Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ Enterococcus hirae, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ КИСЛОМОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ

Изобретение относится к биотехнологии и молочной промышленности и представляет собой новый штамм мезофильного стрептококка, предназначенный для производства кисломолочных продуктов и бактериальных препаратов.

Известны штаммы Streptococcus citrovorus, Streptococcus paracitrovorus, Streptococcus diacetilactis, обладающие высокой устойчивостью к ингибиторам роста, способностью стабильно образовывать вязкий молочный сгусток, хорошей сочетаемостью с другими штаммами лактобактерий и выраженными физиолого-биохимическими свойствами.

Недостатком данных штаммов являются более низкая предельная кислотность и скорость сквашивания молока.

Известен штамм Enterococcus durans RSH (VKPM В-8717) патент №2273662. E. durans с 1982 года применяется в молочной промышленности в качестве компонента заквасок, а также как пробиотик в медицине (Rocha J.M., Malcata F.X., On the microbiological profile of traditional Portuguese sourdough. J. Food Prot. 62(12): 1416-29, 1999).

Также показано, что E. durans по ряду показателей (устойчивость к желчи и кислотному шоку, in vitro ассимиляция холестерина) превосходит известные пробиотические микроорганизмы (Dora I.A. Pereira and Glenn R., Gibson Cholesterol Assimilation by Lactic Acid Bacteria and Bifidobacteria Isolated from the Humman Gut // Applied and Environmental Microbiology, vol.68, №9, p.4689-4693, 2002).

Недостатком данного штамма является более низкая предельная кислотность и скорость сквашивания молока.

Задачей заявляемого изобретения является создание кисломолочного продукта с использованием лактобактерий на доступных питательных средах, обладающих высокой антагонистической активностью.

Задача решается путем использования питательных сред плотной и жидкой консистенции: стерильное обезжиренное молоко, гидролизованное молоко (рН 6,8-7,0).

Местный штамм Enterococcus hirae ВКПМ В-10090 выделен в естественных условиях из микрофлоры кефирного грибка.

Идентификацию штамма проводили по методике, приведенной в книге Банникова Л.А. "Селекция молочнокислых бактерий и их применение в молочной промышленности". - М., «Пищевая промышленность», 1975.

Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов и имеет номер ВКПМ В-10090.

Местный штамм Enterococcus hirae выделен в естественных условиях с поверхности растения люцерны (цветок).

Идентификацию штамма проводили по методике, приведенной в книге Банниковой Л.А. (1975). Штамм Enterococcus hirae депонирован в ВКПМ под номером В-10090.

Штамм Enterococcus hirae ВКПМ В-10090 имеет следующие характеристики:

1. Культурально-морфологические:

- факультативный анаэроб;

- грамположительные кокки;

- диаметр 1,0±0,02 мкм;

- неподвижные;

- расположенные парно или короткими цепочками;

- эндоспор не образуют.

На поверхности агаризованной среды (гидролизованное молоко) через 24 часа при температуре 37°С образуют:

- колонии круглой формы,

- размер 2,2 мм (средний);

- характер контура края - ровный;

- рельеф - выпуклый;

- поверхность - гладкая, блестящая;

- цвет - белый;

- структура - однородная;

- консистенция - пастообразная.

Изучение культуральных или морфологических свойств отобранного штамма молочнокислых микроорганизмов проводили на плотной питательной среде - агаризованном молоке.

2. Физиолого-биохимические:

- скорость сквашивания молока - 9 часов;

- предел кислотообразования - 201°Т;

- штамм сбраживает глюкозу, галактозу, лактозу, мальтозу, декстрин;

- растет в молоке при температуре 40-45°С;

- растет в гидролизованном молоке, содержащем NaCl (2%, 3%, 4%, 6,5%);

- растет в мясо-пептоном бульоне (при рН 9,2; 9,6);

- растет в гидролизованном молоке с содержанием желчи (20%, 30%, 40%);

- растет в молоке, содержащем метиленовый голубой (0,0005%, 0,005%, 0,01%, 0,1%);

- выдерживает нагревание в течение 30 мин при температуре 55°С, 60°С.

Продукт, синтезируемый штаммом, - молочная кислота.

