КУЛЬТУРА МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ КОСТНОГО МОЗГА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА (Medulla ossium Bos taurus), ДЛЯ ВЕТЕРИНАРИИ, КЛЕТОЧНОЙ И ТКАНЕВОЙ ИНЖЕНЕРИИ

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной и сельскохозяйственной биотехнологии, в частности к получению культуры мультипотентных мезенхимных стволовых клеток (ММСК) костного мозга (КМ) крупного рогатого скота (крс).

Огромный ущерб сельскому хозяйству наносят инфекции сельскохозяйственных животных, вызванные вирусами: парагриппа, лейкоза крупного рогатого скота, инфекционного ринотрахеита, диареи, трансмиссивного гастроэнтерита свиней, африканской чумы, ринопневмонии лошадей и другие. Особую опасность представляют инфекции, которые передаются от животного к человеку. Для борьбы с ними необходимо производить антигены, диагностические препараты, вакцины. Однако в биотехнологии промышленного производства до сих пор остается острая необходимость в разработке эффективных способов культивирования и наращивания патогенов in vitro на чувствительных биологических объектах. В связи с этим вопросы изучения развития инфекционных процессов в культуре клеток имеют огромное значение для исследований, связанных с безопасностью как сельскохозяйственных животных, так и человека. Следует заметить, что отсутствие адекватных модельных клеточных систем существенно сдерживает данные исследования. Известно, что для многих вирусов, например коронавирусы, существует ряд проблем, связанных с отсутствием культур клеток, эффективно обеспечивающих их размножение in vitro. Перевиваемые культуры клеток, которые используются в этих целях, как правило, иммортализированы, и в результате длительного культивирования теряют свою не только тканевую, но и видовую специфичность. Диплоидные культуры клеток, полученные из тканей и органов млекопитающих, сохраняют свою видовую и тканевую специфичность, однако имеют ограниченный период пролиферации in vitro вследствие старения. Известно, что такие клетки не могут in vitro преодолеть более 50 цитогенераций. В связи с этим использование для этих целей стволовых клеток (СК), выделенных из тканей и органов взрослой особи, является актуальным. Особенно перспективными в данном направлении являются ММСК. Эти клетки, как известно, являются структурными и функциональными стержнями различных видов тканей. Известно, что такие клетки способны к самообновлению. ММСК доступны, просты в культивировании, при определенных условиях способны дифференцироваться в различные типы и виды тканей и органов и самое главное не вызывают реакцию иммунного отторжения. Стоит особо отметить еще одно достоинство ММСК - возможность их культивирования в трехмерной структуре. Они могут заселять матрицу-носитель, дифференцироваться в заданном направлении и формировать трехмерные структуры, которые позволяют моделировать ту или иную ткань in vitro. Поэтому ММСК являются перспективным материалом для понимания сложных инфекционных механизмов, происходящих на клеточном и тканевом уровнях in vitro. Также это делает их уникальным материалом для создания новых клеточных систем в сельскохозяйственной биотехнологии и ветеринарии.

Промышленное производство мяса в больших масштабах, не останавливаясь на коммерческих аспектах, оказывает негативное воздействие на окружающую среду; происходит загрязнение почвы испражнениями, одновременно резко растет потребление кормов, энергии и воды и т.д. Мировое потребление мяса продолжает расти, что еще более усугубляет эти проблемы. Так, в развитых странах происходит удвоение уровня потребления мяса каждые 20 лет. Трудно представить последствия такого роста особенно с серьезным ассиметричным увеличением численности населения Земли. Не стоит забывать и о нехватке животного белка. К сожалению, на сегодняшний день этот вопрос является актуальным не только для развивающихся стран, но и для многих развитых. Нет уверенности, что современное сельское хозяйство сможет справиться с возникшими проблемами. Чтобы суметь справиться с поставленными задачами, необходимы качественно новые подходы с применением инновационных технологий. Одним из таких подходов является создание пищевых продуктов животного происхождения на основе культивируемой in vitro мышечной ткани при помощи технологий клеточной инженерии, результатов исследований в области культур стволовых клеток, в частности ММСК, а также стремительным развитием нанотехнологий. Имеющиеся и полученные знания и опыт позволят культивировать клетки сельскохозяйственных животных in vitro с возможностью влияния на конечный физико-химический состав получаемой биомассы из данных клеток. Стоит также отметить, что несомненными преимуществами клеток животных, выращенных in vitro, являются отсутствие в их составе патогенных инфекционных агентов, что особенно актуально в современных условиях. Поэтому ММСК являются перспективным биологическим материалом для создания новых клеточных продуктов in vitro для пищевой биотехнологии.

