Результат интеллектуальной деятельности: ПРИМЕНЕНИЕ ИЗОКСАЗОЛИНОВЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА ДОМАШНЕЙ ПТИЦЕ

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к профилактике или лечению инвазий паразитическими членистоногими домашних птиц и в окружающей их среде.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Многие паразитические членистоногие заражают домашних птиц, и наносят повреждения и раздражают животных, и поэтому представляют собой значительные проблемы с точки зрения экономических потерь, соответствия требованиям содержания животных и эпидемиологических проблем передачи заболеваний.

Птичьи клещи, такие как Dermanyssus gallinae (красный птичий клещ), Ornithonyssus sylviarum (северный куриный клещ) и Ornithonyssus bursa (тропический птичий клещ), представляют собой важные паразитические проблемы, особенно в производственных помещениях для несушек.

Обычные способы контроля паразитических членистоногих, и особенно контроля птичьего клеща, включают химические вещества, которые применяют в виде спреев, грубого или сплошного потока твердых частиц, мелкокапельного орошения, аэрозоля, дустов и/или в качестве промывного раствора для необитаемых или заселенных помещений для животных и окружающей их среды. Другие меры контроля включают опыление или опрыскивание зараженных паразитами домашних птиц с использованием порошкообразных или жидких синтетических органических химических веществ или добавления порошкообразных синтетических органических химических веществ в помет или пылевую ванну. Примеры синтетических органических химических групп, которые были использованы в такой химической обработке, включают пиретроиды, органические фосфаты, карбаматы, спиносад и тому подобное.

В последнее время химическая обработка все чаще тщательно исследуется в связи с широко распространившимся развитием невосприимчивости, а также проблемами охраны окружающей среды и безопасности труда.

В качестве альтернативы, аморфный диоксид кремния используют в качестве инертного дуста, который убивает паразитических членистоногих посредством обезвоживания. Обработка порошком диоксида кремния может быть сделана в присутствии домашних птиц, но требует очень сильную дозировку и обязывает заполнить порошком диоксида кремния всю площадь птичников. Кроме того, порошок диоксида кремния, как известно, вызывает ряд заболеваний легких как у птиц, так и у человека.

Дополнительная проблема состоит в том, что некоторые паразитические членистоногие, такие как клещи домашней птицы, как известно, обитают в щелях и трещинах птичников и, следовательно, их трудно убить с использованием известных химических обработок и обработки порошком диоксида кремния в помещениях.

Альтернативные способы, включая аттрактанты/репелленты насекомых, хищных клещей и вакцины, были описаны, но до сих пор не дают никаких единых или практических решений для широкого применения в производствах птиц.

Проблемы клещей часто повторно случаются в пораженных птицеводческих помещениях после обработки. Таким образом, из-за ограниченной эффективности требуется частая повторная обработка. Повторные курсы обработки могут быть стрессом для птиц, и могут в частности привести к потерям производства яиц у кур-несушек и племенных птиц.

Таким образом, ни один из этих способов не удовлетворяет потребности производителя птицы.

Таким образом, существует потребность в данной области техники, чтобы найти лучшее решение проблемы борьбы с паразитическими членистоногими, и особенно с клещами птицы в птицеводстве, не нанося при этом вред животным или людям.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к применению изоксазолинового соединения формулы (I)

в которой

R¹=галоген, CF₃, OCF₃, CN,

n=целое число от 0 до 3, предпочтительно 1, 2 или 3,

R²=С₁-С₃-галогеналкил, предпочтительно CF₃ или CF₂Cl,

Т=5- или 6-членное кольцо, которое необязательно замещено одним или несколькими радикалами Y,

Y=метил, галогенметил, галоген, CN, NO₂, NH₂-C=S, или два смежных радикала Y вместе образуют цепь, главным образом трех- или четырехчленную цепь;

Q=X-NR³R⁴ или 5-членное N-гетероарильное кольцо, которое необязательно замещено одним или несколькими радикалами;

Х=СН₂, СН(СН₃), СН(CN), CO, CS,

R³=водород, метил, галогенэтил, галогенпропил, галогенбутил, метоксиметил, метоксиэтил, галогенметоксиметил, этоксиметил, галогенэтоксиметил, пропоксиметил, этиламинокарбонилметил, этиламинокарбонилэтил, диметоксиэтил, пропиниламинокарбонилметил, N-фенил-N-метил-амино, галогенэтиламинокарбонилметил, галогенэтиламинокарбонилэтил, тетрагидрофурил, метиламинокарбонилметил, (N,N-диметиламино)-карбонилметил, пропиламинокарбонилметил, циклопропиламинокарбонилметил, пропениламинокарбонилметил, галогенэтиламинокарбонилциклопропил,

где Z^A=водород, галоген, циано, галогенметил (CF₃);

R⁴=водород, этил, метоксиметил, галогенметоксиметил, этоксиметил, галогенэтоксиметил, пропоксиметил, метилкарбонил, этилкарбонил, пропилкарбонил, циклопропилкарбонил, метоксикарбонил, метоксиметилкарбонил, аминокарбонил, этиламинокарбонилметил, этиламинокарбонилэтил, диметоксиэтил, пропиниламинокарбонилметил, галогенэтиламинокарбонилметил, цианометиламинокарбонилметил или галогенэтиламинокарбонилэтил;

или R³ и R⁴ вместе образуют заместитель, выбранный из группы, состоящей из:

или его соли, или его сольвата в профилактике или лечении инвазий паразитическими членистоногими домашних птиц, где эффективное количество изоксазолинового соединения вводят через питьевую воду.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, предназначенной для применения в профилактике или лечении инвазий паразитическими членистоногими домашних птиц, особенно кур, особенно кур-несушек через введение питьевой воды, содержащей эффективное количество изоксазолинового соединения, как описано в данном описании, и фармацевтически приемлемый носитель.

Настоящее изобретение также предоставляет способ борьбы с членистоногими в среде домашних птиц, отличающийся тем, что изоксазолиновое соединение, как описано в данном описании, вводят посредством введения через питьевую воду домашним птицам, занимающим эту среду.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что инвазии паразитическими членистоногими домашних птиц, особенно кур-несушек, можно лечить или предотвратить путем введения эффективного количества изоксазолинового соединения формулы (I) через питьевую воду.

