Результат интеллектуальной деятельности: ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ФЕРМЕНТЫ: ЛИЗОЦИМ, ПЕРОКСИДАЗУ, ПОВИАРГОЛ И ЛИПОСОМЫ, ДЛЯ МЕСТНОГО ПРИМЕНЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к фармацевтической композиции, содержащей ферменты: лизоцим и пероксидазу, повиаргол и липосомы, которая может быть использована в медицине для лечения и профилактики вирусных инфекций, вызываемых РНК и ДНК-содержащими вирусами, такими как:

грипп, герпес, опоясывающий лишай, папиллома человека, аденоновирусы и другие, а также бактериальных инфекций, вызываемых грамположительными и грамотрицательными микроорганизмами.

Известны лекарственные средства для местного применения, используемые для лечения и профилактики герпесвирусных инфекций, содержащие противовирусные компоненты, не являющиеся ферментами, например крем Зовиракс™ (ацикловир); спрей Эпиген интим™ (глицирризиновая кислота); мази: алпизарин, хелепин, флакозид, содержащие экстракты растений.

Известны косметические средства для местного применения, используемые для профилактики герпеса, содержащие противовирусные компоненты, не являющиеся ферментами, например, экстракты лекарственных растений и германийорганические соединения (Помада профилактическая противогерпетическая "Антигерпес" (Р16 9158 915854 71.100.70) 292472. ТУ 9124-001-00358210-96), глицирризиновая кислота мазь «Герпинат» мазь; бан. 20 мл; №77.01.12.915.П.02970.02.00 от НИИ атеросклероза РАЕН (Россия), ИНАТ-ФАРМА (Россия) (http://www.biomedservice.ru/publish/pub16.htm).

Известна косметическая фермент-содержащая композиция, где фермент выбран из группы протеиназ, включающей в себя трипсин, химотрипсин, бромелаин, папаин и фицин, а также из лизоцима, эластазы, α-липазы и α-амилазы, которая применяется для лечения акне, ухода за кожей и очистки кожи (DE 4305460). Описанная композиция не содержит ферментов нуклеаз, обладающих прямой противовирусной активностью, и, следовательно, не может быть использована для профилактики вирусных инфекций.

Известна зубная паста с фермент-содержащей композицией, где фермент выбран из группы протеиназ, включающей в себя папаин (Отбеливающая зубная паста «Rembrandt» (США), а также паста, содержащая лизоцим, глюкозооксидазу, лактопероксидазу и лактоферрин (зубная паста «Biotene» (Финляндия), которая применяется для лечения ксеростомии.

Известен препарат «Лизоцим», выпускаемый в виде герметично укупоренных флаконах по 0,05; 0,1 и 0,15 г, оказывающий бактериолитическое действие и обладающий способностью стимулировать неспецифическую реактивность организма.

Известна композиция пленкообразующая биодеградирующая антисептическая «АРГАКОЛ», содержащая повиаргол и используемая для лечения ран и ожогов.

Известен фармацевтический препарат «Дезоксирибонуклеаза», выпускаемый в виде в герметично укупоренных флаконах и ампулах по 0,005; 0,01; 0,025 и 0,05 г. Этот препарат назначают при герпетических кератитах, аденовирусных конъюктивитах, для уменьшения вязкости и улучшения эвакуации мокроты и гноя при бронхоэктатической болезни и используют местно в виде 0,2% раствора на изотоническом растворе натрия хлорида.

Фармацевтические композиции для лечения и профилактики, содержащие ферменты: лизоцим, пероксидазу, повиаргол и липосомы, для местного применения при лечении и профилактике вирусных и бактериальных инфекций не описаны.

Таким образом, задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить фармацевтическую композицию для местного применения, содержащую ферменты: лизоцим, пероксидазу, повиаргол и липосомы, которая может быть использована для лечения и профилактики вирусных инфекций, вызываемых РНК- и ДНК-содержащими вирусами, такими как герпес, опоясывающий лишай, папиллома человека, аденовирусы и другие, а также бактериальных инфекций, вызываемых грамположительными и грамотрицательными микроорганизмами.

Согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция для местного применения, содержащая в качестве активного ингредиента 0,01-5,00 мас.% лизоцима, 0,01-5,00 мас.% пероксидазы, 0,01-5,00 мас.% повиаргола, в качестве носителя - 0,01-20,0 мас.% липосом и фармацевтически приемлемые полимерные носители или эксципиенты.

