СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ СЕЛЕНА В КРОВИ

Изобретение относится к аналитической химии, а также может быть использовано в медицине для определения содержания селена в крови и контроля состояний селеновой недостаточности человека и животных.

Известен способ определения селена в крови, основанный на определении интенсивности флуоресценции его соединений (Лебедев П.А., Лебедев А.А. Модификация спектрофлуориметрического метода определения селена в крови. // Химико-фарм. журн. - 1996. - Т.30, №10, с.54-55). Способ заключается в следующем. Пробы сыворотки крови (0.5 мл) обрабатывают в пробирках смесью концентрированных азотной и соляной кислот (3 мл). Пробирки нагревают постепенно от 100°С до 180-190°С в течение 2.5 ч, пока в каждой пробирке не останется примерно 1 мл жидкости. После охлаждения добавляют в каждую пробирку 5 N HCl (0.4 мл) и вновь нагревают при 130-150°С в течение 15 мин для превращения Se (VI) в Se (IV). После охлаждения добавляют маскирующий реактив (2 мл). Он представляет собой смесь из:

1) ЭДТА (комплексон III) 7.6 г, вода 80 мл, 5 N раствор аммиака в количестве, необходимом для растворения осадка;

2) гидроксиламин солянокислый 24 г, вода 500 мл;

3) метиловый оранжевый, 0.05% водный раствор, 40 мл.

Затем добавляют 7.5N раствор аммиака (по каплям) до появления желтого окрашивания и 1N HCl (по каплям) до появления розовой окраски. Затем объем содержимого пробирок доводят до 9 мл дистиллированной водой. Селено-диазоловый комплекс получают добавлением к пробе 1 мл раствора 2,3 - диаминонафталина (ДАН) в 0.1N HCl и последующим выдерживанием на водяной бане при 50°С в течение 30 минут. После охлаждения и добавления 5 мл гептана содержимое перемешивают в миксере 30 мин для экстракции комплекса.

После отстаивания пробы в течение 30 мин отделяют органический слой и измеряют его флуоресценцию на длине волны 525 нм (λ_возб=366 нм). Полученные результаты сравнивают с величиной флуоресценции селенодиазоловых комплексов, полученных на основе стандартных растворов, содержащих 50, 100, 150, 200 мкг селена на 1 л воды.

Как отмечают авторы этой работы, стандартные растворы селенистой кислоты, проходящие ту же обработку, что и пробы плазмы и сыворотки крови, не дают воспроизводимых результатов, в отличие от проб крови. Поэтому в качестве вторичного стандарта применяют нормальную лошадиную сыворотку.

Приведенный способ имеет существенные недостатки. В технологии используется маскирующий реактив, а также смесь концентрированных азотной и соляной кислот. Их многократное нагревание и охлаждение для получения четырехвалентного селена значительно усложняют технологический процесс. Сравнение величин флуоресценции селенодиазоловых комплексов с таковой для стандартных растворов может внести существенный вклад в погрешность определяемых величин. Это связано с тем, что интенсивность флуоресценции зависит от многих факторов: параметров возбуждающего излучения и регистрирующей оптической системы, температуры, влажности, давления, освещенности помещения и др. [Паркер С. Фотолюминесценция растворов. М.: Мир, 1972. 504 с.]. Поэтому даже калибровка измерительной аппаратуры не позволяет быть уверенным в точности измерений.

Задачей изобретения является повышение точности определения концентрации селена в крови с помощью специального метода обработки спектральных данных.

Технический результат достигается за счет того, что в способе определения концентрации селена в крови, включающем получение сыворотки крови, превращение Se (VI) в Se (IV), получение селенодиазолового комплекса, его экстракцию и измерение флуоресценции при длине волны возбуждения λ_возб=366 нм, построение градуировочного графика, выполненного на основе измерений стандартных растворов, отсутствуют маскирующий реактив и концентрированные азотная и соляная кислоты, для определения концентрации селена измеряются спектры флуоресценции смеси (λ_рег=480÷600 нм), а обработку спектральных данных производят используя метод Гауссово-Лоренцевых кривых с последующим построением градуировочного графика.

