Результат интеллектуальной деятельности: Средство, обладающее противоопухолевым действием, для лечения онкологических заболеваний

Изобретение относится к новому средству, представляющему собой клатратный комплекс 3-(2–фенилэтил)-2-тиоксо-1,3 тиазолидин-4-она с β-циклодекстрином. Указанный комплекс может найти применение в медицине и фармакологии для лечения опухолевых заболеваний различной локализации.

В настоящее время химиотерапия онкологических заболеваний является одним из основных методов их лечения. Применяемые для лечения онкологических заболеваний современные лекарственные средства недостаточно эффективны и обладают рядом серьезных нежелательных явлений, обусловленных повреждающим действием на здоровые органы и ткани. В связи с этим актуальной остаётся проблема поиска малотоксичных лекарственных средств с высокой терапевтической активностью. При этом успехи в разработке новых противоопухолевых лекарственных средств связаны не только с синтезом новых химических соединений, но и в значительной степени, с улучшением свойств.

Известно, что у соединения 3-(2-фенилэтил)-2-тиоксо-4-тиазолидинон проявляется антипролиферативное действие на культуре клеток нейробластомы N2A /US 2003/0195238, C07D207/44, опубл. 16.10.2003/.

Известно также, что 3-(2 –фенилэтил)-2-тиоксо-1,3 тиазолидин-4-он обладает антипролиферативным и антиметастатическим действием в отношении опухолевых клеток эпидермоидной карциномой Lewis, имплантированных мышам /Патент на изобретение РФ2522449, C07D277/36 , опубл. 10.07.2014г./.

Имеющиеся данные по 3-(2 –фенилэтил)-2-тиоксо-1,3 тиазолидин-4-ону и β-циклодекстрину в качестве носителя позволяют создать эффективный и безопасный фармацевтический клатрартный комплекс и расширить арсенал средств для лечения онкологических заболеваний. Один из компонентов фармацевтической композиции 3-(2 –фенилэтил)-2-тиоксо-1,3 тиазолидин-4-он, являясь мультикиназным ингибитором [Ana Martinez SAR and 3D-QSAR Studies on Thiadiazolidinone Derivatives: Exploration of Structural Requirements for Glycogen Synthase Kinase 3 Inhibitors / Ana Martinez et al. // J. Med. Chem. 2005, 48, 7103-7112], нацелен как на подавление пролиферации опухолевых клеток и их метастазирования, так и на ингибирование роста сосудов опухоли. Пролиферация опухолевых клеток и васкуляризация (рост сосудов) опухоли – два важных процесса, которые обеспечивают рост злокачественной опухоли. При этом разработка новых клатратных комплексов активных фармацевтических субстанций с β-циклодекстрином позволить увеличить растворимость в воде, улучшить биодоступность и, следовательно, снизить их дозы. Отсутствие низкодозных высокоэффективных лекарственных препаратов является актуальной технической проблемой современной медицинской химии. Одним из перспективных в разработке подобных лекарственных форм направлением является механохимия. Создание новых лекарственных форм методом механохимической активации базируется на создании комплекса путем соединения носителей β-циклодекстрина с фармацевтически активной субстанцией 3-(2 –фенилэтил)-2-тиоксо-1,3 тиазолидин-4-оном.

Техническим результатом, достигаемым настоящим изобретением, является повышение эффективности, снижение применяемых доз.

Поставленная техническая проблема решается использованием клатратного комплекса, состоящего 3-(2 –фенилэтил)-2-тиоксо-1,3 тиазолидин-4-она с в-циклодекстрином, при следующем их содержании:

3-(2 –фенилэтил)-2-тиоксо-1,3 тиазолидин-4-он 10 масс.% и в-циклодекстрин остальное, в качестве средства, обладающего антипролиферативными и антиметастатическими свойствами.

В литературе отсутствует информация по применению клатратного комплекса, состоящего из 3-(2 –фенилэтил)-2-тиоксо-1,3 тиазолидин-4-она с β-циклодекстрином, с содержанием активной фармацевтической субстанцией 10 масс.% и β-циклодекстрина остальное, как антипролиферативного и антиметастатического средства для лечения онкологических заболеваний.

