Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Yarrowia lipolytica - ПРОДУЦЕНТ КЛЕТОЧНО-СВЯЗАННОЙ ЛИПАЗЫ

Изобретение относится к генной инженерии и микробиологической промышленности и может быть использовано для получения липазы, иммобилизованной на поверхности клеток дрожжей.

Одним из приоритетных направлений современной биотехнологии является иммобилизация ферментов на поверхности клеток дрожжей. Данный способ закрепления фермента обладает всеми преимуществами стандартной иммобилизации на носителях (возможность многократного использования, в ряде случаев улучшенные промышленно-ценные характеристики), но при этом является природным вариантом иммобилизации и позволяет отказаться от наиболее затратных стадий при производстве ферментных препаратов - очистки фермента и связывания его с сорбентом. Сама клетка выступает в данном случае в качестве носителя. Белок, продуцируемый клеткой, оказывается связанным с ней сразу после транспортировки его наружу, поэтому приготовление препарата с иммобилизованным ферментом сводится только к отделению клеток после ферментации и лиофилизации.

В норме на поверхности клеток дрожжей располагаются множество белков, участвующих в строении и поддержании клеточной стенки, разнообразные литические ферменты (Biochimica et Biophysica Acta, review, 1999, 1426(2), pp.373-383) и в общем случае для иммобилизации ферментов на поверхности клеток к аминокислотной последовательности фермента добавляют фрагмент или весь белок клеточной стенки (Biotechnology Advances, 2000, vol.18, pp.121-140). Полученный рекомбинантный комплекс закрепляется на поверхности клетки по механизму, свойственному используемому белку клеточной стенки.

В настоящее время проводятся активные исследования, направленные на изучение механизмов закрепления белков на поверхности клеток, а также на получение штаммов-продуцентов ферментов, в частности липазы, иммобилизованной на поверхности клеточной стенки дрожжей.

Известен ряд штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae, продуцирующих клеточно-связанные липазы Yarrowia lipolytica Lip7 и Lip8 с активностью 283 и 121 единиц/г сухого веса (Applied Microbiology and Biotechnology, 2010, vol.88, pp.885-891), а также липазы Rhizopus oryzae ROL и Candida antarctica CALB с активностью 61 и 117 единиц/г сухого веса соответственно (Applied and Environmental Microbiology, 2002, vol.68, pp.4517-4522; Applied Microbiology and Biotechnology, 2009, vol.82, pp.59-66). Известен штамм дрожжей Pichia pastoris, продуцирующий клеточно-связанную липазу С. antarctica CALB с активностью 220 единиц/г сухого веса (Biotechnology Letters, 2010, vol.32, pp.1131-1136). Недостатком известных штаммов является то, что достигаемые уровни активности клеточно-связанного фермента недостаточно высоки для его промышленного применения.

Получены штаммы дрожжей Y. lipolytica, продуцирующие клеточно-связанную липазу Lip2 с более высокой активностью, но она достигается на средах, содержащих оливковое масло, т.е. недоступных в производственных масштабах (Applied Microbiology and Biotechnology, 2011, vol.91, pp.645-654).

Технической задачей настоящего изобретения является расширение арсенала штаммов-продуцентов клеточно-связанной липазы.

Задача решена путем конструирования рекомбинантного штамма дрожжей Y. lipolytica ВКПМ Y-3600 - продуцента клеточно-связанной липазы.

Под рекомбинантным штаммом дрожжей понимается линия микроорганизмов производных Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3600, сохраняющих основные мутации и генно-инженерные модификации, обеспечивающие продукцию клеточно-связанного фермента липазы.

Для выполнения поставленной задачи выбраны дрожжи Y. lipolytica благодаря достаточно хорошей генетической изученности этого объекта, накопленному опыту использования этого объекта в качестве продуцента различных ферментов и наличию собственных секретируемых промышленно-ценных липаз.

В качестве фермента выбрана кислотоустойчивая внеклеточная липаза Y. lipolytica - продукт гена LIP2.