Согласно общепринятому мнению, КМ является самым подходящим источником для выделения ММСК. В последнее время накапливаются данные о выделении ММСК из КМ. Следует заметить, что наиболее интенсивно эти исследования проводятся у человека (Тепляшин А.С, Коржикова С.В., Шарифуллина С.З., Чупикова Н.И., Ростовская М.С., Савченкова И.П. Характеристика мезенхимальных стволовых клеток человека, выделенных из костного мозга и жировой ткани // Цитология. 2005. Т.47 (2): с.130-135; Савченкова И.П., Ростовская М.С., Чупикова Н.И., Шарифуллина С.З., Тепляшин А.С. Дифференцировка мультипотентных мезенхимных стромальных клеток, выделенных из костного мозга и подкожно-жировой клетчатки человека, в клетки костной ткани // Цитология. 2008. Т.50 (10): с.855-860; Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C., Jaiswal R.K., Douglas R., Mosca J.D., Moorman M.A., Simonetti D.W., Craig S., Marshak D.R. Multilineage Potential of adult human mesenchymal stem cells // Science. 1999. V.284 (5411): P.143-147) и грызунов (Lennon D.P. and Caplan A.I. Isolation of rat marrow-derived mesenchymal stem cells // Experimental Hematology. 2006. V.34 (11): P.1606-1607; Da Silva Meirelles L. and Nardi N.B. Murine marrow-derived mesenchymal stem cells: isolation, in vitro expansion, and characterization // British Journal of Hematology. 2003. V.123 (4): P.702-711).

Анализ данных, представленных в научной литературе, показал, что работы по выделению ММСК из тканей и органов сельскохозяйственных животных только начинаются. На сегодняшний день в России работы по получению ММСК крс, выделенных из КМ, не проводятся, и, к сожалению, следует констатировать факт отсутствия культур клеток ММСК крс в Российских Коллекциях Культур Клеток.

Имеются сообщения о выделении ММСК из КМ крс зарубежных авторов (Bosnakovski D., Mizuno М., Kim G., Ishiguro Т., Okumura M., Iwanaga Т., Kadosawa Т., and Fujinaga Т. Chondrogenic differentiation of bovine bone marrow mesenchymal stem cells in pellet cultural system // Experimental Hematology. 2004. V.32: P.502-509; Bosnakovski D., Mizuno M., Kim G., Takagi S., Okumura M., Fujinaga T. Isolation and multilineage differentiation of bovine bone marrow mesenchymal stem cells // Cell Tissue Res. 2005. V.319 (2): P.243-253; Colleoni S., Donofrio G., Lagutina I., Duchi R., Galli C, and Lazzari G. Establishment, differentiation, electroporation, viral transduction, and nuclear transfer of bovine and porcine mesenchymal stem cells // Cloning and stem cells. 2005. V.7 (3): P.154-166). Проводятся исследования по выделению ММСК из КМ свиней (Bosch P., Pratt S.L. and Stice S.L. Isolation, characterization, gene modification, and nuclear reprogramming of porcine mesenchymal stem cells // Biology of Reproduction. 2006. V.74 (1): P.46-57; Ringe J., Kaps C., Schmitt В., Buscher K., Bartel J., Smolian H., Schultz O., Burmester G.R., Haupl Т., Sittinger M. Porcine mesenchymal stem cells: induction of distinct mesenchymal cell lineages // Cell and Tissue Research. 2002. V.307 (3): P.321-327), из KM лошадей (Smith R.K., Korda M., Blunn G.W., Goodship A.E. Isolation and implantation of autologous equine mesenchymal stem cells from bone marrow into the superficial digital flexor tendon as a potential novel treatment // Equine veterinary journal. 2003. V.35 (1): P.99-102), из KM овец (Rentsch C., Hess R., Rentsch В., Hofmann A., Manthey S., Scharnweber D., Biewener A. and Zwipp H. Ovine bone marrow mesenchymal stem cells: isolation and characterization of the cells and their osteogenic differentiation potential on embroidered and surface-modified polycaprolactone-co-lactide scaffolds // In vitro cellular and developmental biology - animal. 2010. V.46 (7): P.624-634).

