Результат интеллектуальной деятельности: Способ моделирования термических ожоговых ран различной степени тяжести у лабораторных животных

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к экспериментальному моделированию термического ожога у лабораторных животных различной степени тяжести, и может быть использовано при разработке новых лекарственных средств, медицинских изделий и новых методов лечения ожоговых ран различной глубины.

Известен способ моделирования ожоговой травмы в эксперименте у животных (RU №2027143 С1, МПК G09B 23/28, опубл. 20.01.1995) где на подготовленное животное одевают устройство, приводя в соприкосновение контактный зажим с контактной площадкой. Включают на заданное время источник электропитания. После нанесения ожога отключают электропитание и устройство снимают с тела животного. Заданная тяжесть ожога зависит от напряжения, подаваемого от источника электропитания, от длины ленты и определяется в каждом конкретном случае.

Оценка температуры нагревательного элемента не предусмотрена. Ни одного эксперимента с использованием конкретных параметров (длины и ширины ленты, силы и напряжения тока, подаваемого на ленту, экспозиции нанесения ожога) и получением ожога определенной тяжести (подтвержденной гистологическим исследованием) не приведено. В дополнение ко всему, используется не выпускаемое промышленностью и трудоемкое при самостоятельном изготовлении нагревательное устройство, в котором лишь описаны различные варианты его возможного исполнения.

Известен метод нанесения ожога пробиркой с горячей водой (Влияние препарата ионизированного серебра на репаративную регенерацию кожи и подлежащих тканей при моделировании термических и химических ожогов у крыс / Н.С. Пономарь, Ю.С. Макляков, Д.П. Хлопонин, А.О. Ревякин // Биомедицина. 2012. - №1. - С. 143-148). При нанесении ожогов пустую стеклянную пробирку с внутренним диаметром 22 мм (площадь сечения 4 см2) и длиной 20-25 см заполняли горячей водой. Помещали пробирку вертикально в кипящую (100°C) воду на 2/3 высоты, прогревали в течение 1 мин, затем через край заполняли водой на 2/3 высоты и в вертикальном положении приводили в плотный контакт с оголенным участком кожи животного на 10 сек.

Дно пробирки округлое. Прижатие пробирки к поверхности кожи животного с разной силой и под разным наклоном, при контакте с кожей, приводят к получению различной площади ожога.

Известна экспериментальная модель создания ожоговой раны (RU №2472232 С2, МПК G09B 23/28, А61N 5/06, опубл. 10.01.2013). Для нанесения ожога к коже подводят насадку - медную пластинку площадью 400 мм2 и толщиной 1 мм. Через торец световода лазера («Лазермед 10 01») контактно воздействуют на нее излучением длиной волны 1064 нм в постоянном режиме, мощностью на торце световода 7,8-8,2 Вт. Под контролем тепловизора пластинка нагревается до 220°C, после чего выдерживается на коже еще в течение 2-х секунд. В результате создается ожоговая рана последовательно всех слоев кожи до подкожной клетчатки (ожог IIIб степени). Площадь ожога соответствует площади медной пластинки.

Применяемое в способе оборудование (лазер и тепловизор) характеризуется высокой стоимостью, а так же отсутствием возможности точного контроля и поддержания температуры нагревательного элемента.

Известен способ моделирования ожога в эксперименте у животных (Моделирование заболеваний/ Под ред. проф. С. В. Андреева. - Москва: Медицина, 197 - 336 с.), осуществляющийся посредством погружения области спины животного в воду, нагретую до температуры 65-100°C

Однако этот способ обеспечивает прогревание не только кожи, но и скелетных мышц животного (это обусловлено тем, что у мышей и крыс слабо выражен слой подкожной клетчатки, а вода имеет высокую теплоемкость) и вызывает раннюю гибель животных уже в первые 2-3 суток. Так же есть сложности в воспроизведении одинаковой площади ожога.

Известен метод (RU №2210118 C2, МПК G09B 23/28, А61В 18/04, опубл. 10.08.2003) где в качестве термического агента используют сухой воздух температурой 500°C. Поток горячего воздуха создается электрофеном BOSCH GHG 650 LCE с регулятором температуры и подается через окно размером 3×5 см2, вырезанное в асбестовой пластине, которая защищает поверхность кожи животного, не предназначенную для нанесения ожога. Расстояние от поверхности кожи до сопла электрофена составляет 1 см. Температура нагревания воздуха, равная 500°C, экспозиция 4 сек подобраны экспериментально.

