ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ КОМБИНАЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ ИНГИБИТОР VEGF И ИРИНОТЕКАН

Изобретение касается комбинаций ингибитора VEGF и химиотоксичного вещества класса ингибиторов топоизомеразы, используемых при лечении неопластических заболеваний.

Ингибиторы VEGF, которые являются ингибиторами эндотелиального сосудистого фактора роста, в большинстве случаев представляют собой биологические продукты, выбранные среди растворимых рецепторов, антисенсов, аптамеров РНК (RNA) и антител. Ингибиторы топоизомеразы, используемые при лечении известных неопластических заболеваний, выбирают среди камптотецинов, в том числе СРТ 11, топотекана и пиридобензоиндола. Настоящая комбинация нацелена, в частности, на лечение рака ободочной кишки или желудка.

Описание и получение ингибитора VEGF, используемого, предпочтительно, в изобретении, который представляет собой химерный белок VEGF-Trap, описано в заявке на патент WO00/75319. Имеются несколько форм реализации химерного белка.

Форма реализации, соответствующая VEGF-Trap, представляет собой форму, описанную на фигуре 24 (последовательность). VEGF-Trap, используемый в изобретении, представляет собой слитый белок, содержащий сигнальную последовательность VEGFR1, слитую с доменом Ig D2 рецептора VEGFR1, которая сама слита с доменом Ig D3 рецептора VEGFR2, слитым, в свою очередь, с доменом Fc IgG1, называемый еще VEGFR1R2-FcΔC1 или Flt1D2.Flk1D3. FcΔC1.

Обычно дозы VEGF-Trap, используемые для человека, которые зависят от собственных факторов пациента, находятся в интервале от 1 до 10 миллиграмм на килограмм, когда введение осуществляется подкожным путем или внутривенным путем.

Среди ингибиторов топоизомеразы предпочитают использовать иринотекан, известный также под общим названием СРТ-11.

Обычно иринотекан применяют внутривенно при дозе, находящейся в интервале от 100 мг/м² до 500 мг/м², согласно схеме введения. Например, используют дозу 150 мг/м² при еженедельной схеме и дозу в интервале от 200 до 400 мг/м² при схеме каждые три недели.

В статье H. Hurwitz, L. Fehrenbacher, W. Novotny, T. Cartwright, J. Hainsworth, W. Heim, J. Berlin, A. Baron, S. Griffing, E. Holmgren, N. Ferrara, G. Fyfe, R. Ross, F. Kabbinavar, вышедшей в свет в “The New England Journal of Medecin”, был описан клинический опыт, доказывающий лучшую степень выживания при использовании комбинации бевацизумаба с иринотеканом, 5ФУ (5FU) и лейковорином по сравнению с той же самой комбинацией, не содержащей бевацизумаба. В этом опыте ничто не доказывает, что улучшение степени выживания происходит в результате комбинации иринотекана с бевацизумабом, оно может так же хорошо происходить в результате комбинации 5FU или лейковорина с бевацизумабом, или может происходить в результате четверной комбинации. Однако, так как известно, что каждое из противораковых средств оказывает, помимо своего терапевтического воздействия, побочные токсические воздействия, кажется уместным максимально ограничить их присутствие, особенно, когда тот же самый эффект может быть получен в отсутствие, по меньшей мере, одного из них. С другой стороны, эта статья не доказывает никакого синергического эффекта в смысле Корбета (Corbett), то есть эффекта, который не может быть получен с каждым из элементов комбинации, используемым индивидуально при его предельно допустимой дозе.

VEGF-Trap представляет собой растворимый рецептор, порождаемый слиянием второго домена Ig VEGFR-1 с третьим доменом Ig VEGFR-2 и последующим слиянием с частью Fc IgG1 человека. Как рецептор VEGFR-1, афлиберсепт (VEGF Trap) имеет очень высокое сродство к VEGF-A с Kd 0,5 пикоМ. Обладающая высоким сродством связь VEGF Trap с VEGF-A приводит к образованию комплекса, который мешает VEGF зафиксироваться и активировать свои рецепторы на поверхности клеток.