Преимущества такого способ заключаются в следующем:

a) такой способ эффективен как в лечении существующих инвазий паразитическими членистоногими, так и в профилактике возникновения новых инвазий паразитическими членистоногими, и в борьбе с популяцией паразитических членистоногих в окружающей среде, и, следовательно, предотвращает повторное заражение животных паразитами;

b) свойства разрушения устойчивости у таких изоксазолиновых соединений очень благоприятны, т.е. паразитические членистоногие очень восприимчивы к подавляющему или губительному воздействию таких изоксазолинов;

c) такой способ является более удобным, чем применение других соединений из предшествующего уровня техники в помещениях, потому что такой способ может быть использован в то время, когда домашние птицы занимают помещения, например, в случае кур-несушек в период яйцекладки, и такой способ не требует специального оборудования для введения (как, например, требуемое для применения к помещению синтетических органических химических веществ в птичниках);

d) такой способ является более удобным, чем применения предшествующего уровня техники на животных (например, применение в виде спрея или дуста), поскольку он избегает трудоемких методов производства и избегает стресса домашних птиц как при осуществлении таких способов предшествующего уровня техники. Кроме того, применение акарицидов в виде спрея или дуста вызывает опасения с точки зрения безопасности животных и безопасности пользователя во время их введения;

e) такой способ прост в применении, используя доступное оборудование для введения лекарственных средств в воду на птицефермах и, следовательно, не требует или требует только минимальные инвестиции в новое оборудование; а также

f) данным способом возможно одновременное введение большому количеству животных в течение определенного периода времени и поэтому эффективный контроль популяции паразитических членистоногих на всей производственной единице.

Еще одним преимуществом введения изоксазолинового соединения через питьевую воду для кур-несушек является то, что оно позволяет регулировать дозировку и схему введения так, что при этом сохраняется эффективность, никакое отбраковывание яиц не потребуется из-за очень низкой концентрации изоксазолинового соединения, главным образом флураланера в яйцах. Это некритическая низкая концентрация флураланера в яйцах позволяет использовать яйца для употребления в пищу человеком от кур-несушек, которые были подергнуты лечению с использованием изоксазолиновых соединений (главным образом флураланера).

Следовательно, возможность вводить изоксазолиновые соединения предлагает целый ряд преимуществ по сравнению с существующими способами борьбы с паразитическими членистоногими в птицеводстве и птичниках.

Введение эффективного количества изоксазолинового соединения через питьевую воду увеличивает производство яиц, а также улучшает размер яиц и качество яиц по сравнению с зараженными, но не с животными, подвергнутыми лечению. Оно может еще больше повысить эффективность воспроизводства у племенных птиц.

Как было показано в примерах, введение изоксазолиновых соединений формулы (I), как описано ниже, главным образом флураланера, посредством питьевой воды домашним птицам, таким как курам-несушкам, может эффективно контролировать инвазии паразитическими членистоногими таких животных, особенно инвазии красным птичьим клещом и северным куриным клещом.

Изоксазолиновое соединение для применения по настоящему изобретению, может быть описано формулой (I):

где

R¹=галоген, CF₃, OCF₃, CN,

n=целое число от 0 до 3, предпочтительно 1, 2 или 3,

R²=С₁-С₃-галогеналкил, предпочтительно CF₃ или CF₂Cl,

Т=5- или 6-членное кольцо, которое необязательно замещено одним или несколькими радикалами Y,

Y=метил, галогенметил, галоген, CN, NO₂, NH₂-C=S, два смежных радикала Y вместе образуют цепь СН-СН=СН-СН, N-СН=СН-СН, СН-N=CH-CH, СН-СН=N-СН или СН-СН=СН-N, HC=HC-СН, СН-СН=СН, СН=СН-N, N-СН=СН;

Q=X-NR³R⁴ или 5-членное N-гетероарильное кольцо, которое необязательно замещено одним или несколькими радикалами Z^A, Z^B Z^D;

Х=СН₂, СН(СН₃), СН(CN), CO, CS,

R³=водород, метил, галогенэтил, галогенпропил, галогенбутил, метоксиметил, метоксиэтил, галогенметоксиметил, этоксиметил, галогенэтоксиметил, пропоксиметил, этиламинокарбонилметил, этиламинокарбонилэтил, диметоксиэтил, пропиниламинокарбонилметил, N-фенил-N-метил-амино, галогенэтиламинокарбонилметил, галогенэтиламинокарбонилэтил, тетрагидрофурил, метиламинокарбонилметил, (N,N-диметиламино)-карбонилметил, пропиламинокарбонилметил, циклопропиламинокарбонилметил, пропениламинокарбонилметил, галогенэтиламинокарбонилциклопропил,

R⁴=водород, этил, метоксиметил, галогенметоксиметил, этоксиметил, галогенэтоксиметил, пропоксиметил, метилкарбонил, этилкарбонил, пропилкарбонил, циклопропилкарбонил, метоксикарбонил, метоксиметилкарбонил, аминокарбонил, этиламинокарбонилметил, этиламинокарбонилэтил, диметоксиэтил, пропиниламинокарбонилметил, галогенэтиламинокарбонилметил, цианометиламинокарбонилметил или галогенэтиламинокарбонилэтил;

или

R³ и R⁴ вместе образуют заместитель, выбранный из группы, состоящей из:

где Z^A=водород, галоген, циано, галогенметил (CF³).

В одном предпочтительном варианте осуществления в формуле (I) Т выбирают из

где в Т-1, Т-3 и Т-4 радикал Y представляет собой водород, галоген, метил, галогенметил, этил, галогенэтил.

В предпочтительном варианте осуществления в формуле (I) Q выбирают из

где R³, R⁴, X и Z^A имеют указанные выше значения.

Предпочтительные изоксазолиновые соединения формулы (I) для применения по настоящему изобретению представляют собой:

Особенно предпочтительные изоксазолиновые соединения для применения по настоящему изобретению представляют собой

Более предпочтительное изоксазолиновое соединение для применения по настоящему изобретению имеет формулу (II),

в которой

R^1a, R^1b, R^1c независимо друг от друга представляют собой водород, Cl или CF₃, предпочтительно R^1a и R^1c представляют собой Cl или CF₃ и R^1b представляет собой водород,

Т представляет собой

где

Y представляет собой метил, бром, Cl, F, CN или C(S)NH₂, и

Q является таким, как описано выше.

