Результат интеллектуальной деятельности: ВАКЦИНА ДЛЯ ЗАЩИТЫ ОТ HAEMOPHILUS PARASUIS СЕРОТИПА 4 У ПОРОСЯТ

Настоящее изобретение относится к вакцине для защиты поросят от Haemophilus parasuis серотипа 4.

Haemophilus parasuis является оппортунистической патогенной бактерией верхних дыхательных путей у свиней. Она является причиной болезни Глассера, состояния, которое приводит к широкому множеству клинических признаков, таких как артрит, перикардит, плеврит, полисерозит, менингит и внезапная смерть. Болезнь Глассера, главным образом, является проблемой, связанной с питомниками поросят. Однако, с предоставлением новых технологий здравоохранения, таких как изолированное раннее отлучение от матери (SEW) и появлением новых патогенов, таких как вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRS), заболеваемость болезнью Глассера возросла. Во-первых, проблемы Haemophilus parasuis усиливаются инфекцией PRRS. Далее, хотя технологии SEW устранили Haemophilus parasuis в определенных стадах, это стало очень серьезной проблемой для компаний-производителей племенного скота: их целью является улучшение состояние здоровья их животных и при этом повышается восприимчивость ремонтного поголовья к Haemophilus parasuis. Острая болезнь Глассера часто возникает, когда на инфицированную ферму помещают ремонтных молодых свиней или хряков с состоянием здоровья на высоком уровне. Таким образом, среди прочего, основную значимость приобрела иммунизация интактных животных перед помещением их на инфицированные фермы. В общем, обеспечение защиты против Haemophilus parasuis путем иммунизации стало в возрастающей степени важным. Существуют различные известные серотипы Haemophilus parasuis, каждый из которых можно идентифицировать с использованием способа иммунодиффузии (Kielstein et al., J. Clin. Microbiol. 30:862-865; 1992 и Rapp-Gabrielson et al., AJVR 53:659-664; 1992).

Combinord® представляет собой зарегистрированную вакцину (Intervet Denmark) для защиты (т.е. для по меньшей мере смягчения отрицательного эффекта расстройства) свиноматок и молодых свиней от Haemophilus parasuis серотипа 5. Также она пассивно защищает потомство от серотипа 5 при употреблении молозива. Однако она не зарегистрирована для защиты от Haemophilus parasuis серотипа 4. Действительно, как общеизвестно для вакцин, которые активно защищают от Haemophilus parasuis, не существует перекрестной защиты для серотипа 5 против серотипа 4. Это известно, помимо прочего, из публикации Rapp-Gabrielson et al. (Veterinary Medicine/January 1997/pp 83-90). Rapp-Gabrielson исследовал различия в вирулентности и иммуногенности штаммов Haemophilus parasuis, фокусируясь на защите и перекрестной защите от штаммов, представляющих собой преобладающие серотипы, а именно, серотипы 5, 4, 13, 14, 2 и 12, соответственно. Из этого исследования может быть сделано несколько выводов. Наиболее важно, что было показано, что Haemophilus parasuis серотипа 5 не обеспечивал защиты против заражения серотипом 4. Далее, было показано, что в серотипе 4 обеспечивалась перекрестная защита от гетерологичных штаммов. Таким образом, защита от штамма серотипа 4 предполагает защиту от других штаммов того же серотипа 4.

Указанные выше данные согласуются с данными Oliveira (Journal of Swine Health and Production, Volume 12, Number 3, May и June 2004, pp 123-128). В этом документе, было установлено, что в случае Haemophilus parasuis отсутствует перекрестная защита между различными серотипами. Недавно (21 марта 2006 года), Fort Dodge было выдано регистрационное свидетельство в Великобритании для вакцины от Haemophilus parasuis серотипов 4 и 5 (Suvaxyn M.hyo - Parasuis). Действительно, вакцина содержит как инактивированные Haemophilus parasuis серотипа 4, так и Haemophilus parasuis серотипа 5. Основанный в Великобритании RUMA (Responsible Use of Medicines in agriculture Alliance) опубликовал руководство по применению вакцин и вакцинации в свиноводстве в ноябре 2006 года. В отношении болезни Глассера, в этих руководствах указано, что коммерческие вакцины основаны на штаммах, для которых существует небольшой или отсутствует перекрестный иммунитет на другие штаммы.