3. Антибиотическая активность:

- диаметр зоны подавления роста по отношению к представителю патогенной микрофлоры Staphylococcus aureus составил 23 мм;

- диаметр зоны подавления роста по отношению к представителю условно-патогенной микрофлоры Escherichia coli составил 20 мм.

Определение антибиотической активности штамма Enterococcus hirae ВКПМ В-10090 проводили на плотной питательной среде (МПА) методом диффузии в агар.

Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма - лиофилизация; при температуре 4°С; среды MPG; Rogosa; молоко с мелом; молоко с дрожжевым автолизатом, глюкозой, лакмусом, печеночным экстрактом и CaCO₃; агаризованная молочная подсырная сыворотка.

Способ, условия и состав сред для размножения штамма - при температуре 30-37°С, среды: агаризованная молочная подсырная сыворотка; обезжиренное молоко, несоленая подсырная молочная сыворотка с содержанием не менее 4,0% лактозы.

Оптимальные условия и состав среды для ферментации - температура - 37°С; среды: коровье молоко; несоленая подсырная молочная сыворотка с содержанием не менее 4,0% лактозы, обезжиренное коровье молоко.

Предлагаемый новый штамм Enterococcus hirae ВКПМ В-10090, выделенный с поверхности растения люцерны (цветок), хорошо приспособлен к местным условиям, прост в культивировании и хранении, может использоваться в производстве кисломолочных продуктов, не является зоо- и фитопатогенным, не представляет опасности по другим причинам.

Благодаря своим выраженным биологическим и антибиотическим свойствам (способности образовывать вязкий молочный сгусток, диаметр зоны подавления роста Staphylococcus aureus - 23 мм, Escherichia coli - 20 мм) штамм представляет производственную ценность для молочной промышленности.

Пример 1. Использование штамма Enterococcus hirae ВКПМ В-10090 при производстве кефира

Молоко взвешивают, сортируют и фильтруют, подвергают первичной обработке. Оно должно быть свежим, натуральным и удовлетворять требованиям стандарта.

При производстве кефира молоко охлаждают до температуры заквашивания 20-25°С. Уже пастеризованное молоко заливают в резервуар-заквасочник и вносят предварительно приготовленную закваску - 5-6% массы молока. Закваску также обогащают штаммом Enterococcus hirae ВКПМ В-10090. После тщательного перемешивания содержимое резервуара оставляют в покое, обеспечивая с помощью водяной рубашки постоянную температуру. Молоко сквашивают до получения плотного сгустка кислотностью 90-100°Т. Продолжительность сквашивания составляет 10-12 часов при температуре не ниже 20°С. По достижении необходимой кислотности и вязкости сгустка циркуляцию воды в рубашке прекращают, в межстенное пространство подают ледяную воду температурой 1-2°С и включают мешалку для размешивания сгустка и более быстрого его охлаждения до температуры созревания. После достижения температуры сгустка 12-16°С подачу охлаждающей воды прекращают и его оставляют в покое на 4-6 ч для созревания и развития дрожжей. Затем содержимое резервуара доохлаждают до температуры 8-10°С для завершения созревания.

Пример 2. Использование штамма Enterococcus hirae ВКПМ В-10090 при производстве творога

Производство творога традиционным способом. Технологический процесс состоит из следующих операций: приемка и подготовка, сепарирование молока, нормализация, пастеризация, охлаждение, заквашивание и сквашивание нормализованного молока, разрезание сгустка, отделение сыворотки и розлив сгустка, самопрессование и прессование сгустка, охлаждение, фасование, упаковывание, хранение и транспортирование творога.

Молочное сырье, предназначенное для выработки творога, очищают на сепараторах-молокоочистителях или фильтруют через три слоя марли или другой фильтрующей ткани. Очищенное молоко подогревают до 37±2°С и разделяют на сепараторах-сливкоотделителях. При изготовлении творога жирного, полужирного и крестьянского молоко нормализуют по жиру с учетом массовой доли белка в цельном молоке, чтобы получился готовый продукт с заданным содержанием жира и влаги. Обезжиренное или нормализованное молоко пастеризуют при температуре 78±2°С с выдержкой 15-20 с в пластинчатых или трубчатых пастеризационно-охладительных установках или емкостных аппаратах. После пастеризации молоко охлаждают до температуры заквашивания.

