Результат интеллектуальной деятельности: Набор реагентов для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 методом прямой полимеразной цепной реакции в режиме реального времени

Изобретение относится к области молекулярной биологии, вирусологии и биотехнологии, молекулярно-генетической диагностике, к разработке средств выявления и идентификации возбудителей инфекционных заболеваний вирусной этиологии. Изобретение может быть использовано для выявления нуклеиновой кислоты (РНК) коронавируса SARS CoV-2 в биологических образцах, в частности, в назо- и орофарингеальных мазках пациентов с подозрением на респираторные инфекции, в том числе и на COVID-19.

COVID-19 является инфекционным заболеванием, вызванным новым коронавирусом SARS-CoV-2, который ранее не был обнаружен у людей [1]. Вирусная инфекция приводит к развитию респираторного гриппоподобного заболевания с такими симптомами, как кашель и лихорадка. В более тяжелых случаях может развиться пневмония. Средний инкубационный период COVID-19 составляет 6,5 дня, но может варьироваться от 3 до 21 дней.

По данным текущего эпидемиологического исследования, инкубационный период составляет от 1 до 14 дней, в основном от 3 до 7 дней. Основные проявления включают потерю обоняния, утомляемость, жар и сухой кашель. В некоторых случаях обнаруживаются заложенность носа, насморк, боль в горле, миалгия и диарея. На ранней стадии заболевания общее количество лейкоцитов в периферической крови в норме или снижено, а количество лимфоцитов уменьшено. У некоторых пациентов отмечалось повышение уровня ферментов печени, мышечных ферментов и миоглобина. СРБ и скорость оседания эритроцитов повышены у большинства пациентов, а прокальцитонин в то же время в норме. В тяжелых случаях количество D-димера увеличивается, а лимфоциты периферической крови постепенно уменьшаются.

Нуклеиновую кислоту нового коронавируса SARS-CoV-2 можно обнаружить в мазках из горла, мокроте, секретах нижних дыхательных путей, крови и других образцах. Выявление РНК вируса SARS-CoV-2 основано на постановке полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) с обратной транскрипцией.

Известны «Тест-система и способ для выявления РНК коронавируса SARS-COV-2, вируса-возбудителя коронавирусного заболевания 2019 COVID-19 методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (варианты)» [2]. Основным недостатком описанного способа является использование экстрагированной РНК в лабораторных исследованиях, что значительно удлиняет время исследования. Использование только одного гена-мишени также снижает чувствительность и воспроизводимость реакции.

Известен «Способ выявления кДНК коронавируса SARS-CoV-2 с помощью синтетических олигонуклеотидных праймеров в полимеразной цепной реакции» [3]. Вышеуказанный способ имеет ряд недостатков: такой способ имеет большой риск контаминации и получения ложноотрицательных результатов при использовании в рутинных исследованиях, обусловленных электрофоретической детекцией ПЦР продуктов в агарозном геле. Способ не позволяет контролировать эффективность прохождения ПЦР реакции из-за отсутствия внутреннего контрольного образца. Минусом является и длительность постановки реакции, так как реакция для исследования одного образца должна проходить в 4-х отдельных пробирках.

Известен патент «Набор олигонуклеотидов и способ мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для выявления РНК SARS-CoV-2» [4]. Этот разработанный способ имеет недостаток, заключающийся в проведении этапа экстракции нуклеиновой кислоты, что может привести к контаминации между образцами и увеличивает время детекции вирусной РНК.

Наиболее близким аналогом заявляемого изобретения является «Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса», состоящий из 6 пар синтетических олигонуклеотидов [2]. Однако, предлагаемый набор имеет ряд недостатков, заключающихся в том, что олигонуклеотиды являются специфичными только одному ORF участку генома коронавируса SARS-CoV-2 и амплифицируются без детектирующего зонда, а анализ ПЦР реакции происходит по температуре плавления ПЦР продукта с присутствием интеркалирующего красителя SYBR Green или методом агарозного гель-электрофореза. Таким образом, они не соответствуют критериям, рекомендованным ВОЗ для выявления РНК SARS-CoV-2 методом ПЦР-РВ.

