×
10.06.2013
216.012.46f6

СРЕДСТВО ДЛЯ АНТИАГРЕГАТНОЙ, АНТИВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ И ЦИТОПРОТЕКТОРНОЙ ТЕРАПИИ

Вид РИД

Изобретение

Юридическая информация Свернуть Развернуть
Краткое описание РИД Свернуть Развернуть
Аннотация: Изобретение относится к медицине и касается средства для профилактики и лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы. Синтезирован пептид 3-меркаптопропионил-Phe-Ile-Ile-Arg-Lys-Pro-Asp-Lys-NH, который при большей доступности и более низкой стоимости, чем у известных аналогов, обладает антиагрегатными, антивоспалительными и цитопротекторными свойствами. Изобретение обеспечивает снижение спонтанной агрегации тромбоцитов, ингибирование воспаления путем снижения секреции гистамина, защиту клеток от нейротоксического действия тромбина. 4 пр.
Основные результаты: Пептид 3-меркаптопропионил-Phe-Ile-Ile-Arg-Lys-Pro-Asp-Lys-NH в качестве средства антиагрегатной, антивоспалительной и цитопротекторной терапии.
Реферат Свернуть Развернуть

Предлагаемое изобретение относится к медицине, в частности к средствам для профилактики и лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы.

Одной из причин смертности у больных с различными сердечнососудистыми патологиями и острыми нарушениями мозгового кровообращения (ОНМК) являются тромботические осложнения. Важнейшими участниками развития подобных осложнений являются тромбоциты, активация которых играет ключевую роль в запуске механизмов тромбообразования. Известно, что тромбоциты в условиях патологии приобретают способность спонтанно агрегировать и образовывать агрегаты малого размера, которые могут циркулировать в крови больных и являться центрами, на базе которых в участках повреждения эндотелия формируются тромбы. Образование подобных агрегатов зависит от целого ряда причин, важнейшими из которых являются воспаление и инициация образования тромбина, что ведет к повышению экспрессии клетками сердечно-сосудистой, иммунной и нервной систем рецепторов тромбина и других протеиназ, называемых рецепторами, активируемыми протеиназами (ПАР).

Известны четыре подтипа ПАР: ПАР-1, ПАР-2, ПАР-3 и ПАР-4. Согласно последним данным, блокада антагонистами ПАР функций этих рецепторов ингибирует активацию тромбоцитов, вызванную тромбином, и блокирует процессы воспаления и гибели клеток (апоптоз), в том числе нейронов. У человека опосредованная тромбином активация тромбоцитов происходит через ПАР-1 и ПАР-4, поэтому поиск и отбор антагонистов ПАР направлены на разработку препаратов, способных ингибировать именно эти рецепторы. Наиболее важен ПАР-1 - основной рецептор тромбина, опосредующий события, связанные с воспалением и активацией свертывания крови. Специфичность связывания ПАР-1 с тромбином почти на 2 порядка выше, чем у ПАР-3 и ПАР-4, поэтому ПАР-4 человека активируется тромбином в более высоких концентрациях, чем ПАР-1.

Воспаление и инициация образования тромбина является одной из причин развития атерогенеза и его осложнений - атеротромбоза, ОНМК (инсульта) и др. Следует отметить, что использование известных медикаментов аспирина, его комбинации с клопидогрелем или комбинации аспирина с дипиридамолом - для снижения тромбообразования и исключения повторных инсультов у больных с ишемическими инсультами артериального происхождения приводит к побочным эффектам (кровотечениям и расстройству системы пищеварения).

Разработка новых высокоэффективных средств антиагрегатной, антивоспалительной и цитопротекторной терапии в настоящее время является весьма актуальной.

В международной заявке WO/2004/098628, C07K 5/09 предлагается для подавления активации процесса агрегации тромбоцитов использовать синтетические аналоги пептида Arg-Pro-Pro-Gly-Phe, которые содержат одну или несколько аминокислотных замен. Недостатком предлагаемых пептидных аналогов является то, что они являются прямыми ингибиторами молекулы тромбина. Они блокируют протеолитическое расщепление тромбином всех его субстратов (в том числе амидных и белковых) и таким образом, замедляя агрегацию тромбоцитов, одновременно значительно удлиняют время свертывания крови, что является отрицательным побочным действием.