Серией успешных экспериментов рядом авторов было показано, что ММСК, выделенные из КМ, способны при определенных условиях подвергаться дифференцировке в клетки тканей, имеющих мезодермальное происхождение (Савченкова И.П., Ростовская М.С., Чупикова Н.И., Шарифуллина С.З., Тепляшин А.С. Дифференцировка мультипотентных мезенхимных стромальных клеток, выделенных из костного мозга и подкожно-жировой клетчатки человека, в клетки костной ткани // Цитология. 2008. Т.50 (10): С.855-860; Bosnakovski D., Mizuno М., Kim G., Takagi S., Okumura M., Fujinaga T. Isolation and multilineage differentiation of bovine bone marrow mesenchymal stem cells // Cell Tissue Res. 2005. V.319 (2): P.243-253).

Направленная дифференцировка ММСК является актуальной проблемой ветеринарии, сельскохозяйственной биотехнологии, пищевой биотехнологии. Получение новых культур стволовых клеток позволит определить чувствительность ММСК к вирусной инфекции и изучить развитие инфекции в ММСК, индуцированных к дифференцировке в клетки заданной ткани. Выделенная нами культура клеток может представлять удобную модельную систему для изучения инфекций in vitro в дифференцированных и стволовых клетках. Получение культур стволовых клеток с уникальными характеристиками будет способствовать созданию технологических предпосылок для получения искусственных биологических тканей с заданными свойствами in vitro. Полученная культура ММСК КМ крс представляет собой перспективный материал для получения трехмерных тканевых трансплантатов и их тестирования в организме животного.

Таким образом, уникальные свойства ММСК делают их самым перспективным материалом для разработок новых технологий в ветеринарии и биотехнологии, в частности пищевой.

В связи с этим в задачу наших исследований входило выделить из КМ крс клетки с фенотипом подобным ММСК и провести их сравнительную характеристику. КМ получали от убойных животных (коровы, 3 года) на мясокомбинате. Для выделения использовали методические наставления, разработанные нами ранее (Савченкова И.П., Эрнст Л.К., Гулюкин М.И., Викторова Е.В. Методические наставления по выделению мультипотентных мезенхимных стволовых клеток из тканей взрослых особей млекопитающих, изучению их свойств и признаков // М.: Издательство «Спутник+», 2010).

В качестве прототипа мы взяли ММСК крс, выделенные из КМ. Данная работа была выполнена в Японии. ММСК выделяли из КМ телят в возрасте от 2-х дней до 6-ти месяцев (Bosnakovski D., Mizuno М., Kim G., Takagi S., Okumura M., Fujinaga T. Isolation and multilineage differentiation of bovine bone marrow mesenchymal stem cells // Cell Tissue Res. 2005. V.319 (2): P.243-253).

Описание прототипа

Источник биологического материала. КМ был взят у восьми телят (2-6 месяцев).