Недостатком известных до настоящего времени вакцин является то, что для защиты от серотипов, которые являются наиболее преобладающими, т.е. серотипов 4 и 5, оба серотипа должны находиться в вакцине. Это является недостатком с точки зрения безопасности (большее количество присутствующих бактерий означает более высокое содержание LPS в вакцинах), но также с экономической точки зрения: наличие двух типов бактерий в вакцине предполагает боле высокую вероятность несрабатывания партии и более высокий риск контаминации. Таким образом, вероятность того, что партию сочтут негодной для продаж, возрастает. Таким образом, задачей настоящего изобретения является преодоление или по меньшей мере уменьшение недостатков современных вакцин против Haemophilus parasuis.

В этой связи было обнаружено, что можно использовать бактерии Haemophilus parasuis серотипа 5 для получения вакцины для введения беременной свиноматке или молодой свинье, для защиты поросенка от нарушения вследствие бактерий Haemophilus parasuis серотипа 4 при употреблении молозива указанной свиноматки или молодой свиньи после опороса. Заявитель показал, что когда свиноматку или молодую свинью вакцинируют вакциной на основе антигенов бактерий Haemophilus parasuis серотипа 5, поросенка защищают от нарушения вследствие бактерий Haemophilus parasuis серотипа 4, когда поросенок употребляет молозиво указанной свиноматки или молодой свиньи после опороса. С учетом уровня техники, где конкретно и постоянно указывается, что вакцина, содержащая антигены бактерий Haemophilus parasuis серотипа 5, не обеспечивают защиты от бактерий Haemophilus parasuis серотипа 4, этого нельзя было обоснованно ожидать. Следует отметить, что многие варианты осуществления применения в соответствии с настоящим изобретением были разработаны после того, как стало известно, что перекрестная защита от серотипа 4 может быть обеспечена иммунизацией свиноматки или молодой свиньи против Haemophilus parasuis серотипа 5. Например, бактерии могут быть помещены в вакцину как есть (либо живыми аттенуированными или убитыми), бактерии можно использовать для получения экстракта одного или нескольких иммуногенных компонентов бактерий для помещения в вакцину, или их можно использовать даже для получения рекомбинантной субъединицы бактерии для использования в качестве истинного антигена для получения самой вакцины.

В одном варианте осуществления вакцина содержит инактивированные клетки бактерий Haemophilus parasuis серотипа 5 и/или их производные. Оказалось, что вакцина, содержащая инактивированные клетки и/или их производные, обеспечивает достаточную защиту. Преимуществом неактивного компонента является безопасность. Бактерии Haemophilus parasuis серотипа 5 можно инактивировать любым известным в данной области способом, например, с использованием химических инактиваторов, таких как бета-пропиолактон, тимеросал или (другие средства-доноры ртути), формальдегид и т.д., с использованием физических способов, таких как нагревание, УФ-излучение, микроволны и т.д., с использованием биологических способов, таких как ферментные способы убивания бактерий, и любого другого способа, обычно используемого в данной области. При использовании таких способов, компоненты бактериальных клеток могут терять их связь с клетками. В частности, это может происходить в случае ассоциированных с клеточной мембраной компонентов, таких как сама наружная мембрана или белки наружной мембраны. В этом случае, нецелые убитые клетки, которые остаются, можно считать производными по настоящему изобретению. Также, компоненты, которые утрачивают их связь с клетками, можно считать производными по настоящему изобретению. Общеизвестно, в частности, для ассоциированных с наружной мембраной компонентов, что эти компоненты могут вызывать, в целом, эффективный иммунологический ответ конкретных животных на вакцину. По существу, эти компоненты можно использовать во многих случаях в качестве единственных компонентов вакцины. В последнем случае, можно использовать различные известные в данной области способы получения такого компонента в (по существу) чистой форме, например, получая его рекомбинантным способом, синтезом компонента или очисткой компонента из ферментационного бульона. Как правило, производное по настоящему изобретению представляет собой неживой компонент бактерий Haemophilus parasuis, отличный от инактивированных цельных клеток.

