаловую кислоту.

Так как, как правило, задачей является сделать продукты питания для младенцев и новорожденных похожими на женское молоко настолько, насколько возможно, существует необходимость (в особенности, для составителей молочных смесей для младенцев) обогащать такие продукты олигосахаридами, содержащими сиаловую кислоту, и предпочтительно, сиалиллактозой. Это также является одной из задач настоящего изобретения.

Для того чтобы получить олигосахариды, содержащие сиаловую кислоту вообще, и сиалиллактозу в частности, в известном уровне техники уже предложены различные способы. Большое число этих способов направлено на ферментативное получение соединений, содержащих сиалильную группу, таких как сиалиллактоза, и в особенности, на использование ферментов, полученных из генетически модифицированных организмов, посредством чего, например, с помощью сиалидазы, сиалилтрансферазы и/или нейраминидазы, можно получить олигосахраиды, содержащие сиалильную группу, которые затем можно выделить дальнейшей обработкой.

Кроме того, известен ряд способов, посредством которых сиаловую кислоту и сиалиллактозу выделяют из молока посредством сочетания хроматографических методов и/или методов мембранного фильтрования.

Существенным недостатком существующих способов извлечения сиалилолигосахаридов и сиаловой кислоты является то, что они дают нужные соединения в относительно низких содержаниях или концентрациях, а также, кроме того, при таких способах в сиалилолигосахаридной композиции имеется высокое содержание фосфора. Известны публикации, в которых сообщается, что продукты, которые фосфорилированы до высокой степени, перевариваются плохо, по меньшей мере, хуже, могут вредно влиять на абсорбцию организмом железа и кальция и обычно образуют комплексы с двухвалентными катионами, необходимыми для нормальных физиологических процессов и желудочно-кишечном тракте, а также, кроме того, может подавляться действие некоторых ферментов в желудочно-кишечном тракте. Это может привести к проблемам, в особенности, для продуктов питания для младенцев и новорожденных.

В составе молока для детского питания количество фосфора определяется, в особенности, белковыми добавками. Дополнительные добавки фосфора через другие ингредиенты не рекомендуются и даже имеются рекомендации против этого введения. Также по такой причине предполагается предоставление композиций олигосахаридов, содержащих сиаловую кислоту, и в частности, композиций, содержащих сиалиллактозу, в которых отношение сиалильных групп к фосфору является настолько высоким, насколько возможно.

Задачей настоящего изобретения является способ, в котором используют методы разделения, приводящие к продукту с относительно малым количеством фосфорсодержащих соединений относительно олигосахарида, содержащего сиаловую кислоту. Это делает продукт весьма подходящим для использования в продуктах детского питания.

Такой способ также описан в US 6623954 В1. В данной публикации описан способ, в котором молочный поток, содержащий лактозу и сиалилолигосахариды, вводят в контакт с фитазой и β-галактозидазой, после чего молочный поток подвергают нанофильтрации и/или ультрафильтрации, посредством чего нужная сиалиллактоза остается в пептидной фракции; после стадии денатурации и последующей микрофильтрации получают сиалиллактозную фракцию. Необязательно перед стадией, на которой молочный поток вводят в контакт с ферментами, можно провести стадию, на которой удаляются положительно заряженные материалы, например, с помощью катионообменника или обратного осмоса.

Существенным недостатком такого способа является то, что в результате использования мембран существенная часть сиалилолигосахаридов, в том числе сиалиллактозы, не может быть извлечена, и что может понадобиться длительное время, прежде чем получится продукт, который удовлетворяет низкому отношению фосфора к сиалилолигосахаридам.

Настоящее изобретение осуществляется без необходимости использования ферментов для получения низкого содержания фосфора. Далее, изобретение позволяет извлекать сиалилолигосахариды с высокой степенью эффективности (высоким выходом) и селективностью (высокая чистота).

С этой целью изобретение в первом аспекте относится к способу выделения сиалилактозы из потока обезжиренного и, предпочтительно, безбелкового молока, в котором молочный поток подвергают обработке на стадии анионного обмена с использованием анионообменной смолы, предпочтительно, в форме свободного основания. Смола также характеризуется содержанием влаги 30-48%. На следующей стадии сиалиллактоза связывается с анионообменной смолой, предпочтительно, макропористого типа или типа геля. Макропористая или типа геля анионообменная смола предпочтительно имеет содержание влаги выше 45%, и наиболее предпочтительно, от 50 до 70%.