Новым в предлагаемом изобретении является то, в качестве средства подавляющего пролиферацию и метастазирование различных опухолевых клеток может применяться клатратный комплекс, состоящий из 3-(2 –фенилэтил)-2-тиоксо-1,3 тиазолидин-4-она с β-циклодекстрином с суммарным содержанием активной фармацевтической субстанцией 10 масс.% и β-циклодекстрина - остальное. Для специалиста эти свойства явным образом не вытекают из уровня техники.

Полученный клатратный комплекс стабилен при хранении и исследован на антипролиферативную и антиметастатическую эффективность.

Статистическая обработка результатов исследований была проведена с применением параметрических и непараметрических методов. Различия между группами будут считаться достоверными при p<0,05.

Комплекс - 3-(2 –фенилэтил)-2-тиоксо-1,3 тиазолидин-4-он в комплексе с β-циклодекстрином.

Фармацевтическая субстанция (ФС)- 3-(2 –фенилэтил)-2-тиоксо-1,3 тиазолидин-4-он

Сущность изобретения поясняется примерами конкретного выполнения.

Примеры. Противоопухолевая эффективность ФС 3-(2 –фенилэтил)-2-тиоксо-1,3 тиазолидин-4-она и ее клатратного комплекса с β-циклодекстрином оценивалась в экспериментах на мышах с имплантированными опухолями меланомой В16 и эпидермоидной карциномой Lewis и включала следующие исследования:

▶ антипролиферативное и антиметастатическое действие ФС и клатратного комплекса и препарата сравнения дакарбазина было проведено в эксперименте на мышах с имплантированными опухолевыми клетками меланомой В16;

▶ антипролиферативное и антиметастатическое действие ФС и клатратного комплекса проведено в эксперименте на мышах с имплантированными опухолевыми клетками эпидермоидной карциномой легкого Lewis;

▶ оценку антиметастатической активности ФС и клатратного комплекса на мышах с имплантированными опухолевыми клетками эпидермоидной карциномой легкого Lewis с удалением первичного опухолевого узла.

Критерии оценки эффективности исследуемых соединений

Антипролиферативная эффективность оценивалась по изменению объема новообразования. Объем новообразования (V мм3) рассчитывался по следующей формуле (1):

V = a×b×c (1),

где a, b и с – длина, ширина и высота опухолевого узла.

Сроки измерения: 10-11, 15-16 и 20-21 сутки после имплантации. В качестве дополнительных критериев использовались изменение массы тела животных, степень торможения роста опухоли, ингибирующий рост опухоли эффект по логарифму погибших клеток и эффект по увеличению средней продолжительности жизни.

Степень торможения роста опухоли определялся по показателю торможения роста опухоли (ТРО), вычисляемому по следующей формуле (2):

ТРО % = (Vконтроля – Vопыта) / Vконтроля × 100, (2),

где V – средний объем опухоли (мм3) в получавшей препараты и контрольной группе соответственно, на конкретный срок.

Для оценки ингибирующего роста опухоли эффекта по логарифму погибших клеток рассчитывалось их количество в подкожно привитой меланоме В16 и эпидермоидной карциномой легкого Lewis. Для этого в контрольной (t контроля) и леченных (t опыта) группах, определялось среднее время удвоения объема опухоли или достижения определенной величины. Разница между показателями «t контроля» и «t опыта» (время задержки роста опухоли в получавших препараты в группах) находилась в прямой связи с величиной пула погибших клеток к данному сроку. Рассчитывался lg числа погибших клеток (lg n) по следующей формуле (3):

Lg n = tk – to / 3,32Td, (3),

где tk – to – время задержки роста опухоли в опыте;

Td – время удвоения размеров опухоли, рассчитанное по экспоненциальной кривой роста опухоли в контроле;

3,32 – число удвоений, необходимое для увеличений lg n на один порядок.