В другом предпочтительном варианте осуществления в формуле (II) R³ представляет собой Н, и R⁴ представляет собой -СН₂-С(O)-NH-CH₂-CF₃, -СН₂-С(O)-NH-СН₂-СН₃, -СН₂-СН₂-CF₃ или -CH₂-CF₃.

В предпочтительном варианте осуществления изоксазолиновое соединение представляет собой 4-[5-(3,5-дихлофенил)-5-трифторметил-4,5-дигидроизоксазол-3-ил]-2-метил-N-[(2,2,2-трифтор-этилкарбамоил)-метил]-бензамид (CAS RN 864731-61-3 - флураланер USAN).

В другом варианте осуществления изоксазолиновое соединение представляет собой (Z)-4-[5-(3,5-дихлорфенил)-5-трифторметил-4,5-дигидроизоксазол-3-ил]-N-[(метоксиимино)метил]-2-метилбензамид (CAS RN 928789-76-8).

В другом варианте осуществления изоксазолиновое соединение представляет собой 4-[5-(3,5-дихлорфенил)-5-(трифторметил)-4H-изоксазол-3-ил]-2-метил-N-(тиетан-3-ил)бензамид (CAS RN 1164267-94-0), который был раскрыт в заявке WO 2009/0080250.

В другом варианте осуществления изоксазолиновое соединение представляет собой 1-[5'-[(5S)-5-(3,5-дихлор-4-фторфенил)-4,5-дигидро-5-(трифторметил)-3-изоксазолил]спиро[азетидин-3,1'(3'H)-изобензофуран]-1-ил]-2-(метилсульфонил)этанон - (Сароланер) (CAS RN 1398609-39-6).

В другом варианте осуществления изоксазолиновое соединение представляет собой 5-((5S)-4,5-дигидро-5-(3,4,5-трихлорфенил)-5-(трифторметил)-3-изоксазолил)-3-метил-N-(2-оксо-2-((2,2,2-трифторэтил)амино)этил)-2-тиофенкарбоксамид - (Лотиланер INN) (CAS RN 1369852-71-0).

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения изоксазолиновое соединение представляет собой 4-[5-[3-хлор-5-(трифторметил)фенил]-4,5-дигидро-5-(трифторметил)-3-изоксазолил]-N-[2-оксо-2-[(2,2,2-трифторэтил)амино]этил]-1-нафталинкарбоксамид (CAS RN 1093861-60-9, USAN - афоксоланер), который был раскрыт в заявке WO 2007/079162.

В другом варианте осуществления изоксазолиновое соединение представляет собой 5-[5-(3,5-дихлорфенил)-4,5-дигидро-5-(трифторметил)-3-изоксазолил]-3-метил-N-[2-оксо-2-[(2,2,2-трифторэтил)амино]этил]-2-тиофенкарбоксамид (CAS RN 1231754-09-8), который был раскрыт в заявке WO 2010/070068.

Изоксазолиновые соединения и их применение в качестве противопаразитарных средств описаны, например, в заявке на патент США US 2007/0066617, и международных патентных заявках WO 2005/085216, WO 2007/079162, WO 2009/002809, WO 2009/024541, WO 2009/003075, WO 2010/070068 и WO 2010/079077.

Способ (или применение) по настоящему изобретению включает применение рацемических смесей, например, равных количеств энантиомеров таких изоксазолиновых соединений, как описано выше. Кроме того, способ по настоящему изобретению включает в себя изоксазолиновые соединения, которые обогащены по сравнению с рацемической смесью энантиомером формулы 1. Также включены по существу чистые энантиомеры таких изоксазолиновых соединений.

При энантиомерном обогащении, один энантиомер присутствует в большем количестве, чем другой, и степень обогащения может быть определена выражением энантиомерного избытка ("ee"), который определяется как (2х-l)-100%, где х представляет собой мольную долю доминантного энантиомера в смеси (например, ee 20% соответствует соотношению энантиомеров 60:40). Предпочтительно композиции для применения по настоящему изобретению имеют, по меньшей мере, 50% энантиомерный избыток; более предпочтительно, по меньшей мере, 75% энантиомерный избыток; еще более предпочтительно, по меньшей мере, 90% энантиомерный избыток; и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 94% энантиомерный избыток более активного изомера. Особо следует отметить энантиомерно чистые варианты осуществления более активного изомера.

Изоксазолиновые соединения, описанные выше, могут содержать дополнительные хиральные центры. Способ по данному изобретению включает рацемические смеси, а также обогащенные и по существу чистые стереоконфигурации при этих дополнительных хиральных центрах.

Ссылка на изоксазолиновое соединение в данном описании включает энантиомеры, соли и сольваты, а также N-оксиды, которые могут быть получены обычными способами.

Ряд различных паразитических членистоногих может привести к инвазии домашних птиц, особенно кур-несушек. В случае если, по меньшей мере, один член паразитических членистоногих (взрослый паразит или один член стадии развития/личиночной стадии) непрерывно или временно присутствует на животном, то имеет место инвазия паразитическими членистоногими.

Паразитические членистоногие, как правило, являются эктопаразитами, которые живут на или в коже и перьях таких животных. В соответствии с их биологическим жизненным циклом они могут быть разделены на постоянных или временных паразитических членистоногих.

Постоянными паразитическими членистоногими являются те, которые проводят всю свою (взрослую) жизнь на их хозяине, домашней птице. Примерами важных постоянных паразитических членистоногих домашней птицы, особенно кур, являются северный куриный клещ (Ornithonyssus sylviarum), блоха присасывающаяся (Echidnophaga gallinacean), куриная блоха (Ceratophyllus gallinae), клещ изменчивый (Knemidokoptes Mutans) и куриные вши, например, пухоед двухщетинковый куриный (Menacanthus stramineus) и пухоед бледный куриный (Menopon gallinae).

Временные паразитические членистоногие питаются, но не постоянно живут на их хозяине, домашней птице, но проводят большую часть их (взрослой) жизни в окружении такого хозяина, домашних птиц. Примерами временных паразитических членистоногих домашних птиц являются персидские клещи (Argas persicus), красные птичьи клещи (Dermanyssus gallinae), тропический птичий клещ (Ornithonyssus Bursa) и клопы постельные (Cimex lectularius).