Рекомбинантный штамм Y. lipolytica ВКПМ Y-3600 получен путем трансформации штамма Y. lipolytica Po1f (leu⁺) экспрессионной плазмидой pY-YlPIR1-LIP2.

Штамм Y. lipolytica Po1f (leu⁺) получен из штамма Y. lipolytica Po1f (ATCC MYA-2613) путем комплементации ауксотрофности по лейцину с помощью интегративного вектора pNB268 (ATCC 69355). Штамм Y. lipolytica Po1f (далее штамм Po1f) был выбран как генетически маркированный штамм (что позволяет использовать современные методы генной инженерии), который не секретирует избытка протеаз (Journal of Biotechnology, 2004, vol.109, pp.63-81).

Экспрессионная плазмида pY-YlPIR1-LIP2 содержит находящиеся в рамке считывания ген белка клеточной стенки YlPIR1 (Yeast, 2003, vol.20, pp.417-426) и ген липазы LIP2 под регуляцией сильного квазиконститутивного гибридного промотора hp4d (US 6083717), а также следующие генетические элементы: участки транспозонных повторов zeta для негомологичной рекомбинации (US 6582951), терминатор гена XPR2 и дефектный маркер ura3d4 (Yeast, 2001, vol.18, pp.97-113) для отбора трансформантов с многокопийной интеграцией в геном, экранированный сайтами узнавания рекомбиназы Cre фага P1 (Lox66 и Lox71) (Nucleic Acids Research, 2003, vol.31, pp.140-152).

Полученный штамм дрожжей Y. lipolytica депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (117545 Москва, 1-й Дорожный пр-д, д.1) и имеет регистрационный номер ВКПМ Y-3600.

Штамм Y. lipolytica ВКПМ Y-3600 характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки. Суточная культура в жидкой глюкозопептонной среде YPD (мас.%: пептон - 1, дрожжевой экстракт - 1, глюкоза - 2, вода - остальное) представлена овальными, удлиненно-овальными, округлыми клетками размером 4,6-6,0×4,5-12,5 мкм. Почкование полярное или латеральное, на узком основании. К третьим суткам большинство клеток почкуются и образуют псевдомицелии. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. Колонии на мальто-агаре (J.A.Bamett et al. "Yeasts characteristics and identification", Cambridge, 1983) кремового цвета, пастообразные, слегка приподнятые в центре, морщинистые, с фестончатым краем. Штрих на мальто-агаре непрерывный, плоский, блестящий, кремово-белого цвета, пастообразный, края ровные, со временем становится складчатым. Спор не образует.

Физиолого-биохимические признаки. Облигатный аэроб. Сахара не сбраживает. Ассимилирует: сахарозу, глюкозу, D-галактозу (медленно), L-сорбозу, D-рибозу, этанол, глицерин, эритрит, адонит, D-маннит, сорбит и молочную, янтарную, лимонную, глюконовую кислоты. Не ассимилирует: мальтозу, лактозу, целлобиозу, трегалозу, мелибиозу, раффинозу, мелицитозу, инулин, крахмал, D-ксилозу, L- и D-арабинозу, раммозу, дульцит, инозит, D-глюкозамин и глюкуроновую, 2-кетоглюконовую, 5-кетоглюконовую кислоты. Не ассимилирует нитраты. Не растет в безвитаминной среде, требует тиамин, не требует биотин.

Оптимальное значение рН для роста 5,5-7,0. Не растет при 37°C. Максимальная температура роста 35°C. Разжижает желатин. Растет на алканах. Гидролизует мочевину.

Заявляемый штамм при выращивании в пробирках способен продуцировать клеточно-связанную липазу в количестве до 2700 единиц/г сухого веса.

Изобретение подтверждено следующими примерами конкретного исполнения. Пример 1. Конструирование экспрессионной плазмиды pY-YlPIR1-LIP2.