По окончании экспериментов и гибели всех животных проводилась оценка эффекта по увеличению средней продолжительности их жизни. Для этого определялась средняя продолжительность жизни (СПЖ, дни) в группах и вычислялся показатель увеличения продолжительности жизни (УПЖ %) по следующей формуле (4):

УПЖ % = (СПЖопыта – СПЖконтроля) / СПЖконтроля × 100 (4)

Антиметастатическую эффективность оценивалась по количеству метастазов в легких, которое определялось через 9-10 и 21 сутки после начала введения исследуемых препаратов. Для этого у декапитированных под наркозом животных извлекались легкие и переносились в раствор Буэна. Подсчет метастазов проводился макроскопически. Интенсивность развития метастатического процесса оценивалась по частоте метастазирования опухолей (процент животных с метастазами по отношению к их общему количеству в группе), степени метастатического поражения легких по критериям разработанными Tarin и Price и индексу ингибирования метастазирования (ИИМ), который рассчитывался по формуле (5):

(5),

где

Аk и А – частота метастазирования в легкие у мышей контрольной группы и опытной;

Вk и В – среднее число метастазов в легких в контрольной и опытных группах.

Изучение антипролиферативных и антиметастатических свойств ФС 3-(2 –фенилэтил)-2-тиоксо-1,3 тиазолидин-4-она и ее клатратного комплекса с β-циклодекстрином, а также препарата сравнения дакарбазина было проведено в эксперименте на мышах с имплантированными опухолевыми клетками меланомой В16.

Эксперименты были проведены на 210 мышах-самцах и самках F1 CBA×C57Bl/6 (масса тела 18-22 г, возраст 2-2,5 месяца). Мыши были разделены на 7 групп по 30 животных обоего пола. Экспериментальные группы, дозы исследуемых соединений и количество животных указаны в таблице 1.

Таблица 1 – Экспериментальные группы, дозы исследуемых соединений и количество животных

В заднюю лапку под кожу животных была имплантирована суспензия клеток меланомы B-16, в количестве ~106 клеток (~0,2 см3). Клетки мышиной меланомы B-16, приспособленная к выращиванию в монослое (банк клеток ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина) культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением антибиотиков (пенициллин-стрептомицин по 100 ЕД/мл), 10 % эмбриональной телячьей (10 % по объему) сыворотки при температуре +37 ºC в атмосфере, содержащей 5% СО2. В качестве культуральной посуды использовали стерильные матрацы площадью 75 см3 (Corning, Nunc). Пересев культуры проводился 3 раза в неделю.

В качестве препарата сравнения был использован дакарбазин. Препарат сравнения вводили каждые два дня (всего 8 доз) в дозе 5,0 мг/кг. ФС и Комплекс в объеме 0,4 мл в 1 % крахмальном геле вводили в желудок металлическим зондом в течение 21 дня. Дакарбазин вводили внутрибрюшинно шприцем в виде раствора. Мышам контрольной группы с имплантированной опухолью внутрижелудочно вводили 1 % крахмальный гель в количестве 0,4 мл на животное.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что введение мышам с имплантированной опухолевыми клетками меланомой В16 ФС, Комплекса и препарата сравнения дакарбазина статистически значимо снижает у них объем опухоли по сравнению с контрольной группой (таблица 2) уже через 10 суток после имплантации опухоли. При этом показатель торможения роста опухоли в леченных группах составил 32-47 %. В последующие сутки после имплантации опухоли статистически значимые отличия от контроля были получены при введении ФС, Комплекса и дакарбазина во всех исследуемых дозах. При этом наилучшие результаты были достигнуты по снижению объема опухоли и эффективности торможения опухоли на протяжении наблюдаемого периода ее развития при введении Комплекса в дозах 10 и 20 мг/кг массы тела мышей. По сравнению с препаратом сравнения и ФС введение мышам Комплекса в дозах 10 и 20 мг/кг обеспечивало статистически значимое торможение роста опухоли.