В работах [Andrade-Gordon Р. а. о. PNAS. 1999; v.96(22): р.12257-12262 и Дериан С.К и др. Биохимия 2002, т.67, с.66-76] был синтезирован и испытан в качестве антогониста ПАР-1 пептидомиметик RWJ-56110 следующей структуры:

RWJ-56110 - [(S)-N-[(1S)-3-амино-1-[[(фенилметил)амино)карбонил]-[[[[1-(2,6-дихлорфенил)метил]-3-(1-пирролидинилметил)-1Н-индол-6-ил]амино]карбонил]амино]-3,4-дифторбензолпропанамид.

Однако RWJ-56110 ингибирует агрегацию, вызванную только очень низкими концентрациями тромбина, а при их повышении оказывается несостоятельным, что ограничивает возможность его применения. Кроме того, синтез подобных соединений достаточно сложен.

В работе [Morley D. а.о. Pharm. Rev. 2002, v.54: p.203] был синтезирован пептид 3-меркаптопропионил-Phe-Cha-Cha-Arg-Lys-Pro-Asp-Lys-NH2, который проявляет активность как ингибитор ПАР-1. Как видно из приведенной структуры, последовательность этого пептида содержит два остатка β-циклогексилаланина (Cha). Следует отметить, что производное этой аминокислоты является дорогостоящим: стоимость необходимого для синтеза производного этой аминокислоты в 18 раз выше стоимости аналогичных производных природных бифункциональных аминокислот. Таким образом недостатком пептида является его дороговизна и низкая доступность.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка эффективного средства антиагрегатной, антивоспалительной и цитопротекторной терапии в виде пептида антагониста ПАР-1, отличающегося более низкой стоимостью и доступностью по сравнению с известными аналогами.

Поставленная цель была решена синтезом пептида следующей структуры: S-меркаптопропионил-Phe-Ile-Ile-Arg-Lys-Pro-Asp-Lys-NHz (иПАР-1-I).

Неожиданно оказалось, что включение в структуру пептида вместо двух остатков β-циклогексилаланина, остатков изолейцина позволяет получить соединение, обладающее антиагрегатной, антивоспалительной и цитопротекторной активностью и в то же время значительно более дешевое, чем пептид-аналог. Испытания иПАР-1-I ex vivo показали, что использование иПАР-1-I позволяет в 3 раза снизить степень спонтанной агрегации тромбоцитов (СПА) больных ишемической болезнью сердца (ИБС). иПАР-1-I обладает также антивоспалительной и цитопротекторной активностью.

Нижеприведенные примеры иллюстрируют предлагаемое изобретение.

Пример 1.

Получение пептида 3-меркаптопропионил-Phe-Ile-Ile-Arg-Lys-Pro-Asp-Lys-NH2 (иПАР1-I).

Для твердофазного синтеза пептида (ТФС) использовали производные аминокислот L-ряда. Пептид синтезировали с использованием Fmoc-методологии, то есть в сочетании с Nα-Fmoc-защитой для блокирования боковых цепей аминокислот применяли кислотолабильные защитные группы: Воc - для ε-аминогруппы лизина, But-β-карбоксильной функции аспарагиновой кислоты, Trt - для карбоксамидной функции аспарагина и SH-группы меркаптопропионовой кислоты, а также Pmc - для гуанидиновой функции аргинина. Синтез проводили на нерастворимом полимерном носителе - сополимере стирола с 1% дивинилбензола с якорной группой, предназначенной для получения амидов пептидов - полимере Ринка с содержанием аминогрупп 0,64 ммоль/г. Синтез пептида проводили исходя из 0,2 г (0,125 ммоль) полимера, начиная с С-конца и наращивая пептидную цепь по одной аминокислоте. Для отщепления Nα-Fmoc-защиты использовали 25% раствор 4-метилпиперидина, для создания амидной связи применяли TBTU/HOBt в присутствии диизопропилэтиламина. Для контроля полноты реакций в процессе ТФС применяли тест Кайзера. По окончании ТФС целевой продукт отщепляли от полимера с одновременным удалением всех защитных групп боковых цепей аминокислот действием трифторуксусной кислоты. Полученный «сырой» пептид иПАР1-1 был очищен с помощью препаративной ВЭЖХ. Пептид охарактеризован данными спектроскопии ЯМР и масс-спектрометрии. В масс-спектре этого вещества присутствовал молекулярный ион, соответствующий корректной молекулярной массе целевого продукта (М=1217,53). Спектр 1H-ЯМР подтверждает структуру синтезированного пептида.

Пример 2.

Испытание антиагрегатного действия пептида иПАР1-I.

