Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ РЕГИСТРАЦИИ СПЕКТРОВ ГИГАНТСКОГО КОМБИНАЦИОННОГО РАССЕЯНИЯ СВЕТА И ПРОТОЧНАЯ ЯЧЕЙКА ДЛЯ ЕГО РЕАЛИЗАЦИИ

Изобретение относится к области физических исследований вещества методами оптической спектроскопии для получения спектров гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) света. Изобретение позволяет автоматизировать процесс получения спектров ГКР света при исследовании органических молекул в жидкой фазе, а также повысить чувствительность данного метода анализа.

Методы спектроскопии ГКР света широко применяются для анализа и детекции органических и неорганических молекул, однако до сих пор не существует эффективного высокопроизводительного и высокочувствительного способа получения спектров ГКР биологических молекул. Несмотря на то, что давно существуют подходы к объединению микрофлюидных технологий и спектроскопии ГКР света, нерешенными остаются задачи повышения чувствительности данных методик до уровня детекции отдельных молекул аналита и создания универсального ГКР-активного субстрата, который можно было бы использовать без регенерации в потоковых исследованиях, что позволило бы автоматизировать процесс и повысить пропускную способность данных методов анализа. Также при исследовании биологических молекул, находящихся в жидкой фазе, необходимо обеспечить их сближение с поверхностью ГКР-активного субстрата на нанометровые расстояния и зафиксировать их положение на поверхности ГКР-активного субстрата на время регистрации спектра ГКР света, что необходимо для повышения чувствительности.

Известен способ детекции и характеризации аналитов в жидкости с помощью ГКР света, а также устройство для реализации предлагаемого способа, описанные в патенте [1]. В известном способе, для пространственного сближения молекул исследуемого образца и поверхности ГКР-активного субстрата используется гидродинамическая фокусировка. Устройство для реализации известного способа содержит проточную ячейку, одна из сторон которой выполнена прозрачной, чтобы можно было проводить возбуждение и регистрацию спектров ГКР света. В эту проточную ячейку через узкое отверстие с разной скоростью подаются буфер с образцом и буферная жидкость для фокусировки молекул исследуемого образца вблизи поверхности ГКР-активного субстрата, который представляет собой тонкий слой серебра, нанесенный на одну из внутренних сторон проточной ячейки. К недостаткам известного способа и устройства для его реализации стоит отнести то, что молекулы образца никак не фиксируются на поверхности ГКР-активного субстрата, а лишь сближаются с ним, за счет гидродинамической фокусировки. Этого, во-первых, недостаточно для длительного накопления сигнала (порядка секунд), а во-вторых, не позволяет добиться оптимального расстояния между поверхностью ГКР-активного субстрата и молекулами исследуемого образца, что в результате приводит к снижению чувствительности детекции и ухудшению качества получаемых спектров ГКР молекул образца.

Известен способ количественной детекции различных молекул образца, описанный в патенте [2]. В известном способе применяют ГКР-активные метки двух типов, метки первого типа способны связывать заданные молекулы исследуемого образца и не обладают магнитными свойствами, а ГКР-активные метки второго типа обладают магнитными свойствами, и также способны связывать заданные молекулы образца, не препятствуя связыванию меток первого типа. По соотношению меток двух типов проводится количественная детекция различных заданных молекул образца. К недостаткам известного способа относится то, что он, во-первых, подходит только для детекции заранее определенных молекул образца, а во-вторых, не позволяет получать спектры ГКР молекул образца, а только позволяет детектировать факт их наличия или отсутствия в образце.

Известен способ детекции молекул образца с помощью микрофлюидного чипа, описанный в патенте [3]. Известный чип представляет собой две пластины, на поверхность одной пластины, изготовленной из стекла, нанесены биологические распознающие молекулы, способные связывать заданные молекулы исследуемого образца, а на поверхность второй нанесены микроканалы, которые пересекают зоны нанесения биологических распознающих молекул на стеклянной пластине. Для количественной детекции молекул образца его прокачивают через чип, а затем прокачивают ГКР-активные метки, которые способны специфически связывать заданные молекулы исследуемого образца. Затем проводится регистрация спектров ГКР света и оценка количества заданных молекул исследуемого образца по интенсивности сигнала от ГКР-активных меток. К недостаткам известного изобретения стоит отнести то, что оно подходит только для детекции изначально определенных молекул образца, не позволяет исследовать спектры ГКР света различных молекул образца, а также не позволяет проводить повторное использование чипа.

