СОСТАВ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ РАСТЕНИЙ СЕМЕЙСТВА РЯСКОВЫЕ (WOLFFIA ARRHIZA) В УСЛОВИЯХ IN VITRO

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для производства как высокобелковых кормов в отраслях кормопроизводства, так и разнообразных белковых препаратов в фармацевтике и ветеринарии.

При культивировании растений семейства рясковых (разные виды Lemna, Wolffia, Spirodela) в условиях in vitro рядом исследователей рекомендованы среды, составленные по прописям Мурасиге-Скуга (наиболее универсальная среда) (Воинов Н.А. и др. 2009), Гамборга, Шенка-Хильдебрандта (Schenk and Hildebrandt, 1972; Gamborg et al., 1968; Boehm et al., 2001; Kruse et al., 2001; Li J. et al., 2004; Friedrich A.S., 2005).

Наиболее распространенными средами для водных и песчаных культур являются среды, составленные по прописям Кнопа, Стейнберга и Хогланда-Арнона (Гродзинский А.М., Гродзинский Д.М., 1973; Steinberg, R., 1946; Knop, 1865; Hoagland and Arnon., 1938) и имеющие более низкое, по сравнению с вышеупомянутыми, содержание минеральных веществ. Все указанные среды разработаны для культивирования широкого круга растений, поэтому не в полной мере удовлетворяют индивидуальным потребностям в элементах питания отдельно взятого объекта, что не позволяет максимально реализовать его потенциальную биологическую продуктивность.

Наиболее близкими по биологической сущности к изобретению являются среда Хогланда-Арнона (Гродзинский А.М., Гродзинский Д.М., 1973; Hoagland and Arnon., 1938), включающая в свой состав следующие компоненты, мас.%:

К недостаткам указанной среды для культивирования водных растений относятся: несбалансированность минерального питания для индивидуальных потребностей Wolffia arrhiza и практически полное отсутствие органических элементов питания за исключением сахарозы.

Задача изобретения - повышение биологической продуктивности Wolffia arrhiza за счет оптимизации содержания элементов питания в культивационной среде.

Поставленная задача достигается изменением баланса минеральных элементов в питательном растворе, заменой некоторых минеральных элементов и включением в раствор дополнительных как минеральных, так и органических компонентов. Для этого среда, включающая фосфат калия монозамещенный - KН₂РO₄, четырехводный нитрат кальция - Ca(NO₃)₂×4Н₂O, нитрат калия - KNO₃, семиводный сульфат магния - MgSO₄×7H₂O, двуводный молибдат натрия - Na₂MoO₄×2H₂O, семиводный сульфат цинка - ZnSO₄×7H₂O, двунатриевый дигидрат этилендиаминтетрауксусной кислоты - Na₂ЭДТА×2Н₂O, пятиводный сульфат меди - CuSO₄×5H₂O и борную кислоту - Н₃ВO₃, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит калия йодид -KI, шестиводный хлорид кобальта - СоСl₂×6Н₂O, аспарагин, глутамин, тиамин, пиридоксин, аскорбиновую кислоту, мезоинозит, семиводный сульфат железа - FeSO₄×7H₂O и пятиводный сульфат марганца - MnSO₄×5H₂O, при следующем содержании компонентов, мас.%:

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемый состав раствора отличается от известных по содержанию всех компонентов, ионной формой ряда компонентов и введением новых компонентов. Таким образом, заявляемое решение соответствует критерию «новизна». Разработанная среда обеспечила многократное повышение продуктивности Wolffia arrhiza по целому комплексу показателей, таких как: прирост биомассы популяции, содержание тотального белка в 100 мг сырой массы и процентное содержание белка в сухой массе, обеспечивая при этом достаточно высокий показатель содержания сухого вещества, и не вызывая видимых физиологических отклонений в архитектонике растения. Наиболее важный показатель - выход тотального белка с популяции - также превосходит аналогичный показатель при культивировании Wolffia arrhiza на ранее известных аналогах сред. Таким образом, данный состав компонентов среды действительно увеличивает продуктивность объекта, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого решения критерию «существенные отличия».