Ген белка клеточной стенки YlPIR1 (без стоп-кодона) размером 858 п.н. получают методом ПЦР сшивки двух ПЦР-продуктов, синтезированных по праймерам:

ATATGGTCTCTAATGCTCTTCAAGTCCGCTG (P1-Eco31I-F) и

GGTGTTGTCTCGGCAGCAGCAG (Р1-siteless-R),

а также

GCCGAGACAACACCCGCCACCGTCC (P1-siteless-F) и

TACCTAGGTGTACACACAGTCCTCGAGGTTGACAA (P1-Bsp1407-XmaJI-R)

с геномной ДНК штамма Y. lipolytica Po1f, полученной по методу, описанному в (Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory, 1994).

Все используемые в работе праймеры синтезированы фирмой «Синтол», Москва.

ПЦР-продукт гена YlPIR1 обрабатывают эндонуклеазами рестрикции Eco31I и XmaJI и лигируют на вектор pUC-hp4d, обработанный эндонуклеазами рестрикции BpiI и XmaJI. Гибридный промотор hp4d и вектор pUC-hp4d конструируют, как описано в (US 6083717). Лигазную смесь трансформируют в Е. coli XL1(Blue). Клоны, содержащие необходимую вставку амплифицированной ДНК гена YlPIR1, отбирают на чашках по устойчивости к ампициллину. Плазмидную ДНК, выделенную из полученных клонов, проверяют рестрикционным анализом и секвенируют (стандартные праймеры M13/pUC 17-mer, M13/pUC reverse 17-mer, а также P1-Eco31I-F, P1-siteless-R, P1-siteless-F и P1-Bsp1407-XmaJI-R).

Полученная плазмида размером 4099 п.н. названа php4d-YlPIR1.

Ген липазы LIP2 размером 1032 п.н. получают путем обработки плазмиды pZ-ura3d4-hp4d-LIP2 (RU 2355754) эндонуклеазами рестрикции Bsp1407I и XmaJI, очищают после электрофореза в 1% агарозном геле и лигируют с вектором php4d-YlPIR1, обработанным эндонуклеазами рестрикции Bsp1407I и XmaJI. Полученная плазмида размером 5125 п.н. названа php4d-YlPIR1-LIP2.

Нуклеотидную кассету hp4d-YlPIR1-LIP2 получают из плазмиды php4d-YlPIR1-LIP2 путем обработки эндонуклеазами рестрикции NheI и XmaJI и лигируют с плазмидой pZ-lox66-ura3d4-lox71-hp4d-LIP2, обработанной эндонуклеазами рестрикции NheI и XmaJI.

Плазмиду pZ-lox66-ura3d4-lox71-hp4d-LIP2 получают из плазмиды pZ-ura3d4-hp4d-LIP2 путем добавления сайтов Lox66 и Lox71. Для этого деффектный маркер ura3d4 синтезируют методом ПЦР по праймерам TTTGCTAGCTACCGTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATGCCCTCCTACGAAGCTC(URA-71-F) и

ATCGATACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCGACAAAGGCCTGTTTС (URA-66-R).

Полученный ПЦР-продукт длиной 1391 п.н. обрабатывают эндонуклеазами рестрикции Bsu15I и NheI и лигируют с ДНК плазмиды pZ-ura3d4-hp4d-LIP2, обработанной эндонуклеазами рестрикции Bsu15I и NheI, заменяя тем самым ura3d4 на lox66-ura3d4-lox71.

Итоговая экспрессионная плазмида для иммобилизации липазы на поверхности клеточной стенки обладает длиной 6855 п.н. и названа pY-YlPIR1-LIP2.

Пример 2. Конструирование заявляемого штамма

Экспрессионную плазмиду pY-YlPIR1-LIP2 обрабатывают эндонуклеазами рестрикции XbaI и MunI и используют для трансформации штамма Y. lipolytica Po1f(leu⁺).

Штамм Y. lipolytica Po1f(leu⁺) получен из штамма Ро1f путем комплементации ауксотрофности по лейцину вектором pNB268 (ATCC 69355). Вектор pNB268 линеаризуют эндонуклеазой рестрикции MluI и трансформируют в штамм Po1f литиевым методом (Current Genetic, 1989, vol 16, pp.253-260). Селекцию трансформантов ведут на минимальной агаризованной среде YNBDura (минимальная среда YNB (Himedia G091) с добавлением глюкозы (2 мас.%), урацилла (0,05 мас.%) и агара (2 мас.%)).