В качестве предпочтительного воплощения заявленного изобретения предложена фармацевтическая композиция, указанная выше, дополнительно содержащая один или более чем один противовоспалительный ингредиент.

Наиболее предпочтительной является фармацевтическая композиция для лечения и профилактики вирусных и бактериальных инфекций, содержащая лизоцим, пероксидазу, повиаргол - в качестве активных ингредиентов, в качестве противовоспалительных ингредиентов: эсцин и глицирризиновую кислоту или ее соли, в качестве носителей - липосомы на основе высокоактивных гидрированных лецитинов в комбинации с холестерином и фармацевтически приемлемые носители и эксципиенты, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Активным ингредиентом заявленной фармацевтической композиции являются ферменты: лизоцим, пероксидаза, повиаргол, глицирризиновая кислота и эсцин. Лизоцим катализирует реакцию гидролиза 1,4- -связей между N-ацетилмурамовой кислотой и 2-ацетамидо-2-дезокси-D-глюкозой (N-ацетил глюкоза мин), содержащихся в мукополисахаридах, мукопептидах и хитине клеточных стенок бактерий, грибов и простейших, обладает ярко выраженным антимикробным (разрушает клеточные стенки большинства грамположительных и некоторых грамотрицательных бактерий), микостатическим (задерживает развитие микроскопических грибов), а также ранозаживляющим действием. Пероксидаза обладает способностью окислять гликопротеины суперкапсидов вирусов и таким образом препятствовать адсорбции вирусов на поверхность мембран инфицируемых клеток, а также способствует утилизации инфицированных клеток макрофагами. Повиаргол, благодаря иммобилизованным ионам серебра предотвращает развитие вирусной и вторичной бактериальной инфекции. Для приготовления композиции используют ферментные субстанции «Лизоцим», «Пероксидаза» и «Повиаргол».

Лизоцим и пероксидазу в форме указанных препаратов не применяют для лечения и профилактики вирусных и бактериальных инфекций вследствие их затрудненного всасывания через неповрежденную кожу и низкого уровня потребительских свойств, а также отсутствия стабильности при содержании влаги свыше 10% и в растворе, с потерей активности ферментов в течение суток.

Неожиданно обнаружено, что лизоцим, пероксидаза и липосомы могут быть включены в состав стабильной фармацевтической композиции для местного применения с сохранением активности указанных ферментов в течение длительного времени, несмотря на то, что такая композиция содержит значительное количество воды (до 90%).

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению обычно изготавливают общепринятыми способами, используя твердые или жидкие косметически приемлемые носители или эксципиенты, выбранные из эмульгаторов, диспергирующих агентов, консервантов, ароматизаторов, регуляторов рН, полимерных носителей и других эксципиентов, которые целесообразны для приготовления композиций для местного применения. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть приготовлена в форме геля, крема, крем-геля, сливок, пенки, молочка, пасты, мази и тому подобного.

Дополнительными преимуществами указанной композиции являются способность быстро проникать через кожу и, соответственно, быстрая всасываемость, удобство применения, а также легкость дозирования.

Быстрое проникновение через кожу обусловлено связыванием ферментов с липосомами на основе высокоактивных гидрированных лецитинов в комбинации с холестерином, которые используют в косметологии в составе лекарственных препаратов, например Эссавен™ гель, препаратов против старения кожи, для ухода за кожей, препаратов до и после загара и препаратов для ампульной косметики.

Кроме того, активные ингредиенты могут применяться в комбинации с одним или более чем одним противовоспалительным ингредиентом, такими как эсцин и глицирризиновая кислота, обеспечивая дополнительное преимущество заявленной композиции.

Заявленная фармацевтическая композиция обладает стабильностью в отношении активности ферментов, входящих в ее состав, при длительном хранении, которая достигается путем иммобилизации ферментов на полимерных носителях, содержащихся в указанной композиции. В качестве указанных полимерных носителей могут быть использованы любые полимеры, способные связываться с ферментами с образованием комплексов фермент-носитель. Примерами таких полимерных носителей являются полиакрилаты, поливинилпирролидон, полиэтиленгликолевый эфир хитозана и натрий карбоксиметилцеллюлоза.

Активность заявленной композиции обусловлена активностью входящих в ее состав ферментов. Обнаружено, что фармацевтическая композиция для местного применения, содержащая лизоцим 0,01-5,00 мас.% и пероксидазу 0,01-5,00 мас.%, обладает стабильностью в отношении активности ферментов при ее длительном хранении, в то время как активность этих ферментов, приготовленных в виде раствора, быстро падает. Следовательно, заявленная композиция может быть использована для эффективной профилактики бактериальных и вирусных инфекций, таких как вирусы герпеса, кокковые инфекции и др.