Закваску готовят на чистых культурах мезофильных молочнокислых стрептококков, в том числе вносят культуру Enterococcus hirae ВКПМ В-10090. Перед внесением в молоко поверхностный слой закваски аккуратно снимают чистым продезинфицированным ковшом и удаляют. Затем закваску перемешивают до однородной консистенции чистой мутовкой (при приготовлении в заквасочных ушатах) или мешалкой и вливают в подготовленное молоко в количестве 5% общей массы. Продолжительность сквашивания молока 6 ч.

Водный раствор кальция хлорида (массовая доля кальция хлорида 30-40%) вносят в молоко после закваски: 400 г на 1000 кг заквашенного молока. Подготовку и приготовление раствора кальция хлорида производят в соответствии с Инструкцией по технохимическому контролю на предприятиях молочной промышленности. После внесения раствора соли в сквашенное молоко вводят 1%-ный раствора сычужного фермента из расчета 1 г препарата активностью 100000 ME на 1000 кг молока.

Сычужный порошок или пепсин вносят в молоко в виде 1%-ного водного раствора, приготовленного на кипяченой и охлажденной до 36±3°С воде. Раствор фермента вносят в молоко при постоянном перемешивании. Через 10-15 мин после внесения раствора фермента заканчивают перемешивание и оставляют молоко в покое до образования плотного сгустка кислотностью 61±5°Т для творога 9%-ной и 18%-ной жирности, 65±5°Т для крестьянского и 71±5°Т для нежирного творога.

Для обработки сгустка используют ручные лиры, в которых в качестве ножей служит натянутая тонкая нержавеющая проволока. Такими проволочными ножами сгусток разрезают на кубики размерами 2×2×2 см. Сгусток сначала разрезают по длине ванны на горизонтальные слои, а затем - по длине и ширине на вертикальные. После такой обработки сгусток оставляют на 40-60 мин для отделения сыворотки и нарастания кислотности. Отделившуюся сыворотку сливают из ванны. Сгусток после слива сыворотки разливают в бязевые или лавсановые мешки размерами 40×80 см. Мешки заполняют примерно на 70%, что составляет 7-9 кг творога. Затем мешки завязывают и укладывают один на другой в ванну для самопрессования, пресс-тележку или установку УПТ для прессования и охлаждения творога.

Чтобы ускорить отделение сыворотки, а также при плохом выделении сыворотки сгусток нагревают путем подачи в межстенное пространство творожной ванны пара или горячей воды. Для равномерного подогревания верхние слои сгустка перемещают деревянной или металлической пластиной (лопатой) от одной стенки ванны к другой. Сгусток подогревают до 40±2°С в течение 30-40 мин для творога 9%-ной и 18%-ной жирности, 35±2°С в течение 20-40 мин для крестьянского и 36±2°С в течение 15-20 мин для творога нежирного.

Самопрессование творога продолжается не менее 1 ч. Прессование продолжают до получения творога с массовой долей влаги, предусмотренной нормативной документацией. Для творога 18%-ной жирности она составляет 65%; 9%-ной жирности - 73; крестьянского - 74,5; столового - 76; нежирного - 80; для диетического плодово-ягодного 11%-ной жирности - 64, 9%-ной жирности - 66, 4%-ной жирности - 77 и нежирного - 79% влаги. При выработке нежирного творога обезвоживание сгустка можно проводить на творожном сепараторе. После сепарирования и прессования творог охлаждают. Творог охлаждают в мешках, расположенных на стеллажах холодильной камеры или уложенных в тележки или ушаты. Творог охлаждают до температуры 12±2°С и направляют на упаковывание и маркирование.

Пример 3. Использование штамма Enterococcus hirae ВКПМ В-10090 при производстве ряженки

Нормализованное молоко жирностью 4% подвергают термической обработке при 100°С без выдержки, охлаждают до 38°С, вносят закваску для ряженки в количестве 2%, активизированную биомассу бифидобактерий на молоке в количестве 0,1% и штамм Enterococcus hirae ВКПМ В-10090 на стерильном молоке в количестве 0,5%. Сквашивание проводят при температуре 37°С до достижения титруемой кислотности 65°Т. Далее продукт медленно охлаждают до 6°С, после чего проводят розлив.