Задачей настоящего изобретения является разработка быстрого, чувствительного теста на основе лизиса клеточной стенки, обратной транскрипции (ОТ) и амплификации в режиме реального времени (ПЦР-РВ) с применением эндогенного внутреннего контроля, где все реакции протекают в одной пробирке, выявляя два гена вируса, ген человека, который используется в качестве внутреннего контрольного образца.

Для решения указанной задачи мы предлагаем набор олигонуклеотидных праймеров и зондов, меченных флуоресцентным красителем для выявления двух генов РНК вируса SARS-Cov-2 и гена человека со следующей последовательностью:

Также предлагается тест-система для обнаружения РНК вируса SARS -CoV-2 методом проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени, включающая заявленный набор олигонуклеотидных праймеров и зондов, меченных флуоресцентным красителем.

Технический результат изобретения заключается в обнаружении РНК вируса SARS-COV-2 напрямую из назо- и орофарингеальных мазков без этапа экстракции: клетки человека, содержащие вирусный материал, подвергаются лизису на этапе обратной транскрипции и первоначальной денатурации в ходе процесса амплификации. ОТ-ПЦР смесь содержит ряд энхансеров ПЦР, которые позволяют нивелировать действие ингибиторов, содержащихся в мазках. Одновременный контроль качества отобранной исследуемой пробы, прохождение обратной транскипции и амплификации происходит за счет обнаружения гена человека (РНКазы Р), который амплифицируется одновременно в реакции вместе с вирусными генами ORFlab и N, детекция которых происходит по двум разным каналам.

Указанный технический результат изобретения достигается за счет:

- выбора олигонуклеотидных праймеров, имеющих специфические области гибридизации с открытой рамкой считывания OFR и геном нуклеопротеина N коронавируса SARS-CoV-2, геном Рибонуклеазы Р (РНКаза Р) человека, синтеза олигонуклеотидных праймеров, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в ПЦР с сигналом детекции олигонуклеотидных зондов,

- подбора реакционной смеси, содержащей энхансеры, позволяющие нуклеиновым кислотам сохранять свою целостность для ее накопления ферментами реакции,

- подобранных зондов и праймеров, которые формируют короткие участки амплифицированных генов, что позволяет получить хорошую чувствительность и воспроизводимость прямой ПЦР.

Краткое описание поясняющих материалов

Табл. 1 - Состав заявляемых нуклеотидов;

Табл.2 - состав набора реагентов (тест-системы);

Табл.3 - результаты чувствительности в геномных эквивалентах;

Фиг. 1, 2 - результаты применения экстрагированной РНК для амплификации и мазков, имеющих совмещенный лизис с обратной транскрипцией и амплификацией;

Табл.4 - интерпретация результатов амплификации.

Табл.5 - интерпретация результатов амплификации исследуемых образцов.

Осуществление изобретения

В рамках данной разработки сконструированы синтетические олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентные зонды с оригинальной нуклеотидной последовательностью, специфичной двум вирусным (ORFlab и N) генам SARS-CoV-2, специфичными к гену человека (РНКазы Р), который используется в тест-системе как эндогенный контроль и разработан надежный способ прямой полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для выявления РНК SARS-CoV-2 имея высокую чувствительность для прямой ПЦР, заключающуюся в выявлении 1×10 ГЭ/мл.

Олигонуклеотиды отжигаются специфично на матрицах ORF, N короновируса SARS-COV-2 с образованием продукта около 200 п. н. и РНКаза Р гене человека с образованием продукта около 150 п. н.

Состав заявляемых олигонуклеотидов представлен в таблице 1

Состав заявляемого нами набора реагентов (тест-системы) (ПЦР-смеси), представлен в таблице 2.