Настоящее изобретение иллюстрируется следующими примерами.

ПРИМЕР 1

Фармацевтическая композиция в виде геля для лечения и профилактики вирусных и бактериальных инфекций на основе лизоцима, пероксидазы, повиаргола и липосом имеет следующий состав:

Указанную композицию готовят по следующей методике. В деминерализованной воде растворяют лизоцим, пероксидазу, повиаргол, глициррризиновую кислоту или ее соли, эсцин, карбомер, регулятор рН. В полученный гель последовательно вносят эмульгатор и консервант. Полученный гель гомогенизируют и вакуумируют.

ПРИМЕР 2

Фармацевтическая композиция в виде геля для лечения и профилактики вирусных и бактериальных инфекций на основе лизоцима, пероксидазы, повиаргола и липосом имеет следующий состав:

Указанную композицию готовят как в ПРИМЕРЕ 1.

ПРИМЕР 3

Оценка стабильности ферментов в композициях для местного применения.

Поскольку главным недостатком ферментов является их нестабильность при длительном хранении готовых лекарственных форм на их основе в течение срока годности, была проведена сравнительная оценка сохранения активности ферментов при хранении в виде раствора и в виде композиции для местного применения (на примере геля).

Активности лизоцима и пероксидазы определяли по следующим методикам.

1) Определение активности лизоцима проводили по методу Бухарина О.В., основанного основанной на измерении величины оптической плотности при добавлении фермента к бактериальной суспензии. В опытную пробирку наливают 0,4 мл фосфатного буфера (рН 6,2) и 0,1 мл исследуемого раствора и 2 мл стандартизированной взвеси микрококка. Смесь инкубируют 30 минут при 37°, после чего измеряют ее оптическую плотность на ФЭК-М при λ=540 нм.

За единицу активности лизоцима принимают наименьшее количество фермента, которое при воздействии его на субстрат в условиях опыта лизирует такое количество культуры суспензии Mycrococcus lysodeikticus, которое приводит к возрастанию оптической плотности при длине волны 540 нм на одну единицу.

2) Определение активности пероксидазы проводили по методу АБТС. Метод основан на определении окисленного АБТС, образуемого в результате окисления пероксидом водорода в присутствии пероксидазы. За единицу активности пероксидазы принимают наименьшее количество фермента, вызывающее при воздействии его на субстрат АБТС в течении 10 минут при 37°С освобождение такого количества окисленного АБТС, которое приводит к возрастанию оптической плотности при длине волны 414 нм на одну единицу.

Результаты приведены в следующей таблице.

Как видно из представленной таблицы, введение ферментов в композиции для местного применения позволяет получить стабильные фармацевтические композиции для местного применения при профилактике вирусных инфекций. Несмотря на то, что при введении ферментов в состав таких композиций происходит незначительная потеря ферментативной активности, при дальнейшем хранении в течение 1 года ферменты не изменяют своей активности благодаря фиксации лабильной структуры фермента липосомами и полимером-носителем.

ПРИМЕР 4

Оценка противовирусной и антибактериальной активности композиции.

Для оценки противовирусной и антибактериальной активности было проведено исследование эффективности композиции из ПРИМЕРА 1 в сравнении с антивирусным препаратом «Ацикловир» крем. В исследовании принимали участие 39 пациентов в возрасте от 18 до 45 лет, имеющих клинические проявления герпесвирусной инфекции. По полу группа разделилась следующим образом: мужчины - 11 человек, женщины - 28 человек. Давность заболевания варьировала от 2 лет до 12 лет. При этом у подавляющего большинства пациентов отмечалось легкое и среднетяжелое течение герпетической инфекции - 2-3 раза в год - 14 человек, 4-6 раз в год - у 22 и 6-8 раз в год у 3 пациентов. Среди женщин в наблюдаемой группе орофациальные проявления отмечались у 18, генитальная локализация у 10 человек. В группе мужчин у 7 пациентов зарегистрирован генитальный герпес, и у 4 наблюдаемых отмечалось поражение в зоне лица. При этом у 7 человек (мужчин - 2, женщин - 5) отмечалось присоединение к проявлениям герпеса условно-патогенной бактериальной флоры с развитием осложнений в виде стрепто-стафилодермии.

У большинства пациентов регистрировалась небольшая площадь поражения, составляющая от 0,5 до 1,0 см у 29 человек, очаги площадью 1,5 см у 9 наблюдаемых.