Таблица 2 – Изменение объема опухоли (мм³) и ТРО,% у мышей в зависимости от дозы введения исследуемых препаратов

*P<0,00001-0,05 значений в опытных группах по сравнению с контролем;

** P<0,00001-0,05 значений в 7 группе по сравнению с контролем;

# P<0,00001-0,05 значений в 4 и 5 группах по сравнению с 7 группой;

& P<0,00001-0,05 значений в 4 и 5 группах по сравнению со 2 группой.

Средняя продолжительность жизни животных, которым вводили Комплекс во всех исследуемых дозах, увеличилась по сравнению с мышами контрольной группы, дакарбазина и ФС. Наиболее значимые данные по увеличению средней продолжительности жизни мышей были получены при введении Комплекса в дозах 10-40 мг/кг по сравнению с животными, которым вводили дакарбазин и ФС (таблица 3).

Таблица 3 – Ингибирующий рост опухоли эффект по логарифму погибших клеток и средняя продолжительность жизни мышей в зависимости от дозы введения исследуемых препаратов

^*P<0,00001-0,05 значений в опытных группах по сравнению с контролем;

^** P<0,00001-0,05 значений в 7 группе по сравнению с контролем;

^# P<0,00001-0,05 значений в 4 и 5 группах по сравнению с 7 группой.

^& P<0,00001-0,05 значений в 4 и 5 группах по сравнению со 2 группой.

Введение мышам-опухоленосителям дакарбазина, ФС и Комплекса во всех исследуемых дозах приводит к повышению lg n числа погибших клеток и эти значения выше 0,7, что может свидетельствовать об их высокой активности. Необходимо отметить, что наибольший ингибирующий рост опухоли эффект по логарифму погибших клеток достигался при введении мышам Комплекса в дозах 10- 40 мг/кг (таблица 3).

При анализе количества метастазов в легких было установлено статистически значимое их снижение по сравнению с контролем, дакарбазином и ФС для мышей-опухоленосителей исследуемых групп, которым вводили Комплекс во всех вводимых дозах (таблица 4). Также следует отметить, что наилучшие результаты были достигнуты, как и в случае со снижением объема опухоли при введении Комплекса в дозах 10 и 20 мг/кг.

Таблица 4 – Количество метастазов в легких в зависимости от дозы введения исследуемых препаратов

^*P<0,00001-0,05 значений в опытных группах по сравнению с контролем;

^** P<0,00001-0,05 значений в 7 группе по сравнению с контролем;

^# P<0,00001-0,05 значений в 4 и 5 группах по сравнению с 7 группой;

^& P<0,00001-0,05 значений в 4 и 5 группах по сравнению со 2 группой.

Исследование противоопухолевой активности ФС, Комплекса и препарата сравнения цисплатина было проведено в эксперименте на мышах с имплантированными опухолевыми клетками эпидермоидной карциномы легкого Lewis.

Эксперименты были проведены на 210 мышах-самцах и самках F₁ CBA×C57Bl/6 (масса тела 19-21 г, возраст 2-2,5 месяца). В заднюю лапку под кожу мышей была имплантирована суспензия клеток эпидермоидной карциномы Lewis, в количестве ~106 клеток (~ 0,2 см³). Клетки мышиной эпидермоидной карциномы Lewis были получены из банка клеток ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина.

Мыши были разделены на 7 групп по 30 животных обоего пола. Экспериментальные группы, дозы исследуемых соединений и количество животных указаны в таблице 5. В качестве препарата сравнения был использован цисплатин. ФС и Комплекс в объеме 0,4 мл в 1% крахмальном геле вводили в желудок металлическим зондом в течение 21 дня. Препарат сравнения цисплатин в дозе 3,5 мг/кг (на одно введение) вводили 3 раза в течение 21суток шприцем в виде раствора для инъекций в объеме 0,2 мл внутрибрюшинно. Мышам контрольной группы с имплантированной опухолью внутрижелудочно вводили 1 % крахмальный гель в количестве 0,4 мл на животное.