В сравнении с авастином (или бевацизумабом) VEGF Trap представляет собой растворимый рецептор, тогда как авастин представляет собой антитело, направленное против VEGF-A. VEGF Trap имеет сродство к VEGF-A, которое значительно больше сродства авастина, и другой профиль селективности, так как VEGF Trap связывается, равным образом, с другими лигандами рецепторов VEGFR-1-2, то есть с PIGF (плацентарный фактор роста) и с VEGF-В. Вместе с тем, VEGF Trap имеет молекулярную массу, значительно меньшую молекулярной массы авастина (115 кДа для афлиберсепта против 160 кДа для авастина), которая более благоприятна для проникновения в солидные опухоли.

Теперь было обнаружено, и это то, что является объектом настоящего изобретения, что эффективность ингибиторов VEGF может быть значительно улучшена, когда их вводят в сочетании с по меньшей мере одним веществом, терапевтически используемым при противораковых лечениях, имеющим механизм действия, отличный от механизма действия ингибиторов VEGF.

Кроме того, так как активность продуктов зависит от используемых доз, можно использовать более высокие дозы и увеличить активность, уменьшая явления токсичности или замедляя их появление, сочетая с ингибиторами VEGF, или с их аналогами, другие терапевтически активные вещества факторов роста, типа гематопоэтических, такие как G-CSF или GM-CSF или некоторые интерлейкины.

В частности, изобретение касается комбинаций VEGF Trap с иринотеканом.

Улучшенная эффективность комбинации согласно изобретению может быть продемонстрирована определением терапевтического синергизма.

Комбинация демонстрирует терапевтический синергизм, если она терапевтически превосходит один и другой из компонентов, используемый в его оптимальной дозе.

Чтобы продемонстрировать эффективность комбинации, в рассматриваемом исследовании необходимо сравнить предельно допустимую дозу комбинации с предельно допустимой дозой каждого из изолированных компонентов. Указанная эффективность может быть количественно определена, например, log₁₀ числа убитых клеток, который определяется согласно следующей формуле:

log₁₀ числа убитых клеток = Т-С (дней)/3,32×T_d

в которой Т-С обозначает задержку роста клеток, которая представляет собой среднее время, в днях, для того, чтобы опухоли обработанной группы (Т) и опухоли контрольной группы (С) достигли заданной величины (например, 1 г), и T_d обозначает время, в днях, необходимое для удвоения объема опухоли у контрольных животных [T.H. CORBETT et al., Cancer, 40, 2660-2680 (1977); F.M. SCHABEL et al., Cancer Drug Development, Part B, Methods in Cancer Research, 17, 3-51, New-York, Academic Press Inc. (1979)]. Продукт рассматривается как активный, если log₁₀ числа убитых клеток больше или равен 0,7. Продукт рассматривается как очень активный, если log₁₀ числа убитых клеток больше или равен 2,8.

Комбинация, используемая в ее собственной предельно допустимой дозе, в которой каждый из компонентов будет присутствовать в дозе, обычно меньше или равной его предельно допустимой дозе, продемонстрирует терапевтический синергизм, когда log₁₀ числа убитых клеток будет больше величины log₁₀ числа убитых клеток лучшего компонента, когда он введен один, и, в частности, в случае превосходства log числа убитых клеток по меньшей мере на единицу.

Эффективность комбинаций на солидных опухолях может быть определена экспериментально следующим образом.