Контроль временных паразитов, как известно, особенно труден, потому что они могут присутствовать как на домашней птице, так и в окружающей среде.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что при введении через питьевую воду одного или нескольких изоксазолиновых соединений, как определено выше, домашним птицам, можно эффективно бороться как с постоянными паразитическими членистоногими, так и с временными паразитическими членистоногими домашних птиц, и как имеющиеся инвазии домашних птиц могут лечиться, так и может быть предотвращена повторная инвазия животных от окружающей среды.

Кроме того, введение через питьевую воду изоксазолиновых соединений, как определено выше, в особенности флураланера, эффективно уменьшает количество паразитических членистоногих в среде домашних птиц.

Кроме того, введение через питьевую воду изоксазолиновых соединений, как определено выше, в особенности флураланера, в дозе, которая является эффективной для лечения или профилактики инвазии членистоногими, может быть использовано на курах-несушках в период производства яиц, так как никакое изъятие яиц от животных из потребления человеком не потребуется.

Некоторые важные паразитические членистоногие, с которыми можно бороться с помощью способа и применения в соответствии с настоящим изобретением, описаны ниже более подробно:

Клещи: Клещи представляют собой паукообразные паразиты, которые заражают млекопитающих и домашних птиц. Примеры важных с коммерческой точки зрения клещей домашней птицы описаны ниже.

Обычные свободно живущие эктопаразитические клещи домашней птицы относятся к семейству Dermanyssidae и включают, например, куриного клеща, северного куриного клеща и тропического птичьего клеща. Они являются кровососами и могут быстро бегать на коже и перьях.

Красный птичий клещ (куриный клещ), также называемый куриным клещом, красным клещом или клещом насеста, встречается во всем мире и особенно остро вызывает опасения в более теплых частях умеренной зоны. Клещи остаются на хозяине только чтобы питаться, а затем переходят в соседние трещины и щели, чтобы отложить яйца. При благоприятных условиях, жизненный цикл паразита может быть завершен в течение 1 недели и большие популяции могут быть быстро установлены. Эти клещи могут не только приводить к анемии, тем самым серьезно снижая производство и увеличивая коэффициент конверсии корма, но на самом деле убивают птиц, особенно птенцов и наседок или кур-несушек. Несушки в производстве могут отказаться откладывать яйца в зараженных паразитами гнездах. Красный птичий клещ является временным паразитическим членистоногим.

Клещи встречаются как в клеточных батареях, так и в системах содержания на полу. Тем не менее, эта проблема является наиболее распространенной и широко распространенной в системе "обогащенных" клеток, которая была создана в Европе из-за проблем, касающихся защиты животных; в связи с наличием большого количества подходящих укрытий для клещей.

Северный куриный клещ (Omithonyssus sylviarum) является самым распространенным и наиболее важным постоянным паразитом домашней птицы во всех основных районах производства птицы Соединенных Штатов. Также признается в качестве серьезного вредителя по всей умеренной зоне других стран. Эти клещи сосут кровь, а полученные коросты могут нанести ущерб внешнему виду разделанной птицы. Еще большую озабоченность вызывает экономическое значение этого клеща для производства яиц от зараженных несушек, содержащихся в клетке. Северный куриный клещ является постоянным паразитическим членистоногим.

Тропический птичий клещ (Ornithonyssus Bursa) распространяется по всем более теплым регионам мира и, возможно, вытесняет северного куриного клеща в этих регионах. Тропический птичий клещ является временным паразитическим членистоногим.

Вши: Вши являются обычными внешними паразитами птиц. Они принадлежат к отряду Mallophaga, пухоедов. Более 40 видов было зарегистрировано у одомашненных птиц. Существует много видов птичьих вшей, но лишь немногие из них часто встречаются. Куриные вши представляют собой, например, пухоеда двухщетинкового куриного (Menacanthus stramineus) и пухоеда бледного куриного (Menopon gallinae). Вши будут переходить от одного вида птиц на другой, если эти хозяева находятся в тесном контакте. Вши не являются высоко патогенными для зрелых птиц, но инфицированные вшами цыплята могут умереть. Клинические данные свидетельствуют о том, что вши могут вызвать раздражение нервных окончаний, тем самым, препятствуя отдыху и сну. Вшивость часто сопровождает проявления плохого состояния здоровья, такого как внутренний паразитизм, инфекционные болезни и недоедания, а также плохие санитарные условия. Они являются постоянными паразитическими членистоногими.

Клопы: Клопы представляют собой другое семейство паразитических членистоногих. Семейство Cimicidae отряда Hemiptera включает в себя несколько кровососущих паразитов птиц. Наиболее распространенным из этих клопов является клоп постельный (Cimex lectularius), который нападает на людей, большинство других млекопитающих и птиц. Он наиболее распространен в районах с умеренным и субтропическим климатом. Птичники и голубятни могут стать обильно заселенными. Самым основным птичьим клопом является куриный клоп (Haematosiphon inodora). Они являются временными паразитическими членистоногими.

Блохи: Блохи представляют собой другое семейство паразитических членистоногих. Блохи (отряд Siphonaptera) являются паразитами в стадии взрослого насекомого, но свободно живущими в виде личинок. Блоха присасывающаяся (Echidnophaga gallinacea) чаще встречается в южной части Соединенных Штатов. Другим видом блох у кур является куриная блоха (Ceratophyllus gallinae). Раздражение и потеря крови может привести к серьезному повреждению птицы, особенно молодых птиц, у которых может произойти смерть. У птиц постарше снижается производство. Они являются постоянными паразитическими членистоногими.

Специалисту в данной области техники будет понятно, что популяция паразитических членистоногих может состоять из одного или более чем одного вида (паразитических) членистоногих. Эти паразитические членистоногие могут быть временными или постоянными видами паразитов, или это может быть смешанная инвазия временными и постоянными паразитами (такими, как, например, Dermanyssus gallinae и Ornithonyssus sylviarum).

Инвазию домашних птиц, особенно кур, особенно кур-несушек такими паразитическими членистоногими (паразитами) можно лечить или предотвратить путем введения эффективного количества изоксазолинового соединения, как описано в данной заявке, посредством введения через питьевую воду.