Методика выделения культуры клеток. КМ набирали в шприцы, содержащие гепарин (1,000 Ед.), и помещали на лед. Для выделения ММСК крс авторы использовали методики, описанные ранее для выделения ММСК из КМ лошади (Worster et al., 2000а, 2000b) и человека (Mastrogiacomo et al., 2001; Holzer et al. 2002). Кратко, образец KM был дважды промыт в физиологическом растворе, забуференном фосфатами, (ФСБ) и дважды средой DMEM (Gibco BRL, USA). Далее определяли жизнеспособность и количество ядросодержащих клеток (5×10⁴/см²), сеяли их в Т-75 культуральные флаконы с питательной средой. Через 4 дня меняли среду, неприкрепившиеся клетки были удалены. Далее среду меняли каждые 2-3 дня.

Состав питательной среды и условия культивирования: среда Игла в модификации Дюльбекко, содержащая 1 г/л глюкозы (DMEM-LG), 100 Ед./мл пенициллина G, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,25 мкг/мл амфотерицина В, 2,4 мг/мл HEPES, 3,7 мг/мл NaHCO₃ и 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Клетки инкубировали при температуре 37°C в CO₂ термостате при 5% CO₂.

На 12-13 сут клетки снимали при помощи 0,25% трипсина в 0,1% EDTA и далее либо использовали для экспериментов, либо замораживали в среде с криопротектором (10% диметилсульфоксида).

Морфологические признаки. За ММСК были приняты клетки, адгезивные к пластику. Все выделенные клетки имели фибробластоподобную форму. Клетки культивировали 6 пассажей.

Иммунофенотипирование. Авторами был проведен анализ экспрессии коллагена I (collagen I) с помощью поликлональных антител. В качестве первичных антител были использованы Rabbit anti-bovine collagen I. Было показано, что ММСК крс, выделенные из КМ, отличаются высокой экспрессией данного гена.

Потенции к дифференцировке. Авторами была показана способность полученных ММСК к цитодифференцировке в трех направлениях: остеогенном, хондрогенном и адипогенном.

Остеогенная дифференцировка. Авторами было исследовано влияние витамина D в составе индукционной среды на эффективность остеогенной дифференцировки ММСК крс, выделенных из КМ. В качестве основных индукторов использовали дексаметазон, β-глицерофосфат натрия и аскорбиновую кислоту. Было установлено, что добавление в индукционную среду витамина D не влияло на эффективность дифференцировки ММСК в клетки костной ткани. Анализ эффективности индукции проводили на 24-й день с помощью РТ ПЦР-анализа по наличию мРНК продуктов экспрессии генов-маркеров остеогенеза (collagen type II и остеокальцин). При этом, эффективность дифференцировки ММСК крс, выделенных из КМ, в клетки костной ткани была высокой.

Хондрогенная дифференцировка. Авторы изучали потенции выделенных ММСК крс формировать клетки хрящевой ткани при индукции in vitro. В качестве индуктора использовали TGF-β1. Анализ эффективности индукции проводили также с помощью РТ ПЦР-анализа по наличию мРНК, продуктов экспрессии генов-маркеров хондрогенеза на 9-й день индукции. Было показано, что ММСК крс, выделенные из КМ, способны образовывать клетки хрящевой ткани при индукции in vitro.

Адипогенная дифференцировка. Авторами была показана способность выделенных ММСК крс при индукции формировать в культуре клетки жировой ткани. В качестве индукторов использовали дексаметазон, индометацин, инсулин, 3-изобутил-1-метилксантин. Анализ эффективности индукции проводили с помощью РТ ПЦР-анализа по детекции мРНК продуктов экспрессии генов-маркеров адипогенеза (PPAR-γ2 и aP2) на 18-е сутки индукции. При этом эффективность дифференцировки ММСК крс, выделенных из КМ, в клетки жировой ткани была высокой.

Предложенная нами линия ММСК имеет ряд отличий от прототипа. В отличие от прототипа клетки с фенотипом ММСК, выделенные нами из КМ взрослых особей крупного рогатого скота, обладали следующими свойствами и признаками.

Источник биологического материала. В отличие от прототипа, авторы которого выделяли клетки из КМ молодняка, нами КМ был взят у трех взрослых особей крупного рогатого скота (коровы 3 года).