Полученные биологические образцы (мазки из носо- и ротоглотки) помещали в разработанную нами тест-систему в соотношении: 20 мкл тест-системы (см. Табл.2) и 5 мкл мазков и проводили прямую ПЦР. При постановке реакций использовались амплификаторы для ПЦР-РВ зарегистрированных в России моделей Applied Biosystems "QuantStudio 5" и Bio-Rad "CFX96". Сигнал от вирусной последовательности регистрировался по каналу HEX/VIC, от референсной человеческой - по каналу FAM.

Интерпретация результатов анализа осуществлялась в соответствии с таблицей 4.

В качестве отрицательных контрольных образцов анализа вносят деионизованную воду, свободную от нуклеаз. Положительным сигналом считают наличие кривой накопления флуоресценции характерной сигмовидной формы и ее пересечение с установленной в соответствии с принципами постановки ПЦР-РВ, единообразно для всех образцов на соответствующем уровне пороговой линией. Отрицательным сигналом считают отсутствие такой кривой.

В случае сомнительного или не валидного результата требуется повторно провести ПЦР-исследование соответствующего образца, начиная с этапа внесения образцов клинического материала в ПЦР-смесь или со стадии забора материала у пациента.

Повторный сомнительный результат считается отрицательным и не требует перестановки. Повторный не валидный результат свидетельствует о некачественном отборе клинического материала и требует перепостановки, начиная с этапа отбора клинического материала.

Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующим примерами.

Пример 1. Оценка специфичности рассчитанных олигонуклеотидов

Аналитическая специфичность набора реагентов была определена посредством исследования образцов нуклеиновых кислот возбудителей респираторных инфекций: вирусы гриппа А и В, парагрипп, аденовирусная инфекция, респираторно-синцитиальная инфекция, метапневмовирусная инфекция, риновирусная инфекция и коронавирусная инфекция человека (MERS-CoV, HKU1, 229Е, ОС43, NL63, SARS-CoV), Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenza type B, Legionella pneumophila и на штаммах из коллекции АТСС (American Type Culture Collection, США): Human Respiratory Syncytial Virus, Strain A-2 (ATCC® VR-1540™), Human Parainfluenza Virus 1, Strain C35 (ATCC® VR-94™), Human Parainfluenza Virus 2, Strain Greer (ATCC® VR-92™), Human Coronavirus, Strain OC43 (ATCC® VR-1558™), Human Coronavirus, Strain 229E (ATCC® VR-740™), Human Coxsackievirus B1. Перекрестных реакций не выявлено.

Пример 2 Оценка чувствительности и воспроизводимости результатов тест-системы для мазков из носоглотки и ротоглотки.

Пробы отбирались от 63 пациентов с COVID-19 и 27 здоровых людей. Все образцы предварительно анализированы с использованием набора реагентов «АмплиСенс® COVID-19-FL» согласно инструкции производителя.

Образцы предварительно были инактивированы в режиме 70°С в течение 5 мин. Амплификация проходила в 20 мкл тест-системы с добавлением 5 мкл мазка и включала следующие этапы:

В итоге выявлено, что диагностическая чувствительность набора реагентов составляет 99,64, воспроизводимость - 100%.

Пример 3 Оценка чувствительности и воспроизводимости результатов тест-системы в экспериментальных условиях

Определяли с помощью искусственно созданной конструкции (КОЧ), представляющей собой синтетическую РНК коронавируса SARS-COV-2 встроенную в вектор-плазмиду E.Coli.

Определение аналитической чувствительности проводили путем разведений КОЧ в мазках носоглотки, выполненных пятикратным шагом. Готовили пробы, содержащие различные количества геномных эквивалентов (ГЭ). Результаты чувствительности в ГЭ представлены в таблице 3.

Результаты расчетов, представленные в таблице 3, позволяют сделать вывод, что использование рассчитанных нами олигонуклеотидных праймеров и зондов в прямой ОТ-ПЦР-РВ позволяет выявлять РНК вируса SARS-CoV-2 в мазках, с концентрацией не менее 1,0x10 ГЭ/мл. Суммарное количество положительных определений для концентрации 1,0x10 ГЭ/мл составляет 20 из 20, что соответствует воспроизводимости не менее 95% [Генес B.C. Некоторые простые методы кибернетической обработки данных диагностических и физиологических исследований. - М.: Наука, 1967. - 208 с].