"Домашними птицами" являются птицы, которых содержат для откладки яиц или производства мяса, такие как куры, утки, гуси, индейки, фазаны и т.д. "Курами" являются куры (Gallus gallus domesticus).

Термин "курица-несушка" или "несушка" является общим термином для взрослых самок кур (Gallus Domesticus), которых в основном содержат для откладки яиц. Такие яйца обычно используются для потребления в качестве человеческой пищи. Термин "курица-несушка" в данной заявке включает в себя племенных птиц, которые содержатся для производства яиц, из которых в дальнейшем выведутся куры-несушки.

"Ремонтные цыплята", также известные как цыплята в постбрудерный период или курочки, являются цыплятами-самками в возрасте 12-17 недель. Термин "ремонтные" означает, что они будут заменять старых несушек, предназначенных для удаления в конце их цикла яйцекладки.

"Бройлеры" представляют одомашненных куровидных диких птиц, которых разводят и выводят специально для производства мяса.

Под "лечащий" или "лечить" или "лечение" подразумевается применение или введение соединения или композиции животному, которое имеет паразитарную инвазию для ликвидации паразита или уменьшения числа паразитов, заражающих животных.

Эффект может быть, например, овицидным, ларвицидным и/или представлять собой воздействие только на взрослых особей или их сочетание. Эффект может проявляться непосредственно, т.е. убивая паразитов либо сразу, либо после того, как прошло некоторое время, например, когда происходит линька, или разрушая их яйца, или косвенно, например, уменьшая количество откладываемых яиц и/или показатель выведения из яиц.

"Профилактика" или "предотвращение" означает, что новое заражение животных паразитами предотвращается путем убийства взрослых паразитов и любой стадии развития/личиночной стадии, которые способны заражать хозяина, перед заражением хозяина или, путем убийства или угнетения паразитов, когда они заражают животное, которое подвергали лечению изоксазолиновым соединением, как описано выше, или путем предотвращения возникновения потомства паразитов, например, уменьшая количество откладываемых яиц и/или показатель выведения из яиц.

Термин "эффективное количество" означает дозировку или количество изоксазолинового соединения, как описано выше, которое требуется для лечения или профилактики инвазий паразитическими членистоногими животных, то есть, чтобы частично снизить или уменьшить численность паразитов на животном, и/или ингибировать развитие паразитарной инфекции на животном в целом или частично.

Эта величина легко определяется путем наблюдения или обнаружения численности паразитов на животном до и после введения изоксазолинового соединения, как описано выше, через питьевую воду таким животным, например, число паразитов снижается после первого введения на 5% до приблизительно 100%, предпочтительно более чем на 50%, более чем на 70%, более чем на 90%, более чем на 95%, более чем на 99%.

Факторы, влияющие на эффективное количество, могут включать в себя, например, виды паразитов, подлежащих воздействию, и стадии развития паразитов, тип (например, вид и порода), возраст, размер, пол, диета, активность, и состояние зараженных животных; условия окружающей среды (температура, влажность), фармакологические аспекты, такие как активность, эффективность, фармакокинетические и токсикологические профили конкретного вводимого изоксазолинового соединения; и вводят ли изоксазолиновое соединение как часть комбинации активных ингредиентов. Таким образом, предпочтительное количество соединения в соответствии с настоящим изобретением может варьироваться.

Было обнаружено, что эффективное количество изоксазолинового соединения, как описано выше, можно вводить курам-несушкам, которое способно эффективно бороться с паразитическими членистоногими и в то же время никакое отбраковывание яиц не потребуется из-за остаточного количества.

Такое эффективное количество изоксазолинового соединения, главным образом флураланера, в одном из вариантов осуществления разделено на две дозировки, которые вводят с интервалом 7 или 14 дней. Предпочтительно дробную дозу (каждая из которых содержит, например, 50% от обычной дозы) вводят с интервалом 7 дней, например, 2 раза, дозу изоксазолинового соединения (например, флураланера) 0,5 мг/кг массы тела.

В одном варианте осуществления изоксазолиновое соединение, как описано выше, вводят с помощью введения через питьевую воду для лечения или профилактики клещевых инвазий кур с использованием схемы приема лекарственного средства, как описано в данной заявке. Коммерчески важными клещевыми инвазиями являются инвазии клещами Dermanyssus sp. (например, D. gallinae) и/или Ornithonyssus sp. Предпочтительным является лечение или профилактика инвазии Dermanyssus gallinae. Другим предпочтительным вариантом является лечение или профилактика инвазии Ornithonyssus sylviarum.

Эффективное количество изоксазолинового соединения, как описано выше, для лечения или профилактики инвазии паразитическими членистоногими, как правило, больше чем приблизительно 0,01 мг/кг (то есть миллиграмм соединения по настоящему изобретению на килограмм массы тела животных, подвергнутых лечению).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения эффективное количество составляет от приблизительно 0,01 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 0,05 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 0,1 до 10 мг/кг или от приблизительно 0,15 до 5 мг/кг массы тела, главным образом от 0,2 до 2 мг/кг массы тела.

В некоторых вариантах осуществления эффективное количество составляет от приблизительно 0,5 до приблизительно 1,5 мг/кг, от приблизительно 0,75 до приблизительно 1 м /кг.

В способе в соответствии с настоящим изобретением изоксазолиновое соединение вводят через питьевую воду. Для "введения через питьевую воду" эффективное количество изоксазолинового соединения, как описано выше, вводят в состав питьевой воды, которую предлагают животным, которые либо заражены паразитическими членистоногими (которые требуют лечения), или животным, которые не заражены, но подвергаются риску заражения паразитическими членистоногими (профилактика паразитических членистоногих). Предпочтительно изоксазолиновое соединение, как определено выше, вводят популяции, которая включает домашних птиц, которые заражены паразитическими членистоногими.

Введением эффективного количества изоксазолинового соединения, как описано выше, в состав питьевой воды, которая предлагается животному, образуется "лечебная питьевая вода". Такую лечебную питьевую воду вводят с помощью обычной системы подачи питьевой воды в птичнике.

Лечебная питьевая вода образуется путем добавления (или смешивания с) питьевой воды в (концентрированную) фармацевтическую композицию, как описано ниже, которая либо растворяется в питьевой воде, смешивается с питьевой водой, либо в результате получается суспензия изоксазолинового соединения в питьевой воде.