Животным, подвергающимся испытанию, обычно мышам, в 0-й день двухсторонне подкожным путем прививают от 30 до 60 мг фрагмента опухоли человека HCT116 (BRATTAIN M.G., FINE W.D., KHALED F.M., THOMSON J. and BRATTAIN D.E., Heterogeneity of malignant cells from a human colonic carcinoma. Cancer Res., 1981, 41, 1751-1756). Животных, несущих опухоли, перемешивают перед тем, как подвергнуть их различным обработкам и контролям. В случае лечения опухолей согласно настоящему изобретению, опухолям позволяли развиваться до размера, находящегося в интервале от 48 до 294 мг, что позволяло иметь среднюю опухоль на группу, находящуюся в интервале от 129 до 162 мг. Животные, которых подвергали лечению одним VEGF Trap, имели массу в интервале от 17,1 до 22,7 г, животные, которых подвергали лечению одним иринотеканом, имели массу в интервале от 17,5 до 22,3 г и животные, которые получали комбинацию имели массу в интервале от 17,5 до 23,6 г. Животные, несущие опухоли, равным образом, были подвергнуты тем же самым обработкам с одним эксципиентом, для того, чтобы иметь возможность отличить токсическое действие эксципиента от собственного воздействия химиотерапии на опухоль. Химиотерапию начинали на 12-й день после прививки опухоли. Инъекции VEGF Trap осуществляли подкожно одновременно с инъекциями иринотекана, которые осуществляли внутривенным путем по две инъекции ежедневно. Указанные инъекции осуществляли на 12, 15 и 18 день после имплантации опухоли. Разные группы животных взвешивали три или четыре раза в неделю до тех пор, пока не достигалась максимальная потеря массы, затем группы взвешивали, по меньшей мере, один раз в неделю до окончания опыта.

Опухоли измеряли два или три раза в неделю, до тех пор, пока опухоль не достигала приблизительно 2 г, или до смерти животного, если оно выживало до того, как опухоль достигала 2 г. Животных вскрывали в ходе умерщвления.

Противоопухолевую активность определяли в зависимости от разных регистрируемых параметров.

В качестве примеров, в следующих ниже таблицах приведены результаты, полученные с комбинациями VEGF Trap и иринотекана, использованными при их оптимальной дозе.

Настоящее изобретение касается также наборов фармацевтических композиций, содержащих продукты, используемые в комбинациях согласно изобретению.

Продукты, которые образуют комбинацию, могут быть введены одновременно, раздельно или рассредоточено во времени так, чтобы получить максимум эффективности комбинации; каждое введение может иметь переменную длительность, изменяющуюся от быстрого полного введения до непрерывной перфузии.

Из этого следует, что, с точки зрения настоящего изобретения, комбинации не ограничены только теми, которые получены физической ассоциацией компонентов, но также теми, которые дают возможность раздельного введения, которое может быть одновременным или рассредоточенным во времени.

Композиции согласно изобретению, предпочтительно, представляют собой композиции, вводимые парентеральным путем.

Композиции для парентерального введения представляют собой, обычно, стерильные фармацевтически приемлемые растворы или суспензии, которые, в известных случаях, могут быть приготовлены непосредственно перед применением. Для получения неводных растворов или суспензий могут быть использованы природные растительные масла, такие как оливковое масло, кунжутное масло или парафиновое масло, или пригодные для инъекций сложные органические эфиры, такие как этилолеат. Стерильные водные растворы могут быть получены растворением продукта в воде. Водные растворы пригодны для внутривенного введения в той мере, в которой надлежащим образом подобран рН, и в которой реализована изотоничность, например, при помощи достаточного количества хлорида натрия или глюкозы. Стерилизация может быть осуществлена нагреванием или любым другим способом, который не ухудшает композицию. Комбинации могут также находиться в форме липосом, или в форме ассоциатов с носителями, такими как циклодекстрины или полиэтиленгликоли.

В комбинациях согласно изобретению, применение компонентов которых может быть одновременным, раздельным или рассредоточенным во времени, особенно предпочтительно, что количество производного VEGF Trap составляет от 10% до 80% масс. от комбинации, причем это содержание можно варьировать в зависимости от природы ассоциированного вещества, желаемой эффективности и природы рака, подлежащего лечению.