Испытание полученного пептида проводили с использованием крови больных ишемической болезнью сердца ИБС, верифицированной с помощью коронарографии. Кровь больных ИБС получали самотеком из кубитальной вены в пробирку с 0,13 М раствором цитрата натрия (рН 7,3). Через 15 мин после отбора и транспортировки при комнатной температуре кровь центрифугировали для получения обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП). Оценка агрегационной способности тромбоцитов в ОТП проводилась на лазерном агрегометре НПФ «Биола» (Россия), позволяющем оценивать спонтанное образование агрегатов (что соответствует кривым по показаниям среднего размера агрегатов, выражаемого в относительных единицах), и образование агрегатов в ответ на высокие концентрации индукторов (кривые, регистрирующие процесс светопропускания, выраженный в %). Обогащенную тромбоцитами плазму до записи процесса агрегации инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре с соответствующими иПАР. В качестве селективного агониста ПАР-1 (для запуска механизма спонтанной агрегации) использовали пептид-агонист ПАР-1 - SFLLRN.

Исследование антиагрегатного действия иПАР - 1-I показали, что иПАР - 1-I снижает спонтанную агрегацию тромбоцитов больного ИБС с высокими цифрами этого показателя почти до нормальных значений. Спонтанная агрегация тромбоцитов снижалась в 3 раза.

Пример 3.

Испытание антивоспалительного действия пептида иПАР1-I.

Среди клеток, участвующих в воспалительных ответах организма, важная роль принадлежит тучным клеткам. Тучные клетки экспрессируют множество рецепторов, в том числе рецепторы семейства ПАР. Наличие на тучных клетках рецепторов ПАР отвечает за их реактивность в отношении тромбина. Активированные тучные клетки освобождают широкий спектр провоспалительных медиаторов, в том числе гистамин. Методика оценки антивоспалительного действия иПАР1-I была основана на измерении секреции тучными клетками гистамина в присутствии иПАР-1-I.

Тучные клетки брали у белых самцов беспородных крыс весом 250-350 г. Острое воспаление у крыс вызывали внутрибрюшинным введением тиогликолата Na. Тучные клетки отделяли центрифугированием перитонеальной жидкости, суспендировали в HEPES-NaCl и очищали в градиенте фиколла. Гистамин, выделяемый тучными клетками, определяли с помощью его конденсации с ортофталевым альдегидом, в результате чего образуется флуоресцирующий комплекс. Флуоресценцию измеряли на плашечном спектрофлуориметре Thermo Fluoroscan Ascent при 460 нм, возбуждая при 355 нм.

Исследование антивоспалительного действия иПАР1-I, соответственно ингибирования им секреции тучными клетками гистамина, показало, что иПАР1-I способен ингибировать воспаление, значительно снижая секрецию гистамина.

Пример 4.

Испытание цитопротекторного действия пептида иПАР1-I.

Исследования проводили на первичных культурах нейронов гиппокампа (9-10 дней) мозга одно-трехдневных крысят линии Вистар. Полученную суспензию клеток переносили на покровные стекла, покрытые поли-D-лизином. Затем удаляли неприкрепившиеся клетки и добавляли культуральную среду. На 3-4 день добавляли арабинозид на сутки для подавления роста глиальных клеток. Клетки оставляли в течение 7-10 дней в инкубаторе. Смену 1/3 среды в клетках осуществляли каждые 3 дня. Полученная культура содержала не более 5% глиальных клеток.

Гибель/выживаемость нейронов в культуре определяли через 24 часа после 45-минутного действия тромбина или после совместной инкубации иПАР1-I с тромбином. Пептидом иПАР1-I (в концентрациях от 0,4 до 100 нМ/л) обрабатывали нейроны за 10 мин до добавления тромбина. В качестве контроля нейроны обрабатывали HEPES-солевым буфером (HBSS). Гибель/выживаемость нейронов оценивали биохимическим МТТ (3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) методом. Водный раствор МТТ добавляли в культуральную среду до конечной концентрации 1 мг/мл и инкубировали клетки 1,5 часа при 37°С. Затем среду отбирали и добавляли DMSO для растворения формазанов. Оптическую плотность измеряли спектрофотометрически (590 нм) на универсальном микропланшетном спектрофотометре Anthos Lucy-1. Оценивали результаты в процентах по отношению к контролю.