Изоксазолиновое соединение в лечебной воде должно быть равномерно распределено в течение периода лечения (как определено ниже), и позволяет вводить эффективное и точное количество соединения для всех животных, которые имеют доступ к такой лечебной воде. Предпочтительно, чтобы всех животных в помещении, например, птичнике, лечили одновременно, т.е. обеспечивается доступ к лечебной воде для всех домашних птиц в определенном производственном помещении.

Следовательно, данное изобретение также относится к фармацевтической композиции, предназначенной для применения в профилактике или лечении инвазий паразитическими членистоногими кур-несушек, которые производят яйца для потребления человеком, содержащей эффективное количество изоксазолинового соединения, как описано выше, и фармацевтически приемлемого носителя. Такая фармацевтическая композиция также упоминается как "концентрированная фармацевтическая композиция" или либо как "концентрированный раствор", либо как "концентрированная суспензия".

Изоксазолиновое соединение, как раскрыто выше, как правило, присутствует в таких концентрированных фармацевтических композициях в количестве от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 500 мг/мл. Предпочтительная фармацевтическая композиция по настоящему изобретению представляет собой концентрированный раствор. Такой концентрированный раствор содержит от 1,5 мг/мл и 100 мг/мл изоксазолинового соединения, главным образом флураланера.

Пример подходящего концентрированного раствора изоксазолинового соединения, главным образом флураланера, представляет собой фармацевтическую композицию, которая содержит изоксазолиновое соединение и фармацевтически приемлемый носитель, содержащий моноэтиловый эфир диэтиленгликоля и полисорбатное поверхностно-активное вещество.

Альтернативная концентрированная фармацевтическая композиция для применения по настоящему изобретению содержит изоксазолиновое соединение, описанное выше, в виде концентрированной суспензии, главным образом концентрированной водной суспензии. Такая концентрированная суспензия содержит от 100 мг/мл до 500 мг/мл изоксазолинового соединения, главным образом флураланера.

В одном варианте осуществления такая концентрированная суспензия представляет собой водную суспензию изоксазолинового соединения мокрого размола, главным образом флураланера, частиц в композиции, содержащих полисорбатное поверхностно-активное вещество. Кроме того, такая водная композиция суспензия может содержать консервант, такой как бензиловый спирт, и пеногасители, такие как симетикон.

Такие фармацевтические композиции могут быть получены методами, известными в данной области техники. Эти методы включают в себя, например, множество известных методов смешивания, растворения и эмульгирования.

Для приготовления лечебной питьевой воды на первой стадии получают концентрированную фармацевтическую композицию, содержащую изоксазолиновое соединение, как описано выше, и фармацевтически приемлемый носитель либо в виде раствора (мицеллярного), либо в виде суспензии. Такую концентрированную фармацевтическую композицию затем разбавляют (в одну или несколько стадий) с помощью воды с образованием лечебной питьевой воды.

Лечебную воду получают путем разбавления количества (объема) (концентрированной) фармацевтической композиции, которая содержит изоксазолиновое соединение, описанное выше, в дозе, которая обеспечивает (после разбавления) эффективное количество для всех животных, подвергнутых лечению объемом питьевой воды, который в значительной степени соответствует объему, который будет потреблен такими животными в течение периода лечения.

Такая лечебная питьевая вода затем предлагается животным для потребления через систему снабжения питьевой водой. Такие системы снабжения питьевой водой на коммерческих фермах могут представлять собой комплексные системы резервуаров, труб, витков, станочных поилок и чашек и/или ниппелей. Среднее помещение может содержать сотни метров труб с большим количеством витков и сотни индивидуальных чашек и/или ниппелей.

Обычной практикой является сделать так, чтобы был предоставлен доступ только к лечебной питьевой воде для животных в течение ограниченного периода времени (периода лечения), как правило, менее чем 24 часа, например, от 4-5 часов до 8 часов, в качестве единственного источника питьевой воды с целью обеспечения того, чтобы эффективное количество изоксазолинового соединения, как описано выше, потреблялось каждым животным в течение этого времени.

Лечебная питьевая вода может быть доступна в течение всего периода лечения одному животному; или в то же время группе животных или всем животным в одном помещении (доме) или на ферме.

Изоксазолиновое соединение, как описано выше, может быть доставлено через выбранную систему снабжения питьевой водой путем смешивания и разбавления концентрированной фармацевтической композиции, как описано выше, с питьевой водой в центральной емкости для воды или в отдельной емкости для лекарственных средств и хранения с образованием лечебной питьевой воды, которую предлагают животным для потребления.

В качестве альтернативы, концентрированную фармацевтическую композицию, как описано выше, вводят непрерывно в кольцевую систему для распределения питьевой воды с высоким или низким давлением с помощью дозирующего диспенсера или системы дозирующего насоса или системы дозатора лекарственных средств.

Системы дозирующего насоса задействуют насос, который передает отмеренные количества концентрированной композиции в трубы с водой при обычном разведении 1-5%. В рамках систем дозирующих насосов, можно использовать электронные системы дозирующих насосов, такие как KONTI-DOS от Buerkert или механические дозирующие насосы, такие как дозирующие насосы с гидравлическим двигателем DOSATRON®, с гидравлическим приводом DOSMATIC®, пропорциональные медикаторы.

Разнообразие полевых установок также касается самих систем водоснабжения: тупиковые системы или системы с замкнутым контуром различной длины с различными материалами труб (например, ПВХ, оцинкованное железо) и поилки, которые приспособлены для целевых животных, такие как колокольные поилки, ниппели.

Концентрация изоксазолинового соединения в лечебной питьевой воде зависит от эффективного количества, общей массы тела животных, подвергнутых лечению, потребления животным воды и периода лечения.

Медикатор использует, например, 10 мл концентрированной композиции и далее разбавляет с помощью воды примерно в отношении 1:200, чтобы получить лечебную питьевую воду, имеющую концентрацию изоксазолинового соединения, например, флураланера от 0,001 до приблизительно 1 мг/мл, наиболее предпочтительно от приблизительно 0,05 до приблизительно 0,2 мг/мл. В одном варианте осуществления лечебная вода имеет концентрацию изоксазолинового соединения от 0,002 до 0,02 мг/мл.