Таблица 5 – Экспериментальные группы, дозы исследуемых соединений и количество животных

Результаты проведенных исследований показывают, что введение цисплатина, ФС и Комплекса мышам с имплантированной опухолевыми клетками эпидермоидной карциномой Lewis статистически значимо снижает у них объем опухоли по сравнению животными контрольной группой (таблица 6) уже через 11 сутки после прививки опухоли. При этом показатель торможения роста опухоли в леченых группах составил 26-47 %. В последующие сутки после имплантации опухоли статистически значимые различия сохранялись при введении цисплатина, ФС и Комплекса во всех исследуемых дозах. При этом наилучшие результаты были достигнуты по снижению объема опухоли и эффективности торможения роста опухоли на протяжении наблюдаемого периода ее развития при введении Комплекса в дозах 10 и 20 мг/кг массы тела мышей. По сравнению с цисплатином и ФС введение мышам Комплекса в дозах 10 и 20 мг/кг обеспечивало статистически значимое торможение роста опухоли.

Таблица 6 – Изменение объема опухоли (мм³) и ТРО, % у мышей в зависимости от дозы введения исследуемых препаратов

^*P<0,00001-0,05 значений в опытных группах по сравнению с контролем;

^** P<0,00001-0,05 значений в 7 группе по сравнению с контролем;

^# P<0,00001-0,05 значений в 4 и 5 группах по сравнению с 7 группой;

^& P<0,00001-0,05 значений в 4 и 5 группах по сравнению со 2 группой.

Средняя продолжительность жизни животных, которым вводили цисплатин, ФС и Комплекс во всех исследуемых дозах увеличилась на 37-60 % по сравнению с мышами контрольной группы. Наиболее статистически значимые данные по увеличению средней продолжительности жизни мышей по сравнению с животными, которым вводили цисплатин и ФС получены при введении Комплекса в дозах 10-40 мг/кг (таблица 7).

Таблица 7 – Ингибирующий рост опухоли эффект по логарифму погибших клеток и средняя продолжительность жизни мышей в зависимости от дозы введения исследуемых препаратов

^*P<0,00001-0,05 значений в опытных группах по сравнению с контролем;

^** P<0,00001-0,05 значений в 7 группе по сравнению с контролем;

^# P<0,00001-0,05 значений в 4 и 5 группах по сравнению с 7 группой;

^& P<0,00001-0,05 значений в 4 и 5 группах по сравнению со 2 группой.

При анализе количества метастазов в легких было установлено статистически значимое их снижение по сравнению с контролем для мышей-опухоленосителей исследуемых групп, которым вводили цисплатин, ФС и Комплекс во всех вводимых дозах (таблица 8). При этом следует отметить, что наилучшие результаты были достигнуты, как и в случае со снижением объема опухоли, при введении Комплекса в дозах 10 и 20 мг/кг по сравнению с ФС и цисплатином.

Таблица 8 – Количество метастазов в легких в зависимости от дозы введения исследуемых препаратов

^*P<0,00001-0,05 значений в опытных группах по сравнению с контролем;

^** P<0,00001-0,05 значений в 7 группе по сравнению с контролем;

^# P<0,00001-0,05 значений в 4 и 5 группах по сравнению с 7 группой;

^& P<0,00001-0,05 значений в 4 и 5 группах по сравнению со 2 группой.

Оценка антиметастатической активности ФС и Комплекса было проведено на мышах с имплантированной эпидермоидной карциномой легкого Lewis с удалением первичного опухолевого узла.

Эксперименты были проведены на 180 мышах-самцах и самках F1 CBA×C57Bl/6 (масса тела 18-21 г, возраст 2-2,5 месяца).

В подушечку задней лапки мышей была имплантирована суспензия клеток эпидермоидной карциномы Lewis, в количестве ~106 клеток (~ 0,2 см3). Клетки мышиной эпидермоидной карциномы Lewis были получены из банка клеток ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина. На 15 сутки после перевивки клеток эпидермоидной карциномы Lewis было проведено под эфирным наркозом ампутирование лапок с опухолью по коленному суставу с наложением перетягивающего жгута у мышей. Операционная рана была обработана медицинским клеем.