В группе сравнения находились 11 пациентов с проявлениями герпетической инфекции, получавшие наружную терапию кремом «Ацикловир». По полу группа сравнения разделилась следующим образом - мужчин было - 7, женщин - 4 человека. Проявления герпеса у всех мужчин находились в генитальной локализации, у 1 женщины герпес также имел генитальную локализацию, и у 3 женщин наблюдались орофациальные герпетические высыпания. По тяжести течения 8 пациентов контрольной группы имели легкое течение, 3 - средней степени тяжести.

До начала лечения и через 4 недели после окончания терапии всем пациентам были выполнены следующие исследования:

- Опрос и осмотр

- Исследование материала из очага поражения с помощью полимеразной цепной реакции для выявления вируса простого герпеса человека

- Исследование соскобов из урогенитального тракта для выявления хламидий, мико- и уреаплазм (при поражении урогенитального тракта)

- Тестирование сыворотки крови на сифилис; исследование на ВИЧ после проведения дотестового собеседования

- Клинический анализ крови

Всем пациентам после получения информированного согласия для наружного лечения была назначена композиция из ПРИМЕРА 1, 4-6 аппликаций в сутки, трем пациентам с тяжелым течением одновременно проводилась системная терапия препаратами ациклических нуклеозидов течение 5 дней. В группе сравнения пациенты получали наружную терапию кремом «Ацикловир» 6 аппликаций в сутки.

Лечение закончил 31 пациент. 8 пациентов после достижения ремиссии не явились для последующего наблюдения. Большинство из наблюдаемых пациентов (28 человек) отмечали хорошую переносимость препарата. 3 человека в процессе применения препарата отмечали достаточно выраженное чувство жжения после нанесения крема на очаги. В процессе наблюдения ни у одного из пациентов не отмечалось аллергических реакций на композицию из ПРИМЕРА 1.

Положительный эффект от применения композиции из ПРИМЕРА 1 наблюдался у всех пациентов и выражался в ускорении эпителизации очагов и влиянии на условно-патогенную бактериальную флору с разрешением инфекционных осложнений.

При осмотре пациентов основной группы на фоне проводимого лечения положительный клинический эффект отмечался у большинства наблюдаемых в виде прекращения новых высыпаний в среднем на 3±1,2 день, начало эпителизации на 6±2,1 день, полная эпителизация наблюдалась к 11±2,3 дню. Сроки эпителизации зависели от размеров первоначального очага и степени тяжести течения герпетической инфекции. Положительный лечебный эффект получен также у пациентов с бактериальными осложнениями герпетической инфекции, что, вероятно, обусловлено входящими в состав действующими компонентами. Обращает на себя внимание тот факт, что достаточно хорошие результаты получены у пациентов тяжелым течением герпетической инфекции, где проводилась комбинированная терапия. При этом сроки эпителизации очагов у этих пациентов были сравнимы с группой пациентов, имеющих легкое течение герпеса.

В группе пациентов, где применялся крем «Ацикловир» получены сходные результаты по срокам прекращения появления новых высыпаний (3±1,4 дня), по времени начала эпителизации (6±2,3 дня), тогда как полная эпителизация очагов высыпаний наступала медленнее и составила 14±2,1 дней. Общеклиническое обследование, проведенное до начала лечения отклонений от нормы не выявило как у лиц основной группы, так и в группе сравнения.

Таким образом, исследование, проведенное на небольшой группе пациентов, позволяет сделать следующие выводы:

1. Установлено, что использование композиции из ПРИМЕРА 1 возможно при лечении поражений, вызванных вирусом герпеса 1, 2 типа.

2. Препарат хорошо переносится пациентами.

3. Побочные явления зарегистрированы у 3 пациентов, принимавших участие в настоящем исследовании, и выражались в ощущении жжения в зоне нанесения композиции из ПРИМЕРА 1, аллергические реакции на препарат при проведении исследования не встречались.

4. Возможно применение композиции из ПРИМЕРА 1 при бактериальных осложнениях герпетической инфекции, что обусловлено наличием в его составе компонентов, обладающих противомикробным действием.

5. Применение композиции из ПРИМЕРА 1 способствует более быстрой эпителизации очагов по сравнению с применением крема «Ацикловир».

6. Композиция из ПРИМЕРА 1 также может использоваться в комбинированной терапии пациентов с тяжелым течением рецидивирующей герпетической инфекции, способствуя при этом более быстрой эпителизации.