В одном конкретном варианте осуществления для конкретного изоксазолинового соединения флураланера, концентрация рассчитывается для обеспечения эффективного количества флураланера на массу тела (МТ) домашней птицы, подвергаемой лечению, в интервале от приблизительно 0,5 мг до приблизительно 2 мг флураланера на килограмм массы тела в день в объеме питьевой воды, обычно потребляемой домашними птицами, подвергаемыми лечению, в период лечения от 2 до 24 часов, предпочтительно от 4-5 до 8 часов.

Однократное введение эффективного количества изоксазолинового соединения, как описано выше, может быть достаточным для лечения паразитарной инвазии. Тем не менее, могут быть использованы несколько доз изоксазолинового соединения. Один период получения лечебной воды, как описано выше, доступной для домашних птиц (продолжительность, как правило, до одного дня) представляет собой однократное введение через питьевую воду.

Терапевтическая частота введения питьевой воды зависит от паразита, от которого лечат или проводят профилактику (и от его биологического жизненного цикла, который может зависеть от условий окружающей среды в птичнике, например, температуры), и производственного цикла хозяина - домашней птицы, подвергаемой лечению.

Следовательно, изоксазолиновое соединение, как описано выше, главным образом флураланер, вводят посредством введения через питьевую воду, по меньшей мере, один или более чем один раз, то есть 2 раза или 3 раза в одном производственном цикле домашних птиц. В случае кур-несушек это период яйцекладки. В случае других домашних птиц производственный цикл является периодом, когда группа домашних птиц остается в птичнике (например, период откорма в случае бройлеров). Предпочтительной является частота введения два раза в период яйцекладки. Продолжительность периода яйцекладки варьируется, но обычно составляет от одного года и двух лет.

Особенно предпочтительными являются два введения через питьевую воду курам-несушкам возраста от 16 до 72 недель.

Предпочтительным является введение двух доз изоксазолинового соединения, как описано выше, примерно с интервалом 7 дней или 14 дней (в зависимости от жизненного цикла паразита и производственного цикла животного-хозяина). Особенно предпочтительным является введение эффективного количества изоксазолинового соединения с интервалом 7 дней. В предпочтительном варианте осуществления 1 мг флураланера на кг массы тела разбивают на два введения по 0,5 мг/кг, которые вводят через питьевую воду с интервалом 7 дней.

При таком режиме введения приблизительно с интервалом 7 или 14 дней, более продолжительная эффективность против паразитических членистоногих может быть достигнута из-за различных стадий жизненного цикла паразитов, на которые можно воздействовать таким введением.

Конкретный интервал времени может варьироваться между различными паразитическими членистоногими и может зависеть от условий окружающей среды, которые влияют на жизненный цикл паразита.

С введением второй дозы может быть оказано влияние на паразитов, которые развились (после жизненного цикла паразитов) из не восприимчивых стадий, или стадий паразитов, на которые трудно оказывать влияние, например, те, что созрели из ювенильных стадий паразитов (таких как яйца, нимфы или куколки) в течение этого периода.

При таком режиме введения популяция паразитов может быть значительно снижена до уровня, который может нанести только минимальный вред животному и минимальные производственные потери в ходе этого производственного цикла, или даже больше, чем один производственный цикл. Одним из конкретных преимуществ такого режима введения является то, что низкая доза изоксазолинового соединения может быть введена таким образом, что остатки в яйцах могут быть сведены к минимуму с помощью такого режима введения при сохранении эффективной борьбы с паразитическими членистоногими.

Другим аспектом настоящего изобретения является способ борьбы с вредными членистоногими в среде домашних птиц, особенно кур, в котором изоксазолиновое соединение, как описано выше, вводят через питьевую воду домашней птице(птицам), особенно курам, особенно курам-несушкам, занимающим эту среду.

Домашняя птица, "занимающая эту среду", означает животное, которое постоянно или временно размещается в таком окружении, имеет доступ к такой среде либо ограниченно по времени (временно, такие как помещения для свободно гуляющих кур-несушек), либо постоянно (например, птичники для бройлеров).

Эффективное количество в контексте данного (немедицинского) способа контроля (паразитических) членистоногих в среде домашних птиц представляет собой количество изоксазолинового соединения, как описано выше, которое способно уменьшить количество членистоногих в среде животного, например, птичник или помещение, и/или подавить развитие членистоногих до значительного снижения численности популяции. Такое снижение численности членистоногих можно отслеживать с помощью специальных ловушек в открытых местах в среде домашней птицы.

Эта величина легко определяется путем наблюдения или детектирования численности паразитов в среде животного (например, с помощью ловушки) как до, так и после введения изоксазолинового соединения через питьевую воду одному или нескольким животным, занимающим такую среду, например, количество членистоногих уменьшается на 5% до 100%, в частности более чем на 50%, более чем на 75%, более чем на 90%. Предпочтительно количество членистоногих в среде снижается до уровня, который не позволяет возрасти популяции во время производственного цикла, которая приводит к производственным потерям в популяции домашней птицы, занимающей такую среду (производство яиц или производство мяса или гибели животных и т.д.).

Паразитические членистоногие, с которыми можно бороться с помощью такого способа, могут представлять собой как стадии постоянных паразитических членистоногих, так и стадии временных паразитических членистоногих, как описано выше, которые присутствуют в окружающей животных среде.

Стадии паразитических членистоногих могут представлять собой все стадии жизненного цикла, которые известны специалистам в данной области, то есть как стадии ювенильного развития/личиночные стадии, так и стадии взрослого насекомого.

В одном варианте осуществления стадии паразитических членистоногих, как описано выше, которые присутствуют в окружающей среде домашних птиц, особенно кур, предпочтительно кур-несушек, контролируются.

В одном варианте осуществления такие членистоногие представляют собой куриных паразитических членистоногих.

Введение эффективного количества изоксазолинового соединения с помощью введения через питьевую воду является пригодным для борьбы с членистоногими в среде размножения и откладки яиц домашних птиц и других видов птиц, которых содержат в течение производственного цикла, который превышает период приблизительно 8 недель. Особенно, если такие животные содержатся в промышленном масштабе, например, куры-несушки, выращивание курочек или ремонтных цыплят, племенные несушки, и выращивание бройлерных курочек и племенных птиц.