Первый тип анионообменной смолы, характеризующейся содержанием влаги 30-48%, предпочтительно представляет собой анионообменник типа геля, который обессоливает молочный поток, хотя при этом не связываются олигосахариды, содержащие сиалильные группы, и, в частности, сиалиллактоза, которые также присутствуют в солевой форме. Иными словами, такой анионообменник включает анионообменную смолу, которая имеет селективность в отношении отрицательно заряженных неорганических материалов, но не в отношении сиалиллактозы. Для такой цели необходимо, чтобы содержание влаги, т.е. содержание воды, не превышало 48%, и предпочтительно, не превышало 45%. При содержании влаги ниже 35%, и тем более, при содержании влаги ниже 30%, обессоливающая способность начинает слишком снижаться, чтобы при этом процесс был эффективным.

Содержание влаги в анионообменнике определяют следующим способом. Перед измерением содержания влаги в смоле удаляют связанную воду, например, заворачивая смолу в ткань и затем подвергая ее центрифугированию (центрифуга диаметром 30 см, 3000 об/мин); далее смолу взвешивают, например, в бюксе; после чего смолу сушат в течение 4 часов при постоянной температуре 105°C; затем смолу охлаждают в эксикаторе в течение 30 минут, после чего, в свою очередь, определяют массу сухой смолы; процентное содержание влаги (масс.%)=[(масса после сушки (г)/(масса влажной смолы)]•100%.

При таком обессоливании удаляется существенная часть отрицательно заряженных ионов, причем посредством этого не происходит удаления значительного количества сиалиллактозы (несмотря на отрицательный заряд).

Указанная анионообменная смола предпочтительно и, как правило, находится в форме свободного основания (гидроксидной форме), поскольку это приводит к наибольшей возможной обессоливающей способности. Подходящие анионообменные смолы представляют собой сильно сшитые гели полистирола-дивинилбензола, такие как Diaion SA20A, Diaion WA20A (от Mitsubishi).

Авторы обнаружили, что содержание влаги в анионообменной смоле, используемой для обессоливания, является важным для удаления золы (отрицательно заряженных неорганических веществ), с одной стороны, и несвязывания сиалиллактозы (SL), с другой стороны. С этой целью проверено большое число смол в условиях контроля.

При указанных определениях условия контроля следующие.

Собирают установку, состоящую из двух колонок. Первая колонка содержит 15 мл смолы Marathon С (от Dow; катионообменник формы Н⁺), вторая колонка содержит анионообменник в гидроксидной форме. Колонки проверяют, пропуская умягченный концентрат NF (см. также пример 1) со скоростью 0,5 мл/мин. После внесения приблизительно 5 объемов слоя можно определять извлечение SL. Соотношение между содержанием влаги и полученным извлечением SL далее отображается на графике на фиг.1.

Для того чтобы не получить какой-либо потери сиалалактозы во время такого процесса, рН полученного продукта составляет предпочтительно от рН 3 до рН 9.

Для того чтобы все это осуществить, в предпочтительном воплощении присутствующие катионы (в особенности, натрия и калия) также удаляют с помощью катионообменной смолы. Катионообменная смола находится в форме Н+. В предпочтительной конфигурации сначала удаляют катионы, а затем анионы.

После стадии обессоливания поток деминерализованного молока вводят в контакт с анионообменной смолой, предпочтительно, макропористой или типа геля, которая способна захватывать и связывать сиалиллактозу. Теоретически сиалиллактоза может связываться с любой аноинообменной смолой, поскольку неорганические соли уже удалены. Для того чтобы усилить эффективность, предпочтительно, содержание влаги в макропористой или типа геля анионообменной смоле составляет более 45%, и предпочтительнее, оно составляет от 50 до 70%. В таких смолах имеются более крупные поры, чем в анионообменнике, используемом на предшествующей стадии. Сиалиллактоза допускает простое элюирование из аноинообменной смолы небольшим объемом обычной соли или раствора другой соли, предпочтительно, кислого раствора соли.

Полученный элюат нейтрализуют предпочтительно с помощью разбавленной кислоты, например, хлороводородной кислоты, до рН от рН 3 до рН 9. Предпочтительно, рН конечного продукта составляет рН 6,5

Примерами подходящей для связывания сиалиллактозы аноинообменной смолы являются

Diaion SA21A, содержание воды 55-65%;

Diaion HPA25, содержание воды 58-68%;

Diaion WA10, содержание воды 63-69%;

Dowex 1×4, содержание воды 55-63%;

Dowex Marathon А, содержание воды 60-72%.