Трансформацию штамма Po1f(leu⁺) экспрессионной плазмидой для иммобилизации липазы на поверхности клетки осуществляют методом электропорации при следующих условиях: напряжение 1500 кВ, сопротивление 400 Ом и емкость 15 мкФ. Для трансформации используют 5 мкг ДНК. К клеткам сразу после электропорации добавляют 1 мл жидкой SYPD среды (YPD среда, содержащая 1М раствор сорбита) и инкубируют 1 час при 30°C и постоянном перемешивании. Далее клетки промывают стерильной водой и высевают на селективную агаризованную среду SYNBD (среда YNB с добавлением глюкозы (2 мас.%), сорбита до конечной концентрации 0,1 М и агара (2 мас.%)). Селекцию трансформантов ведут по признаку комплементации ауксотрофности по урацилу.

Полученные трансформанты культивируют в жидкой среде YNBD₅ (среда YNB с добавлением глюкозы (5 мас.%) в пробирках (50 мл) с рабочим объемом 10 мл при 30°C и постоянном перемешивании (230 об/мин). В качестве контроля используют штамм Y. lipolytica Po1f (leu⁺ ura⁺), полученный из штамма Po1f(leu⁺) путем комплементации ауксотрофности по урацилу (Biotechnology and Bioengineering, 2010, vol.107, pp.673-682).

Активность клеточно-связанной липазы измеряют на 5 сутки культивирования методом, основанном на гидролизе п-нитрофенилбутирата с образованием бутирата и п-нитрофенола (Applied Microbiology and Biotechnology, 2003, vol.63, pp.136-142). Единица липазной активности соответствует такому количеству фермента, которое высвобождает 1 мкмоль п-нитрофенола за минуту в пересчете на единицу сухого веса культуры.

Для измерения активности клеточно-связанной липазы 200 мкл суспензии клеток осаждают центрифугированием, промывают дважды изотоническим раствором и готовят ряд разведений (в 10, 100 и 1000 раз).

Для определения сухой биомассы клеток 1 мл суспензии клеток осаждают центрифугированием, лиофилизируют в вакуумном сушильном шкафу FreeZone 6 Plus (Labconco, USA) и взвешивают.

Активность липазы, иммобилизованной на поверхности клеток полученных трансформантов, варьировала от 900 до 2700 единиц/г сухого веса. Заявляемый штамм Y. lipolytica ВКПМ Y-3600, представляющий собой трансформант №13 Y. lipolytica Po1f(leu⁺, YlPIR1-LIP2), при культивировании в пробирках обладал активностью клеточно-связанной липазы 2700 единиц/г сухого веса.

Пример 3. Культивирование заявляемого штамма

Посевную культуру штамма Y. lipolytica ВКПМ Y-3600 предварительно выращивают в жидкой YPD среде в пробирках (50 мл) с рабочим объемом 5 мл при 30°C в течение 18 часов.

Среду для культивирования (YNBD₅) засевают посевной культурой титром 5×10⁵ клеток на мл. Культивирование проводят в пробирках (50 мл) с рабочим объемом 10 мл при 30°C и постоянном перемешивании (230 об/мин). Во время культивирования контролируют значение рН среды. При снижении рН ниже 4,5 добавляют мел в концентрации 1 мас.%. В качестве контроля используют штамм Y. lipolytica Po1f (leu⁺ ura⁺). Активность клеточно-связанной липазы определяли на 3, 4, 5 сутки культивирования, как описано в примере 2 (табл.1).

Таким образом, заявляемый штамм Y. lipolytica ВКПМ Y-3600 позволяет получить активность 2700 ед./г сухого веса клеточно-связанной липазы при культивировании в минимальной среде, экономически целесообразной для ферментации в промышленных масштабах.