Было обнаружено, что тромбин в концентрации 100 нМ/л вызывал гибель более 20% нейронов (снижение выживаемости по отношению к контролю). Прединкубация клеток с иПАР1-I до добавления тромбина защищала их практически полностью от нейротоксического действия тромбина (уровень живых клеток по сравнению с контрольными значениями составлял 98%).

Таким образом синтезированный пептид обладает антиагрегатным, антивоспалительным и цитопротекторным действием при большей доступности по сравнению с ближайшим аналогом.

Пептид 3-меркаптопропионил-Phe-Ile-Ile-Arg-Lys-Pro-Asp-Lys-NH в качестве средства антиагрегатной, антивоспалительной и цитопротекторной терапии.
Источник поступления информации: Роспатент

Показаны записи 1-10 из 77.
10.01.2013
№216.012.18e6

Способ получения субстанции l-лизин-альфа-оксидазы

Изобретениео тносится к биотехнологии и медицине, а именно к онкологи. Предложен способ получения субстанции L-лизин-альфа-оксидазы (ЛО) с использованием штамма-продуцента Trichoderma cf. aureoviride Rifai BKMF-4268D. Проводят ферментацию на содержащей источники азота, фосфата и пшеничные...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002471866
Дата охранного документа: 10.01.2013
10.01.2013
№216.012.1a0d

Способ оценки риска прогрессирования немелкоклеточного рака легкого после хирургического лечения

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ оценки риска прогрессирования немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) у больных после хирургического лечения. Определяют количество IgG типа аутологичных антител к нативному секреторному муцину MUC1 (анти-sMUC1 AAT) в сыворотке крови у...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002472161
Дата охранного документа: 10.01.2013
20.01.2013
№216.012.1c66

Способ получения углеводородов топливного ряда из возобновляемого сырья

Изобретение относится к способу селективного получения углеводородов, пригодных для использования в качестве дизельного топлива, заключающийся в декарбонилировании/декарбоксилировании смеси карбоновых кислот С-С (насыщенных и ненасыщенных) в растворителе в атмосфере водорода в присутствии...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002472764
Дата охранного документа: 20.01.2013
20.01.2013
№216.012.1da5

Способ прогнозирования послеоперационных осложнений у больных с опухолевым поражением легкого

Изобретение относится к области медицины. Способ состоит в том, что за 7-10 дней до операции проводят иммунологический анализ образцов крови, определяют общее количество лейкоцитов и относительное количество лимфоцитов в периферической крови. Дальнейший выбор параметров дополнительного...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002473083
Дата охранного документа: 20.01.2013
27.01.2013
№216.012.1e9a

Способ консервативного лечения дакриостеноза

Изобретение относится к офтальмологии и предназначено для консервативного лечения дакриостенозов. В слезный каналец вводят гель глазной на основе фурацилина. Гель глазной на основе фурацилина вводят с помощью шприца в объеме 3 мл, через сутки, всего 8-10 раз. Способ обеспечивает восстановление...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002473335
Дата охранного документа: 27.01.2013
27.01.2013
№216.012.2007

Способ выявления мутаций brca1 5382insc и снек2 1100delc

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу выявления мутаций BRCA1 5382insC и CHEK2 1100delC в геномной ДНК. Предложенное изобретение может быть использовано для определения частот встречаемости мутаций в популяции при анализе масштабных выборок ДНК. Способ включает...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002473700
Дата охранного документа: 27.01.2013
10.02.2013
№216.012.22d9

Способ лечения метастазов печени

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для лечения метастазов печени. Для этого в печеночную артерию вводят гидрофобную суспензию Терафтала, содержащую рентгеноконтрастное вещество. Осуществляют рентгеноконтроль в процессе введения. Далее перорально...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002474423
Дата охранного документа: 10.02.2013
20.02.2013
№216.012.27fc

Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности с1 ингибитора по способности связываться с igal-протеазой

Группа изобретений относится к медицинской иммунологии, а именно к способу определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах и набору для его осуществления. Способ определения предусматривает:...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002475756
Дата охранного документа: 20.02.2013
27.02.2013
№216.012.29c3

Фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии

Изобретение относится к четвертичным аммониевым солям мезо-тетра[1- (4'-бромбутил)-3-пиридил]бактериохлорина общей формулы где , . Эти соединения обладают высокой фотоиндуцированной активностью и могут применяться для фотодинамической терапии злокачественных новообразований в качестве...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002476218
Дата охранного документа: 27.02.2013
20.04.2013
№216.012.35aa