Комбинации согласно изобретению используют, в частности, при лечении рака ободочной кишки и/или желудка. В частности, они могут обладать тем преимуществом, что дают возможность применять компоненты в дозах, определенно более низких, чем дозы, в которых их применяют в отдельности.

Следующий пример иллюстрирует комбинацию согласно изобретению.

ПРИМЕР

Для подкожного введения, согласно обычной методике, готовили, ампулы объемом 1 см³, содержащие 25 мг VEGF Trap, которые растворяли в 5 мМ фосфатном буфере, 5 мМ цитрата натрия, 100 мМ хлорида натрия, полисорбат 20 и 20%-ную сахарозу. Объем введения на мышь составлял 0,1 мл. VEGF Trap вводили один раз в день на 12, 15 и 18-й день после имплантации опухоли.

Раствор для внутривенного введения по 0,3 мл на мышь готовили, согласно обычной методике, исходя из коммерческого раствора 20 мг/мл иринотекана, предназначенного для разбавления 5%-ным раствором декстрозы в воде.

Указанные растворы вводили немедленно после соответствующего разбавления.

Лечение иринотеканом повторяли два раза в день с интервалом 4 часа на 12, 15 и 18-ый день после имплантации опухоли.

Результаты опыта объединены в прилагаемой таблице.

Время удвоения опухоли - 3,2 дня.

Использованные сокращения: (Т-С) задержка роста опухоли, lчук=log числа убитых клеток (lck).

Была обнаружена токсичность одного иринотекана при дозах 52,4, 32,5 и 20,2 мг/кг/инъекция, установленная вследствие смерти при дозе 52,4 и потери массы больше 20% при двух меньших дозах. Таким образом, предельно допустимая доза для иринотекана была 12,5 мг/кг/инъек. (суммарная инъецируемая доза 75,0 мг/кг). Доза 12,5 мг/кг/инъекция была найдена активной с lчук 1,8.

Что касается VEGF Trap, продукт хорошо переносился при всех тестированных дозах и был найден активным с lчук 1,7 при 40 мг/кг/введение и 25 мг/кг/введение. Меньшая доза 10мг/кг/введение тоже является активной с lчук 1,3. Доза 2,5 мг/кг/введение является неактивной.

Что касается комбинации иринотекана при 32,5 мг/кг/инъек., какова бы ни была доза VEGF Trap, комбинация была найдена токсичной с потерей массы 18%, близкой к токсичности. Меньшая доза 20,2 мг/кг/инъек. иринотекана с 40 мг/кг VEGF Trap была расценена как предельно допустимая доза. Данная доза показала lчук 3,0 и расценена как очень активная. Тот же самый уровень активности был найден с меньшими дозами VEGF Trap, как 25, 10, 2,5 мг/кг/введение (lчук 2,9, 3,0 и 2,9 соответственно).

Иринотекан при 12,5 мг/кг/инъек. в сочетании с VEGF Trap при 40 мг/кг/введение является активным с lчук 2,7. Данная противоопухолевая активность сохраняется с 25 и 10 мг/кг VEGF Trap (lчук 2,9 и 2,7 соответственно). Комбинация с 2,5 мг/кг/введение VEGF Trap имеет активность 2,0 lчук.

В заключение, активность комбинации VEGF Trap с иринотеканом показывает синергический эффект с log числа убитых клеток 3,0 при предельно допустимой дозе комбинации, который соответствует большему на 1 log числа убитых клеток, по сравнению с активностью каждого из компонентов, используемых в отдельности, которые показывают log числа убитых клеток 1,8 и 1,7 (для иринотекана при 12,5 мг/кг/инъекция и VEGF Trap при 40 мг/кг/введение, соответственно). Противоопухолевая активность сохраняется при нескольких уровнях доз, ниже предельно допустимой дозы комбинации.