В другом варианте осуществления после первой вакцинации свиноматки или молодой свиньи следует вторая вакцинация, причем первую и вторую вакцинации проводят до опороса свиноматки или молодой свиньи. Эта схема вакцинации предоставлена для обеспечения оптимальной защиты поросят. В предпочтительном варианте осуществления первую вакцинацию проводят за 6-8 недель до ожидаемой даты опороса, а вторую вакинацию проводят за 2-4 недели до этой даты.

Также это изобретение относится к бактериям Haemophilus parasuis серотипа 5 для применения в изготовлении вакцины для введения беременной свиноматке или молодой свинье, для защиты поросят от нарушения вследствие бактерий Haemophilus parasuis серотипа 4 путем употребления молозива указанной свиноматки или молодой свиньи после опороса.

Изобретение пояснено с помощью представленных ниже примеров, которые относятся к предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения.

СХЕМА ЭКСПЕРИМЕНТА

Пять свиноматок (свиньи SPF, не имеющие H. parasuis) вакцинировали (внутримышечно, 2 мл) коммерчески доступной вакциной Porcilis Glässer DF за 6-8 недель до ожидаемой даты опороса и через 4 недели после него (также внутримышечно, 2 мл). Эта вакцина доступна от Intervet B.V., части Schering-Plough Corporation, Boxmeer, the Netherlands. Вакцина содержит инактивированные формальдегидом цельные клетки бактерий Haemophilus parasuis серотипа 5, и активный компонент суспендирован в адъюванте Diluvac Forte ("масло-в-воде"). Как правило, можно изготавливать любую другую вакцину, содержащую антигены H. parasuis серотипа 5 с использованием известных в данной области способов, которые, в сущности, включают смешивание пригодных антигенов H. parasuis (живые или инактивированные, целые клетки, экстракт, очищенная фракция или даже субъединица) с фармацевтически приемлемым носителем, например, жидким носителем, таким как (необязательно забуференная) вода, или твердым носителем, который обычно используют для получения лиофилизированных вакцин. Необязательно добавляют другие вещества, такие как адъюванты, стабилизаторы, модификаторы вязкости или другие компоненты, в зависимости от предполагаемого применения или требуемых свойств вакцины. В настоящем примере авторы настоящего изобретения использовали коммерчески доступную вакцину, как упоминалось в настоящем документе выше.

Пять невакцинированных свиноматок были включены в качестве отрицательных контролей. Приблизительно в возрасте 4 недель, 2 поросят от каждой свиноматки переносили в экспериментальную ферму и заражали H. parasuis. Патологоанатомическое исследование проводили через 10 суток после заражения или ранее, если животное погибало или если оно должно было быть умерщвлено вследствие его состояния здоровья. Образцы крови и молозива собирали от свиноматок примерно во время опороса.

Агентом для заражения является полевой изолят (живой штамм) Haemophilus parasuis серотипа 4. Изолят получают с использованием способа, известного из ссылки Oliveira, которая упоминается в настоящем документе выше. Культуру для заражения получали непосредственно перед заражением. Haemophilus parasuis культивировали на планшетах с шоколадным агаром с NAD при 37° в течение 24-72 часов. Бактерии собирали с помощью 2-5 мл среды CYS на планшет и их использовали для инокуляции среды CYS с NAD (2-5 мл на 100 мл среды). После этого проводили инкубацию при 37°C в течение ± 5 часов. Затем культуру центрифугировали в течение 10 мин при 2000 g и осадок ресуспендировали в 0,04 M PBS. Материалы для заражения хранили на льду до применения в пределах 2 часов. Поросят заражали Haemophilus parasuis аэрозольным способом в аэрозольном боксе. Это проводили в двух группах по 10 поросят в каждой (5 пассивно иммунизированных поросят и 5 контролей). Аэрозоль подавали с помощью устройства для распыления Devilbis Nebulizer. Общее количество культуры для заражения на группу из 10 свиней составляло 50 мл. Культура для заражения содержала ± 10⁸ к.о.е./мл. Поросят оставляли в аэрозольном боксе приблизительно на 30 минут.