Для того чтобы адсорбировать сиалиллактозу, смолы должны находиться предпочтительно в форме свободного основания. Температура на стадии анионного обмена составляет предпочтительно ниже 20°C и предпочтительнее, ниже 10°C.

После элюирования сиалиллактозы из аноинообменной смолы можно получить продукт с содержанием сиалиллактозы свыше 4 масс.%, предпочтительно, свыше 5 масс.%, наиболее предпочтительно, свыше 8 масс.%, например, приблизительно 10%, относительно сухого вещества. Кстати, содержание сиалиллактозы относительно сухого вещества можно дополнительно повысить, используя обычные методы, такие как, например, нанофильтрация. Как правило, содержание сиалиллактозы в продукте, полученном согласно способу по изобретению, изменяется от 8 до 15%, хотя еще возможно достигнуть более высоких концентраций. Одним из способов достижения еще более высоких концентраций является вымывание большего количества лактозы из анионообменной смолы. Это можно осуществить, продлевая промывание колонки водой перед элюированием соли.

Молочный поток, обработанный анионообменной смолой, не содержит жира, и если содержит, то по меньшей мере, менее 0,5, предпочтительнее, менее 0,2 и наиболее предпочтительно, менее 0,1 масс.%. Весьма предпочтительно для такой молочной фракции отсутствие белка. Особым преимуществом является исходный поток сыворотки, и предпочтительнее, фильтрат сыворотки (whey permeate). Кстати, не является критическим обстоятельство, от какого млекопитающего происходит молоко, и хорошие результаты можно получить, когда исходным материалом является коровье молоко, овечье молоко, козье молоко, верблюжье молоко или лошадиное молоко.

В предпочтительном воплощении молочный поток, и предпочтительнее, поток сыворотки, и наиболее предпочтительно, поток фильтрата сыворотки, прежде чем его подвергнут любой из двух стадий анионного обмена, умягчают. На такой стадии умягчения поливалентные ионы, например ионы кальция и фосфат-ионы, удаляются из молочного потока. Это можно сделать, например, преципитацией соответствующих ионов или посредством обмена таких ионов на, например, ионы натрия и хлорид-ионы с помощью стадий ионного обмена. Такое воплощение иллюстрируется ниже в примере 1.

В другом предпочтительном воплощении изобретение относится к способу, в котором умягченный молочный поток, прежде чем его подвергнут любой из двух стадий анионного обмена, обрабатывают на стадиях нанофильтрации, так что образуется концентрат, имеющий, в абсолютном количестве, более низкое (по сравнению с исходным потоком до нанофильтрации) число однозарядных ионов и не являющихся белковыми азотсодержащих соединений, и в особенности, мочевины. Такое воплощение иллюстрируется ниже в примере 2.

Используя способ по изобретению, получают сиалиллактозу с высоким массовым соотношением сиалиллактозы к фосфору. Как правило, такое соотношение согласно изобретению, по меньшей мере, равно 6 или выше 6, предпочтительно, равно 7 или выше 7, предпочтительнее, равно 9 или выше 9, и еще предпочтительнее, равно 10 или выше 10.

Для вычисления указанного отношения определяют содержание сиалиллактозы как сумму содержания 3'-SL и 6'-SL на единицу массы продукта.

В частности, концентрацию сиалиллактозы определяют с помощью хроматографического метода на анионообменнике (колонка РА-1, Dionex). Сиалиллактозу обнаруживают с помощью импульсного амперометрического детектора. Содержание сиалиллактозы вычисляют как сумму содержания 3'-сиалиллактозы и 6'-сиалиллактозы.

Содержание фосфора определяют как общее содержание фосфора (после разложения азотной кислотой) на единицу массы продукта согласно «Официальному методу 973.55 АО АС (анализ фосфора в воде)».

Затем вычисляют соотношение сиалиллактозы к фосфору.

Кстати, известные способы, которыми выделяют сиалиллактозу из молока, как правило, приводят к продуктам, в которых соотношение сиалиллактоза/фосфор ниже 5.

Согласно изобретению на стадии умягчения удаляются примерно 50-60% фосфорсодержащих соединений; на стадии, на которой используют анионообменник с содержанием влаги от 30 до 48%, удаляются другие 30% фосфорсодержащих соединений; и на стадии, на которой используют анионообменник, предпочтительно, макропористый или типа геля, удаляется еще приблизительно 10% фосфорсодержащих соединений.