На фиг.1 изображены спектры флуоресценции стандартных растворов при различных концентрациях селена (1-1.05 мМ; 2-2.1 мМ; 3-4.2 мМ). На фиг.2 продемонстрировано разложение спектров флуоресценции смеси на составляющие методом Гауссово-Лоренцевых кривых. На фиг.3 изображен градуировочный график, имеющий линейную функцию в выбранном диапазоне концентраций, учитывающий выход реакции образования СДК, погрешность температуры и концентраций, статистическую обработку спектральных данных мешающих элементов и других факторов.

Способ осуществляют следующим образом.

Кровь предварительно центрифугируют при 8000 об/мин в течение 10 минут для отделения клеточных элементов. К 1 мл полученной сыворотки добавляют 2.5 мл 0.1 N раствора HCl. В течение 30 минут смесь постепенно нагревают до 60°С для перевода селена (VI) в селен (IV), пока объем не достигнет 1 мл. Затем, в предварительно остуженную смесь, добавляют 2.5 мл ДАН, 1 мл ЭДТА и 50 мл 0.1 N HCl. Полученную смесь нагревают при температуре 80°С в течение 20 минут. Затем смесь остужают до температуры 37°С и экстрагируют 10 мл раствора циклогексана. Затем на спектрофлуориметре проводят измерения спектров флуоресценции смеси (λ_рег=480÷600 нм). Длина волны возбуждения составляет 366 нм, так как находится в максимуме поглощения селендиазолового комплекса (СДК).

Для построения градуировочного графика приготавливают серию стандартных растворов, для чего берут аликвоту раствора селенистой кислоты H₂SeO₃ с концентрацией 7.75·10^-3 М, добавляют к ней 2.5 мл ДАН, 1 мл ЭДТА и 50 мл 0.1 М HCl. Аликвота раствора селенистой кислоты составляет от 5 до 30 мкл. Смесь нагревают при температуре 80°С в течение 20 минут, затем остужают до температуры 37°С и экстрагируют 10 мл раствора циклогексана. Затем измеряют спектры флуоресценции смеси в фазе циклогексана от 480 до 600 нм (фиг.1).

Обработка результатов спектральных данных. Спектры флуоресценции смеси раскладывают на составляющие методом Гауссово-Лоренцевых кривых (фиг.2), что достаточно просто с помощью современного программного обеспечения. Затем подсчитывают площадь под кривой каждого из составляющих спектра. Количество селена определяют исходя из соотношения

где S₅₁₅, S₅₆₀ - площадь под кривой спектров флуоресценции при максимумах 515 и 560 нм, характеризующих флуоресценцию СДК и ДАН соответственно;

0.27·10^-6 - концентрация ДАН перед нагреванием при 80°С, М;

С_СДК - концентрация СДК, М.

Из (1) получают выражение для концентрации селена

Истинную концентрацию селена в стандартных растворах определяют из закона разбавления растворов

- концентрация селенистой кислоты, равная 7.75·10^-3 М;

- аликвота селенистой кислоты, л;

V_р-ра - объем полученного раствора, л.

После обработки спектров стандартных растворов строят градуировочный график С_СДК=f(C_Seист), по которому находят концентрацию селена в пробе.

Спектры имеют два четко выраженных максимума (515 и 560 нм), первый из которых (515 нм) характеризуется флуоресценцией СДК, образованный в результате реакции [Паркер С. Фотолюминесценция растворов. М.: Мир, 1972. 520 с.]. Второй (560 нм) - флуоресценцией не израсходованного ДАН. С увеличением концентрации селена наблюдается характерное увеличение интенсивности флуоресценции СДК в выбираемом диапазоне концентраций.

Разложение спектров методом Гауссово-Лоренцевых кривых позволяет разделять флуоресценцию каждого из компонентов смеси, что дает возможность наблюдать существенное различие отношения интенсивностей максимумов каждого из компонентов смеси в спектре флуоресценции от такового после разложения спектров на составляющие (фиг.2). В связи с этим целесообразно использовать разложение спектра на составляющие методом Гауссово-Лоренцевых кривых для более точной обработки экспериментальных данных.

После этого строят градуировочный график С_СДК=f(C_Seист). Чем больше различий между С_СДК и C_Seист, тем больше влияние описанных выше факторов. Концентрацию селена в крови находят по градуировочному графику (фиг.3).