После заражения каждые сутки оценивали ректальную температуру, общее состояние, подвижность, нервную систему и другие отклонения.

Система для оценки общего состояния была следующей:

0 = нормальное

1 = отсутствие аппетита

2 = отсутствие аппетита и подавленность

3 = подавленность и медленное вставание

4 = умирание.

Система для оценки подвижности была следующей:

0 = нормальное поведение

1 = набухшие, горячие или болезненные суставы

2 = прихрамывание на одну или несколько конечностей

3 = отказ поставить конечность на землю

4 = отказ стоять не в состоянии умирания.

Система для оценки нервной системы была следующей:

0 = нормальное поведение

1 = наклоненная голова

2 = потеря равновесия

4 = конвульсии.

Оценочная система для оценки других отклонений была следующей:

0 = нет отклонений

2 = небольшие отклонения

4 = тяжелые отклонения, требующие умерщвления.

Любым поросятам, которых умерщвляли, автоматически присваивали показатель 4 в категории клинического признака, который привел к гуманному решению об умерщвлении. Общий клинический показатель на поросенка представлял собой сумму ежесуточных клинических показателей от заражения до патологоанатомического исследования.

РЕЗУЛЬТАТЫ

У свиноматок было показано хорошее повышение сывороточных титров против H. parasuis после вакцинаций посредством Porcilis Glasser. До вакцинации сывороточные титры для всех свиноматок составляли менее 6,7 log₂, за исключением одной свиноматки в вакцинированной группе, которая имела сывороточный титр 8,4 log₂ перед первой вакцинацией. Сывороточные титры непосредственно до опороса варьировали от 8,6 до 12,6 log₂ для вакцинированных свиноматок, в то время как титры невакцинированных свиноматок оставались ниже предела детекции ELISA (<6,7 log₂). Титры в молозиве вакцинированных свиноматок варьировали от 9,0 до >13,7 log₂, а титры в молозиве невакцинированных свиноматок варьировали от <6,6 до 7,9 log₂. В возрасте 4 недель 2 поросят от каждой свиноматки заражали H. parasuis серотипа 4. Результаты представлены в таблице.

В таблице показано, что клинический показатель (т.е. среднее значение общего клинического показателя на поросенка для всех 10 свиней, т.е. суммы ежесуточных клинических показателей от заражения до патологоанатомического исследования) для 10 поросят, которые употребляли молозиво вакцинированных мышей, значительно меньше клинического показателя контрольных животных. То же самое справедливо для смертности.

В описанном исследовании наблюдали значимое снижение клинических признаков и смертности у пассивно иммунизированных поросят по сравнению с контрольными поросятами после заражения. Свиноматка, которая уже имела сывороточный титр против H. parasuis в начале эксперимента, хорошо отвечала на вакцинацию, поскольку сывороточный титр увеличился. Результаты после заражения двух поросят этой свиноматки были полностью сравнимы с другими поросятами в той же группе. Это указывает на то, что более высокий титр у свиноматки в начале исследования не оказал влияния на исход исследования. Для подтверждения, что эффект на исход исследования отсутствовал, статистическую обработку повторяли после исключения результатов 2 поросят этой свиноматки. Клинические признаки и смертность вновь значимо отличались от контрольной группы. В целом, можно заключить, что с использованием бактерий Haemophilus parasuis серотипа 5 для получения вакцины для введения беременной свиноматке или молодой свинье, можно защитить поросенка от нарушения вследствие бактерий Haemophilus parasuis серотипа 4 путем употребления молозива указанной свиноматки или молодой свиньи после опороса.