Ближайшего аналога, предлагаемому нами изобретению для регистрации спектров гигантского комбинационного рассеяния света обнаружено не было.

Техническим результатом предлагаемого нами изобретения является автоматизация процесса проведения исследований методами спектроскопии ГКР света, за счет возможности непрерывного анализа различных образцов и регистрации спектров ГКР света различных молекул образца, а также увеличение чувствительности за счет усиления величины детектируемого сигнала комбинационного рассеяния света.

Технический результат достигается тем, что предложен способ регистрации спектров гигантского комбинационного рассеяния света, включающий конъюгирование молекул исследуемого образца с магнитными наночастицами, смешивание полученных конъюгатов молекул образца с буфером для проведения анализа, прокачивание конъюгатов молекул образца в буфере через проточную ячейку для снятия спектров комбинационного рассеяния, фиксация положения конъюгатов молекул образца в ячейке с помощью магнитного поля, дальнейшее прокачивание буфера для проведения анализа, регистрация спектров гигантского комбинационного рассеяния света в области фиксации конъюгатов молекул образца, отключение магнитного поля, прокачивание буфера для проведения анализа через проточную ячейку для подачи следующей порции конъюгатов молекул образца или последующего образца.

Существует частный случай, когда для конъюгирования молекул образца с магнитными наночастицами, молекулы образца метят аффинными метками, например молекулами стрептавидина или биотина, причем мечение проводят или по определенным химическим группам в составе молекулы образца, или неспецифическим образом.

Существует частный случай, в котором для конъюгирования молекул образца с магнитными наночастицами на поверхности последних иммобилизуют аффинные метки, например биотин, стрептавидин, молекулы, содержащие тиольные группы, или молекулы кислот, для удержания ионов двухвалентных переходных металлов.

Существует частный случай, когда аффинные метки выбирают так, чтобы расстояние между конъюгированными молекулами образца и магнитными наночастицами составляло от 0,01 до 1000 нм.

Существует частный случай, в котором буфер для проведения анализа содержит наноразмерные частицы металлов, изготовленные из золота, серебра, алюминия или их сплавов, их размер составляет от 1 до 50 нм, а форма представлена наностержнями, нанокубами, наносферами, нанотреугольниками, нанопластинами, нанозвездами или их комбинацией.

Также существует частный случай, когда скорость прокачивания образца через проточную ячейку варьируют в диапазоне от 0,001 мкл/мин до 100 000 мкл/мин.

Для реализации способа предложена проточная ячейка, состоящая из твердой подложки, не обладающей магнитными свойствами, содержащей проточный канал, на нижнюю поверхность которого нанесен слой, представляющий собой ГКР-активный субстрат, при этом под каналом прямоугольной формы на нижней поверхности подложки расположен один или более электромагнитов, а верхнюю часть проточной ячейки ограничивает металлизированная поверхность, причем расстояние между слоем ГКР-активного субстрата и металлизированной поверхностью составляет от 1 до 900 000 нм.

Существует частный случай, в котором, твердая подложка изготовлена из кремния, стекла, золота, серебра, платины или их сплавов.

Существует частный случай, когда в качестве ГКР-активного субстрата применен слой серебра, золота, меди, платины, алюминия, галлия, индия, щелочного металла или их сплавов, толщиной от 1 до 100 000 нм, содержащий на своей поверхности периодические, упорядоченные или неупорядоченные наноструктуры размером от 1 до 500 нм.

Существует частный случай, когда металлизированная поверхность представляет собой пластину из кремния или стекла, на нижнюю часть которой нанесен слой алюминия, золота, серебра, индия, галлия, платины или щелочного металла толщиной от 1 до 200 нм.