Поскольку способ не предполагает измерение реальной площади термического ожога, а ориентировочным его размером является площадь окна в асбестовой пластинке, это должно привести к существенным погрешностям в оценке реальной площади ожога. Кроме того, асбестовая пластинка, по-видимому, ничем не прижималась к телу животного, что приводило к проникновению горячего воздуха за пределы окна в пластине, увеличивая, таким образом, реальную площадь ожога. Летальность животных составила 20% в первые трое суток после эксперимента, связанное, вероятно, со значительным тепловым воздействием на организм животных в целом (аналогично, как и в вышеупомянутом методе при погружении животных в горячую воду).

Известен способ моделирования ожога (RU №2582458 C1, МПК G09B 23/28, А61В 5/103, опубл. 27.04.2016), включающий использование в качестве термического агента электромагнитного излучения с контролем температуры в зоне ожога. Для нанесения стандартных термических ожогов заданной площади 3,14 см2 и заданной II-IIIа степени на плоском (почти плоском) участке тела экспериментальных животных (крыс) с помощью ИК паяльной станции марки YaXunYX865D используют следующий режим: расстояние ИК нагревателя от кожи животного 15 мм, температура на коже в зоне нагревания - 60°C, длительность нагревания - 23 сек, мощность - 100 Вт.

Достигаемая температура (60°C) регистрировалась термопарой, расположенной на поверхности кожи в зоне ожога. Глубина прогрева описывается в 5мм. Хотелось бы отметить, что температура на поверхности кожи и в более глубоких слоях будет отличаться. Глубина проникновения ИК излучения чисто гипотетическая, а уменьшение интенсивности излучения при проникновении в более глубокие слои кожи не учитывалась. Все это делает сложным стандартизировать параметры нанесения ожога нужной глубины.

Известна модель нанесения ожоговых ран различной степени (RU №172252 U1, МПК G09B 23/28, опубл. 03.07.2017) при помощи устройства, включающего в себя цилиндр с размещенным внутри него нагревателем, позволяет производить контроль и регулировку температуры контактного ожогового элемента, причем цилиндр выполнен из металла, в качестве контактного ожогового элемента использована металлическая пластина, закрепленная на основании цилиндра, контроль температуры производят с помощью металлического щупа, вводимого в гнездо, расположенное снаружи цилиндра, и подключенного к термометру, в качестве нагревателя используется галогеновая лампа, подключенная к питанию через регулирующий ее мощность диммер. Устройство подключают к электрической сети с использованием диммера на шнуре устанавливают оптимальную электрическую мощность для галогенной лампы. С помощью электронного термометра с металлическим щупом точно контролируют температуру нагрева металлической пластины для нанесения ожога. Животных, подвергшихся наркотизированию, фиксируют, на 10 секунд прикладывают металлическую пластину к коже животного преимущественно в межлопаточной области спины, в результате получают ожог IIIA степени общей площадью 6,25 см2.

В модели не описаны конкретные параметры для нанесения ожога разной степени тяжести. Использование галогеновой лампы в роли нагревателя приводит к усложнению конструкции и увеличению времени разогрева всей конструкции. Не указано может ли быть использована контактная пластина другой площади. В приведенном примере моделирования ожога указаны сила прижатия, экспозиция, но не приведен один из главных параметров - температура контактной пластины. Так же полученный ожог был оценен по тяжести как IIIА степени, однако оценка проводилась только визуально, без проведения подтверждающих морфологических исследований.

Задачей изобретения является:

- формирование оптимальной экспериментальной модели ожоговых ран различной степени тяжести у мелких лабораторных животных (крысы) с последующей апробацией опытных образцов медицинских изделий, раневых покрытий, лекарственных средств, разрабатываемых для лечения ожогов кожи.

Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что в способе моделирования термических ожоговых ран различной степени тяжести у лабораторных животных, включающем нанесение ожоговой травмы после подготовки операционного поля и животного, ожоговую травму наносят устройством с температурой контактной площадки 100°C, обеспечивают силу прижатия 10Н и экспозицию требуемой для получения ожога нужной степени тяжести, при этом за 10 секунд достигают ожога II степени, за 20 секунд -ожога IIIa степени, за 30 секунд - ожога IIIб степени, за 40 секунд - ожога IV степени; затем область по периметру нанесенного ожога прошивают нерассасывающимся шовным материалом с использованием атравматичной иглы на всю глубину кожи с захватом фасции и скелетных мышц.

Техническим результатом изобретения, является разработанная экспериментальная модель нанесения стандартизированной ожоговой травмы кожи различной степени тяжести.

Технический результат достигается за счет применения устройства для нанесения ожога с точным термоконтролем контактной площадки. Изменяя экспозицию прижатия контактной площадки к коже животного становиться возможным получить ожог заданной степени тяжести. Параметры нанесения ожога были определены на основании данных литературы и проведенного контрольного эксперимента с гистологическим подтверждением тяжести нанесенных повреждений.

Предлагаемый нами метод имеет ряд существенных отличия от предложенных ранее методов моделирования ожогов кожи. Использование температуры нагревательной площадки 100°C [3] позволяет избежать системного воздействия тепла на животное, что подтверждается отсутствием летальности в эксперименте. Использование регулятора напряжения с термопарой в нагревательном элементе позволяет точно задать и поддерживать температуру контактной площадки. Мощность нагревательного элемента составляет 300 ватт, что позволяет быстро (1-2 минуты) достигнуть заданной температуры. Контактная площадка, установленная на нагревательный элемент, является съемной, что позволяет использовать контактные площадки любой, требуемой, площади и формы. Прошивание краев раны после нанесения ожога необходимо для ограничения влияния подкожного слоя мышц (Panniculus Carnosus) в коже грызунов, который стягивает края раны и смазывает фактические показатели изменения площади раны при оценке ее заживления [5].

Изобретение поясняется: фиг. 1, на которой изображена схема нагревателя для клейм, фиг. 2, на которой изображен один из вариантов контактной площадки, установленный на нагреватель для клейм, фиг. 3, на которой изображена схема регулятора напряжения ,фиг. 4, на которой представлен процесс нанесения ожога, фиг. 5, на которой изображен полученный ожог площадью ≈ 20 см², фиг.6 на которой представлен один из этапов проведения тканевой термометрии, фиг. 7 гистологическое подтверждение ожога II степени, на фиг. 8 гистологическое подтверждение ожога IIIА степени, на фиг. 9 гистологическое подтверждение ожога IIIБ степени, на фиг. 10 гистологическое подтверждение ожога IV степени.

При разработке собственной модели мы учли преимущества и недостатки существующих методов. Для нанесения ожога использовался промышленно выпускаемый нагреватель для клейм TempStamp (модель TI2-300) мощность 300Вт, в комплекте с регулятором напряжения KD-2000 и установленной сменной контактной площадкой в виде латунного цилиндра диаметром 50 мм и высотой 40 мм.

Устройство нагревателя для клейм изображено на фиг. 1.

Прибор состоит из нагревательного элемента (1), который закреплен на краю металлической шпильки M8 (2). С противоположной стороны на шпильке закреплена ручка (3), позволяющая держать в руке всю конструкцию. Шпилька проходит нагревательный элемент насквозь и позволяет фиксировать на нем контактные площадки различной формы и площади. Для плотного контакта нагревательного элемента и контактной площадки на шпильке предусмотрена прижимная гайка (4). В нагревательном элементе предусмотрено место для установки термопары (5).

На фиг.2 изображен вариант размещения на нагревательном элементе (1), контактной пластины (2), исполненной в виде латунного цилиндра высотой 40 мм и диаметром 50 мм имеющий в центральной части резьбу М8 глубиной 15 мм, для плотного крепления к нагревательному элементу (1).

Устройство регулятора напряжение изображено на фиг. 2.

Оно включает в себя корпус (1), термопару (2), устанавливаемую в предназначенное место в нагревательном элементе, которая позволяет при помощи терморегулятора (3), задавать и поддерживать необходимую температуру. Так же присутствует сетевой шнур (4), для подключения прибора к сети 220V, и гнездо для подключения кабеля питания от нагревательного элемента (5).