Способ консервативного лечения дакриостеноза

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и предназначено для консервативного лечения дакриостеноза. В слезный каналец вводят гель глазной офлоксацин. Гель глазной офлоксацин вводят в объеме 3 мл, через сутки, всего 8-10 раз. Способ обеспечивает восстановление проходимости...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002479291
Дата охранного документа: 20.04.2013
Показаны записи 1-10 из 70.
10.01.2013
№216.012.18e6

Способ получения субстанции l-лизин-альфа-оксидазы

Изобретениео тносится к биотехнологии и медицине, а именно к онкологи. Предложен способ получения субстанции L-лизин-альфа-оксидазы (ЛО) с использованием штамма-продуцента Trichoderma cf. aureoviride Rifai BKMF-4268D. Проводят ферментацию на содержащей источники азота, фосфата и пшеничные...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002471866
Дата охранного документа: 10.01.2013
10.01.2013
№216.012.1a0d

Способ оценки риска прогрессирования немелкоклеточного рака легкого после хирургического лечения

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ оценки риска прогрессирования немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) у больных после хирургического лечения. Определяют количество IgG типа аутологичных антител к нативному секреторному муцину MUC1 (анти-sMUC1 AAT) в сыворотке крови у...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002472161
Дата охранного документа: 10.01.2013
20.01.2013
№216.012.1c66

Способ получения углеводородов топливного ряда из возобновляемого сырья

Изобретение относится к способу селективного получения углеводородов, пригодных для использования в качестве дизельного топлива, заключающийся в декарбонилировании/декарбоксилировании смеси карбоновых кислот С-С (насыщенных и ненасыщенных) в растворителе в атмосфере водорода в присутствии...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002472764
Дата охранного документа: 20.01.2013
20.01.2013
№216.012.1da5

Способ прогнозирования послеоперационных осложнений у больных с опухолевым поражением легкого

Изобретение относится к области медицины. Способ состоит в том, что за 7-10 дней до операции проводят иммунологический анализ образцов крови, определяют общее количество лейкоцитов и относительное количество лимфоцитов в периферической крови. Дальнейший выбор параметров дополнительного...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002473083
Дата охранного документа: 20.01.2013
27.01.2013
№216.012.2007

Способ выявления мутаций brca1 5382insc и снек2 1100delc

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу выявления мутаций BRCA1 5382insC и CHEK2 1100delC в геномной ДНК. Предложенное изобретение может быть использовано для определения частот встречаемости мутаций в популяции при анализе масштабных выборок ДНК. Способ включает...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002473700
Дата охранного документа: 27.01.2013
10.02.2013
№216.012.22d9

Способ лечения метастазов печени

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для лечения метастазов печени. Для этого в печеночную артерию вводят гидрофобную суспензию Терафтала, содержащую рентгеноконтрастное вещество. Осуществляют рентгеноконтроль в процессе введения. Далее перорально...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002474423
Дата охранного документа: 10.02.2013
20.02.2013
№216.012.27fc

Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности с1 ингибитора по способности связываться с igal-протеазой

Группа изобретений относится к медицинской иммунологии, а именно к способу определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах и набору для его осуществления. Способ определения предусматривает:...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002475756
Дата охранного документа: 20.02.2013
27.02.2013
№216.012.29c3

Фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии

Изобретение относится к четвертичным аммониевым солям мезо-тетра[1- (4'-бромбутил)-3-пиридил]бактериохлорина общей формулы где , . Эти соединения обладают высокой фотоиндуцированной активностью и могут применяться для фотодинамической терапии злокачественных новообразований в качестве...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002476218
Дата охранного документа: 27.02.2013
20.04.2013
№216.012.36d0

Фотосенсибилизатор для фотодинамической терапии

Описывается новый мезо-тетра[1-(4'-бромбутил)-3-пиридил]бактериохлорин тетрабромид формулы
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002479585
Дата охранного документа: 20.04.2013
20.04.2013
№216.012.36d1

Способ получения безметальных тетраазахлоринов

Описывается новый способ получения безметальных тетраазахлоринов общей формулы R=R=R=R=H, Br, Cl; R=R=R=H, R=NO, PhSO, PhS; R=R=R=H, R=NO, PhSO, t-Bu; R=R=H, R=R=PhS, путем осуществления смешанной конденсации тетраметилсукцинонитрила (ТМСН) с соответствующими 1,2-динитрилами ненасыщенных...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002479586
Дата охранного документа: 20.04.2013
+ добавить свой РИД