Существует частный случай, в котором металлизированная поверхность представляет собой гибкий полимерный слой, в состав которого включены наночастицы металлов размером от 0,1 до 100 нм, или водорастворимые соединения металлов, например, AgNO₃ или [Ag(NH₃)₂]OH, которые в процессе отвердения полимера переводят в нерастворимую форму.

Конъюгация молекул исследуемого образца с магнитными наночастицами позволяет фиксировать положение исследуемых молекул образца на поверхности ГКР-активного субстрата, что позволяет, во-первых, регулировать время, необходимое для накопления сигнала и снятия спектра ГКР, а во-вторых, обеспечить простой процесс фиксации различных молекул образца. Это позволяет использовать проточную ячейку несколько раз для фиксации различных молекул образца на поверхности ГКР-активного субстрата для анализа различных образцов, без необходимости регенерации или промывки. Пространственная ориентация молекул образца, необходимая для улучшения воспроизводимости результатов и увеличения детектируемого сигнала ГКР света, достигается за счет того, что при фиксации магнитных наночастиц магнитным полем и воздействии потока жидкости, внутри проточной ячейки происходит упорядочивание молекул образца. При этом степень упорядоченности можно регулировать тремя параметрами: скоростью потока жидкости через проточную ячейку; длиной линкера между магнитной наночастицей и исследуемой молекулой образца; положением аффинной метки на поверхности молекулы образца, используемой для конъюгации с магнитными наночастицами. Конъюгированные специфичным образом молекулы образца упорядочиваются в потоке жидкости, что позволяет достигать максимальных значений дипольного момента ансамбля молекул образца. В этом случае увеличивается сила связи энергетических состояний молекул образца с локализованным электромагнитным полем резонаторной ячейки, образованной поверхностью ГКР-активного субстрата и металлизированной поверхностью. Это приводит как к увеличению сигнала ГКР света от молекул образца, так и к снижению собственной флуоресценции молекул образца и компонентов буфера, затрудняющих проведение ГКР-анализа. При этом добавление в буфер для проведения анализа наноразмерных частиц немагнитных металлов позволяет получить дополнительное усиление сигнала комбинационного рассеяния (КР). Фиксация постоянного расстояния между слоем ГКР-активного субстрата и металлизированной поверхностью позволяет добиться усиления спектра КР света и снизить фоновый сигнал. Электромагниты обеспечивают возможность фиксации и сближения молекул исследуемого образца с поверхностью ГКР-активного субстрата, что необходимо для автоматизации процесса анализа молекул образца и позволяет использовать проточную ячейку для анализа различных образцов без дополнительной подготовки проточной ячейки, а также позволяет добиться оптимального расстояния между поверхностью ГКР-активного субстрата и молекулами образца.

На фиг. 1 представлен конкретный пример проточной ячейки для реализации предлагаемого способа. Цифрами обозначены следующие элементы: твердая подложка - 1; слой ГКР-активного субстрата - 2; металлизированная поверхность- 3; электромагнит - 4.

Ниже приведен пример осуществления способа регистрации спектров ГКР света, с помощью предлагаемой проточной ячейки.