Во втором аспекте изобретение относится к композиции, содержащей олигосахариды, содержащие сиаловую кислоту, которые можно получить с использованием способа по изобретению, причем содержание сиалиллактозы в расчете на сухое вещество составляет, по меньшей мере, 4 масс.% и массовое соотношение сиалиллактоза/фосфор превышает 6. В такой композиции, помимо сиалиллактозы, также присутствуют сиаловая кислота, лактоза, небелковые азотсодержащие соединения и, возможно, белок.

Предпочтительные воплощения имеют вышеуказанные составляющие и массовые соотношения.

В третьем аспекте изобретение относится к применению композиции по изобретению, содержащей олигосахариды, содержащие сиаловую кислоту, и в особенности, сиалиллактозу, в продукте питания для детей, и в особенности, таком, что получают содержание сиалилактозы, соответствующее ее содержанию в женском молоке.

Это не означает, в данном случае, что сиалиллактозу нельзя использовать в других применениях, таких как продукты для лечебного и энтерального питания, или, например, для косметического применения как ингредиента в кондиционерах для ухода за кожей, относящихся к модуляции активности пигментов и/или восстановлению повреждений кожи.

Теперь настоящее изобретение будет поясняться приведенными далее примерами, не являющимися ограничительными. Когда в примерах или в тексте выше используются проценты или частей/млн, они - если не указано иное - соответственно, представляют собой массовые проценты и массовые части на миллион составляющей относительно массы композиции, включающей данную составляющую.

Пример 1

Поток фильтрата сыворотки с содержанием сухого вещества 6,66% пропускают последовательно через анионообменную смолу (ХА3112 (от Applexion); в хлоридной форме) и через катионообменную смолу (ХА 2033 (от Applexion); в натриевой форме). В данном процессе, в зависимости от применяемой загрузки, находят, что некое количество фосфат-ионов и ионов кальция обменивается на хлорид-ионы и ионы натрия, соответственно. Когда вносят примерно 25 объемов слоя (BV) фильтрата сыворотки, находят, что удаляется примерно 90% присутствующих ионов кальция и примерно 50-60% присутствующих фосфат-ионов. Экспериментальные данные по типичному умягчению фильтрата суммированы в таблице 1.

Пример 2

Продукт, полученный в примере 1, концентрируют с использованием нанофильтрации. Нанофильтрацию осуществляют с помощью мембраны NF-2540 (DOW). Во время процесса фильтрации используют давление через мембрану в интервале 2000-2500 кПа (20-25 бар). В результате содержание сухих веществ в концентрате возрастает. Так, содержание сухих веществ в концентрате может составлять 15%, в то время как также возможно прекращение фильтрации, когда содержание сухих веществ достигает 20%. Таким путем удаляется большая часть присутствующих неорганических веществ. Экспериментальные результаты типичной стадии нанофильтрации суммированы в таблице 2.

Пример 3

Продукт, полученный в примере 2 (200 л), с содержанием сухих веществ примерно 20%, последовательно пропускают через колонки, указанные далее.

Колонка 1 содержит 25 литров катионообменника (Applexion 748Н).

Колонка 2 содержит 25 литров аионообменника (Diaion SA20).

Смолы переводят в форму Н⁺ и ОН^-, соответственно. Скорость потока, с которой вносят продукт, составляет 100-125 л/час. Исключая «sweet-on» и включая «sweet-off» можно получить примерно 220-230 литров продукта.

Полученный таким образом продукт является полностью обессоленным и еще содержит фактически всю сиалиллактозу. Как правило, находят, что выход превышает 90%. Типичные результаты такой стадии суммированы в таблице 3.

Пример 4

На следующей стадии сиалиллактозу, присутствующую в продукте примера 3, связывают с различными анионообменниками. С этой целью полученный продукт (220 л) пропускают через анионообменник (объем колонки = 5л, смола = ХА90ОН, от Applexion). В результате такой обработки по существу вся присутствующая сиалиллактоза связывается с анионообменной смолой.

После промывки колонки связанную SL можно извлечь элюированием анионообменника неким количеством соли (40 л; 0,2 М раствор NaCl). Во время элюирования рН приближают к нейтральному с использованием хлороводородной кислоты до примерно рН 6,5. Типичные результаты суммированы в таблице 4.