В общем, такой способ может быть также применен на других видах домашних птиц, таких как, например, индейки, гуси, утки, голуби, перепелки или фазаны.

В предпочтительном варианте такие паразитические членистоногие представляют собой клещей вида Dermanyssus и/или клещей вида Ornithonyssus, предпочтительно Dermanyssus gallinae.

Данный способ также направлен на борьбу с членистоногими в среде домашних птиц, особенно кур, цыплят, и особенно кур-несушек и цыплят-бройлеров, которые, как правило, не заражают животных непосредственно, но обеспечивают вред животным.

В одном варианте осуществления способ борьбы с чернотелками обеспечивается путем введения изоксазолинового соединения, как описано выше, домашней птице, занимающей среду, в которой присутствуют чернотелки. Чернотелка (Alphitobius diaperinus), является наиболее встречающимся жуком в помете из птицефабрик. Его также называют сумеречным или ночным жуком из-за его высокой активности в сумерки.

Чернотелки влияют на птиц и производителей домашней птицы, снижая производительность и продуктивность, повышая потенциал и передачу заболевания, и увеличивая затраты на здания и электроэнергию в связи с разрушениями объектов. Чернотелки являются всемирно распространенными насекомыми в птичниках.

Жуки живут в помете, где они питаются рассыпанным кормом для домашней птицы, навозом, а также мертвыми или умирающими птицами. Жуков можно найти по всему птичнику; яйца, личинки, куколки и взрослые находятся в навозе и почве. Борьба является трудной с помощью любого единого подхода, так как жуки используют множество ниш.

В одном варианте осуществления с членистоногими, особенно с чернотелками, борются в среде бройлерных цыплят или кур-несушек. Для такой борьбы нанесение изоксазолина распылением, как описано выше, может быть использовано вместо введения через питьевую воду или в дополнение к введению через питьевую воду.

В таком способе борьбы с (паразитическими) членистоногими в среде домашней птицы, в общем, те же изоксазолиновые соединения, схемы введения, лечебная питьевая вода, и фармацевтические композиции, которые описаны выше в данном описании для профилактики и лечения паразитарных членистоногих, могут быть применены.

Еще одним аспектом настоящего изобретения является способ борьбы с временными паразитическими членистоногими или членистоногими в среде домашних птиц, как это определено выше, включающий следующие стадии:

1. Оценка популяции временных паразитических членистоногих (таких как, например, Dermanyssus gallinae) в птичнике путем размещения ловушек в местах в среде домашних птиц, которые являются предпочтительными для таких временных паразитов и оценка числа паразитов, попавших в такие ловушки.

2. Определение на основании продолжительности производственного цикла и количества временных паразитов из ловушек и условий окружающей среды (например, температуры) "ожидаемого воздействия паразита" на домашних птиц, которые занимают такой птичник в течение всего производственного цикла.

3. Определить количество лекарственного средства, применяемого за производственный цикл, необходимое для борьбы с популяцией паразитических членистоногих, чтобы достичь такого уровня, который не вызывает производственных потерь у домашних птиц. Лечение состоит из двух введений изоксазолиновых соединений через питьевую воду, как описано выше, главным образом флураланера, с интервалом 7 дней.

4. Измерение успеха лечения путем оценки популяции членистоногих, как описано на стадии 1).

5. Если популяция членистоногих превышает определенный порог, скорректировать график лечения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Исследовали эффективность флураланера, который вводили перорально через лечебную питьевую воду, в борьбе с искусственно индуцированной инвазией красным птичьим клещом (Dermanyssus gallinae) кур-несушек. Группы A - D (n=6) лечили дозами по 2, 1 и 0,5 мг флураланера/кг массы тела единовременно или 1 мг флураланера/кг массы тела дробными дозами (по 0,5 мг/кг массы тела 2 раза).

Материалы и методы:

Потребление питьевой воды в каждой из групп измеряли за три дня до введения для расчета среднего суточного потребления воды. Лечебную воду готовили путем разбавления раствора флураланера (10 мг/мл), как показано в таблице ниже, до расчетной концентрации флураланера.

На Д0 (группа D дополнительно на Д7) куры в группах А-D получали флураланер через лечебную питьевую воду. Группа E получала неограниченно воду, не содержащую лекарственное средство.

Дозу для введения рассчитывали на основании средней массы тела каждой группы, подвергающейся лечению, полученной за один день до лечения (Д-1, Д 6). Концентрированный раствор флураланера разводили в питьевой воде для получения лечебной воды, готовой для потребления.

Лечебную питьевую воду готовили таким образом, что флураланер вводили в соответствии со следующим режимом дозирования:

Объем предложенной лечебной воды на группу на Д0 (группа D также на Д7) составлял примерно 50% от расчетного среднего ежедневного потребления воды, измеренного ранее в соответствующей группе, с тем, чтобы обеспечить потребление всей дозы.

После того, как вся лечебная вода потреблялась, другие 50% объема от среднего суточного потребления воды подавали в виде водопроводной воды в ту же поилку.

На 1-й день, 5-й день, 8-й день, 12 день, Д15, Д19 и Д22 четыре из шести кур в каждой группе заражали около 200 жизнеспособными клещами D. gallinae (некормленные нимфы и взрослые особи, которые голодали до заражения в течение 7 дней).

От каждой зараженной курицы приблизительно 25 налитых кровью клещей собирали и инкубировали в течение приблизительно 24 часов. Погибших, поврежденных и/или живых клещей подсчитывали визуально с помощью бинокуляра.

Клещей классифицировали как умерших, если не было определено никакого движения, или клещи лежали в дорсальном положении. Клещей классифицировали как поврежденных, если их движение было некоординированным.

Процент смертности клещей и подавления клещей рассчитывали для каждой группы, подвергнутой лечению, по сравнению с группой отрицательного контроля, не подвергнутой лечению.

Результаты:

Флураланер хорошо переносился курами.

% Смертности и % подавления красных клещей (Dermanyssus gallinae), оцененные приблизительно через 24 часа после заражения кур-несушек, получавших флураланер перорально через питьевую воду, приведены в таблицах 1 и 2. Быстрое начало действия продемонстрировали все вводимые дозы.

На каждой оцениваемой временной точке, клещи, наблюдаемые у контрольной группы, не подвергнутой лечению, являлись жизнеспособными и показывали их нормальное поведение.