Методика выделения культуры клеток отличалась от методики, описанной в статье прототипа. КМ в количестве 30 мл получали от убойных животных на мясокомбинате. Забор материала осуществляли не позднее 30 мин после убоя. КМ извлекали из бедренной кости в стерильных условиях. Полученный КМ разбавляли в 4 раза физиологическим раствором, забуференным фосфатами без ионов Ca²⁺ и Mg²⁺ (ФБС-2), с Li-гепарином (Sarstedt, Германия) и выделяли фракцию моноядерных клеток центрифугированием в течение 30 мин при 1000 g в градиенте фиколла (Ficoll-Paque, Pharmacia, Швеция). Для выделения использовали методические наставления, разработанные нами ранее (Савченкова И.П., Эрнст Л.К., Гулюкин М.И., Викторова Е.В. Методические наставления по выделению мультипотентных мезенхимных стволовых клеток из тканей взрослых особей млекопитающих, изучению их свойств и признаков. М.: Издательство «Спутник+», 2010). Число выделенных клеток оценивали подсчетом в камере Горяева. Высевали в концентрации 1,1×10⁶ в культуральный флакон 25 см². Через 24 ч производили смену среды, оставшиеся прикрепленные клетки оставляли на доращивание.

Состав питательной среды и условия культивирования. Состав питательной среды разнился с прототипом. Основной средой для культивирования была среда Игла в модификации Дюльбекко, содержащая 1 г/л глюкозы (DMEM-LG), дополненная 10% сыворотки плодов коров (СПК) (HyClone, Perbio, Бельгия) и антибиотиками. Конечная концентрация стрептомицина была 100 мкг/мл, а пенициллина - 100 Ед./мл. Клетки также инкубировали при температуре 37°C в CO₂ термостате при 5% CO₂. На 10-й день клетки снимали при помощи ФСБ-2 и 0,25% трипсина и далее либо использовали для экспериментов, либо замораживали в среде с криопротектором - 10% диметилсульфоксида (ДМСО).

Культуральные свойства. Время цитогенерации для нашей культуры клеток составило 24 ч, для культуры-прототипа не определяли. Наша культура характеризовалась высоким митотическим индексом - 45‰. Клетки пролиферировали и на 10-е сут образовывали монослой. Клетки прототипа пролиферировали и на 12-13-е сут образовывали монослой. Известно, что ММСК, выделенные из КМ крс, обладают высокой адгезией к культуральному пластику и высокой эффективностью образовывать колонии. Аналогично прототипу на 2-е сут культивирования наблюдали единичные прикрепленные к пластику клетки. При посеве в низкой концентрации клетки, выделенные из КМ, были способны образовывать колонии фибробластоподобных клеток. Эффективность клонообразования для ММСК, выделенных из КМ, составила 93%. Стоит особо отметить, что полученная нами культура ММСК была способна в культуре поддерживаться длительное время (90 цитогенераций), у прототипа этот показатель не определяли.

Морфологические признаки. Клеточная популяция, полученная нами, была представлена тремя типами клеток. Первый тип клеток был представлен маленькими веретенообразными клетками диаметром 10-15 мкм с гомогенной цитоплазмой и низким ядерно-цитоплазматическим отношением. Второй тип включал в себя клетки большего размера (15-20 мкм), но более округлой формы, с гомогенной цитоплазмой и смещенным к одному краю клетки ядром. Третий тип характеризовался фибробластоподобной морфологией: плоские, распластанные клетки крупных размеров (около 60 мкм) с многочисленными выростами цитоплазмы. Полученная культура не имела примеси гематопоэтических и эндотелиальных клеток. Клеточная популяция, полученная Bosnakovski D. et al., была вся представлена фибробластоподобными крупными клетками (40-60 мкм).