Для экспериментальной проверки заявляемого состава были подготовлены 4 варианта: прототип (среда Хогланда-Арнона (Hg)) и 3 варианта заявляемой среды (W3M«1» - среда составлена по наименьшей границе заявляемых допустимых интервалов масс компонентов, W3M«2» - среда составлена по средним величинам из заявляемых допустимых интервалов масс компонентов, W3M«3» - среда составлена по наибольшей границе заявляемых допустимых интервалов масс компонентов).

Смеси получили простым смешиванием. Среды готовили из концентрированных маточных растворов стандартной компоновки (Шевелуха B.C., 1998):

Растения помещали на жидкие питательные среды в количестве 100 растений в одну колбу общим объемом 500 мл в трехкратной повторности для каждого из вариантов. Объем среды в каждой колбе составлял 300 мл, культивацию осуществляли на шейкере при 90 об/мин. Учетный период - 1 месяц со дня посадки.

Приведенные в таблице данные по результатам дисперсионного анализа показали наличие достоверных различий фактора на 95% уровне значимости.

Из таблицы следует, что заявляемая среда существенно превосходит по всем показателям продуктивности прототип. Также полученные данные свидетельствуют о том, что при использовании граничных значений заявляемых допустимых интервалов масс компонентов происходит снижение продуктивности Wolffia arrhiza по всем показателям в связи с дефицитом либо избытком элементов питания в среде.

Источники информации

1. Воинов Н.А., Волова Т.Г., Зобова Н.В., Маркова С.В., Франк Л.А., Шишацкая Е.И. Современные проблемы и методы биотехнологии / Учеб. пособие. - Красноярск, ИПК СФУ, 2009. - 418 с.

2. Гродзинский А.М., Гродзинский Д.М. (1973). Краткий справочник по физиологии растений. Изд 2, испр., доп. - Киев: Наукова думка. - 590 с.

3. Сельскохозяйственная биотехнология / В.С. Шевелуха, С.В. Калашникова, Е.З. Кочиева [и др.]. - М.: Высш. шк., 1998. - 416 с.

4. Boehm R., Kruse С., Voeste D., Barth S. and Schnabl H. (2001) A transient transformation system for duckweed (Wolffia columbiana) using Agrobacterium-mediated gene transfer. J Appl Bot 75:107-111.

5. Friedrich A.S. (2005). Untersuchungen zu Kultivierung, Transformation und Fermentation von Wolffia spec. - Inaugural - Dissertation. - 177 s.

6. Gamborg O.L., Miller R.A. and Ojima K. (1968). Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Experimental Cell Research 50, 151-158.

7. Gamborg O.L., Constabel F., La Rue, T.A.G., Miller R.A. & Steck W. (1971). The influence of hormones on secondary metabolite formation in plant cell cultures. In Les Cultures de Tissas de Plantes, pp.335-44. Paris: Centre National de la Recherche Scientifique.

8. Hoagland D.R. and Arnon D.I. (1938). The water-culture method for growing plants without soil Univ. Calif. Coll. Agric. Exp. Sta. Circ. Berkeley, CA 347-353.

9. Knop W. (1865). Quantitative Utersuchungen Über den ErnährungensprozeB der Pflanze. Landw. Versuchssat. 7:93.

10. Knop W. (1865) Arbeiten aus dem Laboratorio der Versuchs-Station zu Moecern. Die Landwirtschaftlichen Versuchs-Stationen 7: 436-450.

11. Kruse C., Boehm R., Voeste D., Barth S. and Schnabl H. (2001). Transient transformation of Wolffia columbiana by particle bombardment. Aquatic Bot 72:175-181.

12. Li J., Jain M., Vunsh R., Vishnevetsky J., Hanania U., Flaishman M., Perl A., Edelman M. Callus induction and regeneration in Spirodela and Lemna // Plant Cell Rep (2004) 22:457-464.

13. Steinberg R., 1946: Mineral requirement of Lemna minor. Plant Physiology, 21, 42-48.