Таким образом, значение аналитической чувствительности составляет 1,×⋅10 ГЭ/мл с воспроизводимостью не менее 95%.

Пример 4 Обнаружение РНК вируса SARS-CoV-2 в мазках без проведения предварительного лизиса клетки для извлечения из нее вирусной и человеческой РНК

Оценку работоспособности тест-системы методом прямой ПЦР проводили на назо- и орофарингеальных мазках в сравнении с использованием в ПЦР экстрагированной РНК из клетки.

Из части материала мазков проводили выделение РНК из клеток коммерческим набором «Рибо Преп» ИЛС и амплификацию выделенной РНК осуществляли на наборе «АмплиСенс® COVID-19-FL» согласно инструкциям по применению. Оставшуюся часть мазков применяли для постановки в прямой ПЦР разработанной нами тест-системе по прописи: 20 мкл ПЦР-смеси (см. Табл.2) и 5 мкл мазков. При постановке реакций использовались амплификаторы для ПЦР-РВ зарегистрированных в России моделей Applied Biosystems "QuantStudio 5" и Bio-Rad "CFX96"

Проверено таким образом было 96 мазков от пациентов с подтвержденным диагнозом COVID-19.

Сигнал от вирусной последовательности регистрировался по каналу HEX/VIC, от референсной человеческой - по каналу FAM.

Данные показали идентичность результатов применения экстрагированной РНК для амплификации и мазков, имеющих совмещенный лизис с обратной транскрипцией и амплификацией. Данные приведены на фиг.1 и фиг.2. На фигуре 1 представлены данные детекции с прибора, которые демонстрируют выявление всех положительных при прохождении всех этапов реакции в одной пробирке. На фиг 2 представлены данные детекции с прибора, которые демонстрируют выявление всех положительных проб с отдельным этапом экстракции РНК и последующей амплификации. Таким образом, результаты выявления РНК коронавируса при прохождении всех реакции в одной пробирке идентичны классическому методу.

Время обнаружения коронавирусной РНК с этапов выделения - 3-4 часа, а прямым методом ПЦР - 1 час 20 мин.

Таким образом, было подтверждено использование метода прямой ПЦР в системе диагностики коронавируса SARS-COV-2.

Пример 5 Учет и интерпретация результатов амплификации.

В качестве биоматериала использовали мазки из носо- и ротоглотки пациентов с подозрением на инфицирование SARS-COV-2. Результаты диагностики наличия коронавируса SARS-COV-2 представлены в табл.5.

Таким образом, приведенные примеры подтверждают выполнение поставленной задачи, а именно создание быстрого и надежного теста на вирус SARS-CoV-2 на основе метода прямой ПЦР где все реакции протекают в одной пробирке.

Список литературы

1. The latest 2019 novel coronavirus outbreak in Wuhan China / D.S. Hu, E.I. Azhar, T.A. Madani et al. // Intern. J. Infect. Dis. - 2020. - Vol.91. - P. 264-266].

2. Патент RU 2731390 «Тест-система и способ для выявления РНК коронавируса SARS-COV-2, вируса-возбудителя коронавирусного заболевания 2019 COVID-19 методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (варианты)», C12Q 1/6806, опубликован 2020.09.02 г.

3. Патент RU 2720713 «Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса», C12Q 1/6806, опубликован 12.05.2020 г.

4. Патент RU 2727054 «Способ выявления кДНК коронавируса SARS-CoV-2 с помощью синтетических олигонуклеотидных праймеров в полимеразной цепной реакции», C12Q 1/6806, опубликован 17.07.2020 г.

5. Патент RU 2752902 «Набор олигонуклеотидов и способ мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для выявления РНК SARS-CoV-2», C12Q 1/6806. Опубликован 11.08.2021

Выявлено одинаковое кол-во положительных проб.