Иммунофенотипирование. Клетки на 3 пассаже анализировали на экспрессию поверхностных АГ (реакция непрямой иммунофлуоресценции). В результате было установлено, что клетки, с фенотипом ММСК, выделенные из КМ крс, были положительны по экспрессии CD44 (99%), CD90 (97,8%), CD29 (99,75%). Клетки были отрицательны по экспрессии генов, характерных для гематопоэтических CD34 (3,2%), CD45 (0,2%) и эндотелиальных клеток - CD31 (0,3%). Bosnakovski D. et al. оценивали фенотип полученной популяции клеток только по экспрессии одного гена Collagen I type (таблица 1).

Потенции к дифференцировке. Также как и прототип, полученная нами популяция обладала высокой эффективностью к направленной дифференцировке в клетки костной и жировой тканей. В отличие от прототипа мы также направили наши клетки по пути дифференцировки в клетки мышечной ткани (таблица 2).

Так, при культивировании в среде, индуцирующей дифференцировку в клетки костной ткани, как наших клеток, так и прототипа, на 12-14 сут были обнаружены клетки, положительно окрашенные на щелочную фосфатазу. В качестве основных индукторов мы использовали дексаметазон и аскорбиновую кислоту. При более продолжительном культивировании в этой же среде ММСК КМ формировали минеральные комплексы, которые подтверждались окраской экспериментальных образцов по von Kossa.

При индукции к дифференцировке в клетки жировой ткани (индуктор-дексаметазон и инсулин), у наших клеток на 21 сут, а у прототипа на 18 сут, наблюдали формирование кластеров адипоцитов с одинаковой эффективностью. Индукционная среда, используемая у прототипа, отличалась от нашей индукционной среды. Морфологическая оценка подтверждалась при окраске экспериментальных образцов специальными красителями (Oil-red-O).

Для индукции ММСК КМ крс в клетки мышечной ткани in vitro использовали среды, дополненные 5-азацитидином, 5-аза-2'-деоксицитидином и ретиноевой кислотой. На 30 сут наблюдали образование в экспериментальных культурах клеток мышечной ткани, в которых был обнаружен продукт мРНК экспрессии генов маркеров миогенеза: MyoDl и миозин HC.

Чувствительность к вирусам. В проведенных нами экспериментах было установлено, что предложенная нами культура ММСК КМ крс чувствительна к вирусам: вирусной диареи (ВД) крс и герпесу 4 типа (ВПГ-4) крс.

Сектором «Стволовая клетка» ГНУ ВИЭВ им. Я.Р.Коваленко в лице зав. сектором И.П. Савченковой была депонирована в Специализированную Коллекцию постоянных соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при ВИЭВ им. Я.Р.Коваленко (СХЖ РАСХН) под №79 следующая культура клеток, сохраняемая в жидком азоте (-196°C): мультипотентные мезенхимные стволовые клетки крупного рогатого скота, выделенные из костного мозга - ММСК крс КМ (четырнадцать ампул). Одновременно передан паспорт на указанную культуру клеток и протокол №2 от 06.06.2011 г.

Технико-экономическая эффективность. Таким образом, было установлено, что в костном мозге взрослых особей крупного рогатого скота содержится популяция клеток с фенотипом, подобным ММСК, которые можно выделить и культивировать in vitro длительное время. Предложенная культура ММСК, выделенная из КМ крс, найдет применение в лабораториях, занимающихся тканевой инженерией и новыми клеточными технологиями с целью регенерации и репарации тканей и органов сельскохозяйственных животных. ММСК, выделенные из КМ, являются перспективным материалом для понимания сложных инфекционных механизмов, происходящих на клеточном и тканевом уровнях in vitro. На основе этих клеток можно будет создавать клеточные системы для наращивания патогенов in vitro. Предложенная культура ММСК крс способна формировать в культуре клетки мышечной ткани, что даст возможность получать из них в перспективе биомассу по составу, близкую к мышечной ткани животных, с целью создания альтернативных источников продуктов питания. Кроме того, наличие в Коллекции культур стволовых клеток сельскохозяйственных животных даст возможность сохранить генетические ресурсы в экстремальных условиях.