Устройство, благодаря непрерывному использованию показаний установленной в нагревательном элементе термопары, всегда поддерживает заданную температуру контактной площадки, регулируя напряжение на нагревательном элементе.

Для определения условий для нанесения ожога определенной глубины были использованы данные из литературы [1-3]. Было выявлено, что прогрев тканей, подлежащих под местом ожога, до температуры от 43 до 50°С достаточен для возникновения частично обратимых повреждений. Нагрев тканей до 50 - 60°С ведет к необратимому повреждению, а при достижении 60 - 65°С ткани погибают уже в момент ожога.

Для подтверждения этих данных был проведен эксперимент, описанный ниже.

Лабораторные животные (крысы линии Wistar, самцы) были отобраны одной массы, около 250 гр и разделены на 4 группы - по 4 особи в каждой. Для тканевой термометрии использовалась термопара диаметром 0.1 мм, которая вводилась под кожу через иглу внутривенного катетера (18G), в месте планируемого ожога. Для нанесения ожога температура контактной площадки нагревательного прибора была установлена на 100°С (более высокая температура оказывает общесистемное воздействие на животное) [3].

Все манипуляции выполнялись под инъекционным наркозом (интраперитонеальная инъекция) смесью препаратов Золетил®100 (25мг/кг) и Рометар (10мг/кг) [4]. Область спины для нанесения ожога была побрита и депилирована. Вводилась термопара для тканевой термометрии. Контактная площадка нагревательного прибора прикладывалась к подготовленному участку кожи в области спины с усилием 10 ньютонов (1 кг/с). Для контроля прилагаемой силы на протяжении всей экспозиции подопытное животное фиксировалось на весах, а перед нанесением ожога весы обнулялись. В процессе нанесения ожога производился контроль, чтобы показания весов находились в области 1000 г (фиг. 4).

Исходя из диаметра контактной площадки, составляющего 5 см, и имеющего площадь 19,6 см2, площадь полученного ожога составляла ≈ 20 см2. (фиг.5). Учитывая, что средняя площадь поверхности тела животного составила 344,4 см2 (вычислено по форомуле Мее-Рунбера в модификации Лее), ожог с площадью 20 см2, составил 5,8 % от общей площади тела животного.

В группе №1 экспозиция контактной площадки составляла 10 секунд, во второй - 20 секунд, в третей - 30 секунд и в четвертой 40 секунд.

В ходе эксперимента летальность составила 0%. Результат одного из замеров представлен на фиг. 6.

Результаты тканевой термометрии приведены в таблице 1.

На основании проведенных измерений, предполагается, что в 1 группе температура тканей была недостаточной для значительного повреждения. Во 2 группе температура была выше, но повреждения носили относительно обратимый характер. В 3 и 4 группах температура была достаточной для необратимых повреждений. В дальнейшем эти данные будут сопоставлены с данными гистологического исследования.

Через сутки лабораторные животные были выведены из эксперимента, со взятием биопсии из центральной и краевой области ожога для гистологического исследования.

При гистологическом исследовании (окраска гематоксилином и эозином, увеличение × 100) области ожога у животных из 1 группы (экспозиции 10 сек) было выявлено наличие эпидермального пузыря, неравномерное полнокровие и микроочаговые паравазальные кровоизлияния в подлежащих слоях кожи (фиг. 7). Данные повреждения соответствуют таковым при ожоге II степени.

При гистологическом исследовании (окраска гематоксилином и эозином, увеличение × 100) области ожога у животных из 2 группы (экспозиции 20 сек) был выявлен дермальный пузырь и более глубокая коагуляция слоев кожи, а придатки кожи при этом не поражены (фиг. 8). Данные повреждения соответствуют таковым при ожоге IIIА степени.

При гистологическом исследовании (окраска гематоксилином и эозином, увеличение × 200) области ожога у животных из 3 группы (экспозиции 30 сек) был выявлен дермальный пузырь с полной отслойкой эпидермиса; коагуляция подлежащих слоев кожи, вплоть до поверхностно лежащих придатков кожи с очагами диапедезных кровоизлияний вокруг них (фиг. 9). Данные повреждения соответствуют таковым при ожоге IIIБ степени.