Используется проточная ячейка, представленная на фиг.1, в которой твердая подложка выполнена из стекла размером 25x75 мм и толщиной 1 мм. В подложке, вдоль короткой грани, изготовлен канал глубиной 50 мкм и шириной 2 мм, на поверхность которого нанесен слой серебра толщиной порядка 100 нм. Металлизированная поверхность изготовлена из стекла размером 25x75 мм и толщиной 200 мкм, на поверхность которого нанесен слой серебра толщиной порядка 100 нм. Под твердой подложкой установлен электромагнит, обеспечивающий напряженность магнитного поля в 0,1 Тл. Подача образца и буфера для проведения анализа осуществляется с помощью шприцевого насоса со скоростью 1 мкл/мин на всех этапах проведения анализа. В качестве образца для анализа используются фракции очищенного рецептор-связывающего домена гликопротеина S (RBD, от английского Receptor Binding Domain) и малый мембранный белок (Е) вируса COVID-19. Так как оба белка содержат в своем составе аминокислотные остатки цистеина, способные образовывать дисульфидные связи с тиол-содержащими соединениями, то для их мечения используются магнитные наночастицы, покрытые 1-додекатиолом. Спектры исследуемых молекул получены на стандартном спектрометре комбинационного рассеяния. Для этого через проточную ячейку прокачивается буфер для проведения анализа с молекулами белка RBD, меченными магнитными наночастицами, через 10 минут включается электромагнит и через проточную ячейку, в течение еще 10 минут, прокачивается буфер для проведения анализа, после чего проводится регистрация спектров белка RBD в течение 2 секунд. Затем электромагнит отключается и через проточную ячейку прокачивается буфер для проведения анализа с молекулами белка Е, меченными магнитными наночастицами. Спустя 10 минут включается электромагнит и через проточную ячейку в течение еще 10 минут прокачивается буфер для проведения анализа, после чего проводится регистрация спектров белка Е в течение 2 секунд. В качестве сравнения используется проточная ячейка с конструкцией, описанной выше, в которой вместо металлизированной поверхности применяется стекло размером 25x75 мм и толщиной 200 мкм. Кроме того, получены спектры белков RBD и Е, которые не проходили процедуру конъюгирования с магнитными наночастицами, а регистрация их спектров проводилась при полной остановке потока. Спектры белков RBD и Е приведены на фиг. 2: спектры белков RBD и Е, полученные по предлагаемому способу в проточной ячейке с металлизированной поверхностью - А; спектры белков RBD и Е, полученные по предлагаемому способу, однако не проходивших процедуру конъюгирования с магнитными наночастицами - Б; спектры белков RBD и Е, полученные по предлагаемому способу в проточной ячейке, в которой металлизированная поверхность заменена стеклом - В; спектры белков RBD и Е, полученные по предлагаемому способу в проточной ячейке, в которой металлизированная поверхность заменена стеклом, однако не проходивших процедуру конъюгирования с магнитными наночастицами - Г. Слева представлены спектры белка RBD, справа - белка Е. Из полученных спектров видно, что предложенный способ позволяет эффективно получать спектры ГКР света различных молекул в автоматическом режиме без процедуры регенерации ГКР-активного субстрата. Также из анализа интенсивности пика в районе 750 см^-1 видно, что предложенный способ и конструкция проточной ячейки позволяют усилить интенсивность полезного сигнала, и детектировать полезный сигнал отличный от фонового сигнала.

Предложенный способ позволяет автоматизировать процесс исследования образцов методами ГКР света и повысить его производительность, что позволяет в автоматическом режиме регистрировать спектры ГКР света различных образцов без необходимости промывать или регенерировать поверхность ГКР-активного субстрата. При этом удается добиться усиления сигнала ГКР света и повысить чувствительность его детекции за счет применения резонатор-подобной структуры проточной ячейки с ГКР-активным субстратом и пространственной ориентации молекул исследуемого образца. В конечном итоге это позволяет использовать предлагаемый метод и проточную ячейку как для проведения научных исследований, так и для создания высокопроизводительных сенсоров биологических молекул.

Источники информации

1. Zachary Schultz, Oluwatosin Dada, Pierre Negri, Kevin Jacobs. Ultrasensitive SERS flow detector. Патент США US 9804093 B2.

2. Kirstin Weidemaier, Andrea Liebmann-Vinson, Adam Craig Curry, Alexander G. Lastovich, Christian Sandmann, W. Shannon Dillmore, James L. Schram, W. William Stewart, Robert E. Pearson, Helen Hsieh, Steven Keith, Rajendra R. Bhat. Assay using active particles in surface enhanced Raman spectroscopy (SERS). Патент Испания ES 2635272 T3.

3. Wang Zhuyuan, Cui Ping, Cui Yiping, Wu Lei, Fan Kequan, Zong Shenfei. Three-dimensional code biological detection chip based on surface-enhanced Raman scattering (SERS) microflow platform as well as preparation method and detection method of biological detection chip.Патент Китай CN 104568905 В.