Мыши были разделены на 6 групп по 30 животных обоего пола. Экспериментальные группы, дозы исследуемых соединений и количество животных указаны в таблице 9. ФС и Комплекс мышам вводили в желудок металлическим зондом в 1 % крахмальном геле в объеме 0,4 мл на мышь. Введение ФС и Комплекса начали за 1 час до операции и продолжали вводить ежедневно в течение 9 суток. Половина животных из каждой группы была оставлена для оценки эффективности терапии по увеличению средней продолжительности их жизни. Мышам контрольных групп с удалением и без удаления опухоли внутрижелудочно вводили 1 % крахмальный гель в количестве 0,4 мл на животное.

Таблица 9 – Экспериментальные группы, дозы исследуемых соединений и количество животных

Результаты проведенных исследований свидетельствуют, что введение Комплекса мышам с имплантированной эпидермоидной карциномой легкого Lewis с удалением первичного опухолевого узла обеспечило увеличение на 56-57 % по сравнению с мышами контрольной группы (с удаленным первичным опухолевым узлом) и ФС средней продолжительности жизни животных (таблица 10).

Таблица 10 – Средняя продолжительность жизни мышей в зависимости от дозы введения исследуемых препаратов

^*P<0,00001-0,05 значений в 5 и 6 группах по сравнению со 2 группой;

^# P<0,00001-0,05 значений во 2 группе по сравнению с 1 группой;

^¤ P<0,00001-0,05 значений в 5 и 6 группах по сравнению с 1 группой.

^& P<0,00001-0,05 значений в 5 и 6 группах по сравнению с 3 и 4 группами.

При анализе количества метастазов в легких было установлено статистически значимое их снижение по сравнению с животными контрольных групп (с удалением и без удаления опухоли) и ФС для мышей исследуемых групп с удаленным первичным опухолевым узлом, которым вводили Комплекс в дозах 10 и 20 мг/кг. Также следует отметить, что благоприятная картина по степени наименьшего метастатического поражения легких мышей выявлена в группах с удаленным первичным опухолевым узлом при введении Комплекса в дозах 10 и 20 мг/кг (таблица 11).

Таблица 11 – Количество метастазов в легких и их степень поражения в зависимости от дозы введения исследуемых препаратов

^*P<0,00001-0,05 значений в 5 и 6 группах по сравнению со 2 группой;

^# P<0,00001-0,05 значений во 2 группе по сравнению с 1 группой;

^¤ P<0,00001-0,05 значений в 5 и 6 группах по сравнению с 1 группой.

^& P<0,00001-0,05 значений в 5 и 6 группах по сравнению с 3 и 4 группами.

Введение Комплекса в дозах 10 и 20 мг/кг мышам с удаленными первичными опухолевыми узлами по сравнению с контрольными группами и ФС обеспечивало эффективное торможение метастатического процесса, об этом свидетельствуют данные, представленные в таблице 12.

Таблица 12 – Влияние ФС и Комплекса на интенсивность метастатического процесса у мышей

В результате проведенных исследований по противоопухолевому действию клатратного комплекса - 3-(2–фенилэтил)-2-тиоксо-1,3 тиазолидин-4-он с β-циклодекстрином установлено, что изучаемый Комплекс обладает выраженным антипролиферативным и антиместатическим действием в отношении опухолей как меланомы В16, так и эпидермоидной карциномой Lewis. Применение Комплекса мышам-опухоленосителям по сравнению с ФС обеспечивает эффективное торможение роста опухоли, увеличение средней продолжительности животных, снижение количества метастазов в легких.

Следует отметить, что у Комплекса выявлен достаточно высокий противометастатический эффект. Применение Комплекса мышам с удаленным первичным опухолевым узлом обеспечивало эффективное торможение метастатического процесса, увеличение средней продолжительности животных, снижение количества метастазов в легких.

Наилучшие результаты были достигнуты при введении Комплекса по сравнению с ФС в дозах 10-20 мг/кг. В проведенных экспериментах Комплекс по противоопухолевому действию превосходил препараты сравнения дакарбазин и цисплатин.

Предлагаемое изобретение обеспечивает повышение эффективности, снижение применяемых доз и расширение арсенала средств для лечения различных видов опухолевых заболеваний.