При гистологическом исследовании (окраска гематоксилином и эозином, увеличение × 100) области ожога у животных из 4 группы (экспозиции 40 сек) была выявлена тотальная коагуляция кожи с придатками на всю глубину, распространяющаяся в подлежащие ткани вплоть до скелетной мышцы (фиг. 10).

Можно подвести итог: при экспозиции 10 секунд поражение тканей соответствовало ожогу II степени, 20 секунд -ожогу IIIa, 30 секунд - ожогу IIIб, 40 секунд - ожогу IV степени.

Полученные данные соответствуют данным, полученным из источников литературы.

Эксперимент показал, что оптимальными условиями для воспроизведения ожогов, можно считать прикладывание к коже контактной площадки прибора, нагретой до 100℃, с силой равной 10 ньютонов (1 кг/с) с различной экспозиции для разной глубины ожога: 10 секунд - ожог II степени, 20 секунд -ожогу IIIa, 30 секунд - ожогу IIIб, 40 секунд - ожогу IV степени.

Манипуляцию проводят под инъекционным наркозом (интраперитонеальная инъекция) смесью препаратов Золетил®100 (25мг/кг) и Рометар (10мг/кг) [4]. Экспериментальное животное (самец крысы линии Wistart 230-250г) лежит на весах, спиной вверх, нижние и верхние конечности разведены в стороны и фиксированы. Операционное поле побрито, тщательно депилировано и обработано 70% этиловым спиртом. На регуляторе напряжения прибора для несения ожога выставляется требуемая для поддержания температура 100°С. Ожидается достижение заданной температуры (текущая температура выводиться на регуляторе напряжения в реальном времени). Обнуляются показания весов, на которых находиться лабораторное животное. Производится прикладывание контактной площадки к операционному полю с экспозицией требуемой для нужной глубины ожога (10 секунд - ожог II степени, 20 секунд -ожогу IIIa, 30 секунд - ожогу IIIб, 40 секунд - ожогу IV степени). В течении всего времени нанесения ожога ведется постоянный контроль силы прижатия контактной площадки, составляющий 10Н (показания весов под животным должны быть в области 1000г). Область по периметру нанесенного ожога прошивается не рассасывающимся шовным материалом с использованием атравматичной иглы на всю глубину кожи с захватом фасции и скелетных мышц. Далее животное при необходимости маркируется, а затем переноситься в клетку.

Достоинства предлагаемого способа моделирования ожоговой травмы: использование легкодоступного оборудования, которое производится промышленностью; простота нанесения ожоговой травмы; экспериментально обоснованные и подтвержденные гистологически параметры нанесения ожога различной степени тяжести; повторяемость полученных ожоговых ран; нулевая летальность при нанесении ожогов. Все вышеперечисленное имеет большое значение при разработке новых лекарственных средств, медицинских изделий и новых методов лечения ожоговых ран различной глубины

Список литературы:

1. Кочетыгов Н.И. О способах воспроизведения термических ожогов в эксперименте: монография. / Н.И. Кочетыгов; ВМОЛА им. С.М. Кирова. - Ленинград: [б.и.], 1964. - 40 с.

2. Abdullahi A, Amini-Nik S, Jeschke MG. Animal models in burn research. Cell Mol Life Sci. 2014;71(17):3241-3255. doi:10.1007/s00018-014-1612-5

3. Loo, Y. L., Haider, S., Lim, Y. P., & Jeffery, S. (2018). Predictor of the depth of burn injuries: A time and temperature relationship review. International Journal of Medical Science and Clinical Invention, 5(11), 4119-4128. https://doi.org/10.18535/ijmsci/v5i11.01

4. Способ инъекционного наркоза крыс и кроликов для проведения длительных операций в научных целях: удостоверение на рационализаторское предложение № 15307/2 от 07.02.2022 / Р.И Глушаков, А.А. Кокорина, С.С. Пюрвеев; ФГБВОУ ВО ВМедА им. С.М. Кирова

5. Nuutila K, Katayama S, Vuola J, Kankuri E. Human Wound-Healing Research: Issues and Perspectives for Studies Using Wide-Scale Analytic Platforms. Adv Wound Care (New Rochelle). 2014;3(3):264-271. doi:10.1089/wound.2013.0502