Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ТОКСИЧЕСКОЙ НЕФРОПАТИИ У КРЫС В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Изобретение относится к медицине, экспериментальной биологии, экологии, токсикологии и может быть использовано для моделирования хронической токсической нефропатии у экспериментальных животных.

Среди многочисленных экопатогенных факторов, загрязняющих окружающую среду, все более пристальное внимание исследователей привлекают тяжелые металлы, в том числе хром и его соединения.

При поступлении хрома в организм могут развиваются полиорганные структурно-функциональные нарушения (Balmer J. Hexavalent Chromium. Workplace Health Saf. 2018; 66 (11): 564. https://doi.org/10.1177/2165079918805775). Почки являются основным органом выведения тяжелых металлов из организма, соответственно они в большей степени подвергаются токсическому воздействию ксенобиотиков.

Почками выводится около 80% поступившего в организм хрома, и при длительном введении элиминация почками превышает его выделение через кишечник (Авцин А.П. 1991). Актуальной является проблема создания удобной модели хронической токсической нефропатии, для разработки эффективных способов профилактики и лечения хронической интоксикации соединениями хрома.

Достаточно подробно исследована роль соединений хрома в профессиональной патологии, но действие их на водно-солевой обмен и функцию почек мало изучено, отдельные наблюдения противоречивы и носят преимущественно экспериментальный характер: (Junaid М., Hashmi М.Z, Malik, R.N. Toxicity and oxidative stress induced by chromium in workers exposed from different occupational settings around the globe: A review. Environ Sci Pollut Res. 2016; 23:20151-20167. https://doi.ors/10.1007/s11356-016-7463-xj Wu Y.H., Lin J.C., Wang T.Y., Lin T. J., Yen M.C. [et al]. Hexavalent chromium intoxication induces intrinsic and extrinsic apoptosis in human renal cells. Mol Med Rep. 2020; 21(2):851-857. https://doi. ors/10.3892/mmr.2019.10885; El-Mahalaway, Abeer M., Salem, Maysara M., Mousa, Ayman M. The effect of potassium dichromate on convoluted tubules of the kidney of adult male albino rats and the possible protective role of ginseng. Egyptian Journal of Histology. 2015; 38(2):157-167. https://doi.ors/10.1097/01.EHX.0000464738.41270.06; Alshymaa О.H. Ahmed, M.Sc.; Hanan E.L. Mokhtar, M.D.; Heva О.M. [et al. J Structural changes induced by potassium dichromate in renal cortex of adult male albino rats and the possible protective role of selenium. The Medical Journal of Cairo University. 2019; 87:661-675. https://doi.org/10.21608/mjcu.2019.52521).

Эти факты обозначили целесообразность использования соединений хрома для создания модели хронической токсической нефропатии.

Наиболее близким к предложенному решению является способ (Goodarzi Z., Karami Е., Ahmadizadeh М. Simvastatin attenuates chromium-induced nephrotoxicity in rats. J Nephropathol. 2017; 6(1):5-9. https://doi.org/10.15171/jnp.2017.02) моделирования токсической нефропатии, создаваемый путем внутрибрюшинного введения соли хрома в дозе 8 мг/кг в течение 8 дней, который был взят нами за прототип. Недостатком описываемого способа является то, что во-первых, отсутствует хроническое воздействие токсического вещества на организм; во-вторых способ введения внутрибрюшинный может приводить к патологическим процессам, препятствуя адекватному изучению нефротоксического влияния хрома на организм. Внутрижелудочное введение токсического вещества является более приближенным к естественным условиям интоксикации в условиях загрязнения окружающей среды металлополютантами.

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа моделирования хронической токсической нефропатии.

Решение этой задачи позволяет расширить представление о действии избытка хрома на организм, повреждающем действии на структуру почечной ткани и ее функции при длительном воздействии бихромата калия, позволяет создать способ моделирования хронической токсической нефропатии, повышающий воспроизводимость, удобный для проведения эксперимента на животных и экономически выгодный.

Для достижения этого технического результата заявляемое изобретение способа моделирования хронической токсической нефропатии включает следующие существенные признаки: в качестве токсического вещества используют раствор бихромата калия, вводимый через зонд в желудок один раз в сутки ежедневно в течение двух месяцев в дозе 0,5 мг/кг в пересчете на металл, где на единицу раствора, равную 0,5 мл, приходится 0,05 мг хрома.

Предлагаемый способ отличается от прототипа использованием токсического вещества - бихромата калия, а также способом и длительностью введения для создания модели хронической токсической нефропатии.

Между отличительными признаками заявляемого изобретения и техническим результатом существует следующая причинно-следственная связь: длительное введение раствора бихромата калия в дозе 0,5 мг/кг приводит к возникновению хронической токсической нефропатии, что является более удобной и приближенной к натуральным условиям моделью.

По имеющимся у авторов сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».

По мнению авторов, сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется вышеуказанная возможность получения способа моделирования хронической токсической нефропатии, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень».

Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть многократно использован в эксперименте с получением результата, заключающегося в эффективном и легко воспроизводимом способе развития хронической токсической нефропатии, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».

Данный способ осуществляется следующим образом.

Для получения токсического вещества бихромат калия растворяется в стерильной дистиллированной воде таким образом, что на единицу раствора, равную 0,5 мл, приходится 0,05 мг хрома (в пересчете на металл). На каждые 100 г. веса крысы вводится 0,5 мл раствора (0,05 мг Сr⁶+), что не является водной нагрузкой на организм животного. Раствор бихромата калия вводится через зонд в желудок каждый день в течение двух месяцев. Сущность способа подтверждается результатами исследования функционального состояния почек у крыс при хронической интоксикации в течение двух месяцев.

Пример 1. Крысам самцам линии Вистар массой 200-250 г. вводили через зонд в желудок раствор бихромата калия («Полихим», Россия) в дозе 0,5 мг/кг каждый день в течение двух месяцев. Исследование функционального состояния почек проводили каждые две недели. Контролем служили - интактные животные. В период исследований экспериментальные животные содержались в стандартных условиях вивария. При проведении опытов руководствовались Международными рекомендациями (1985) по проведению медико-биологических исследований с использованием лабораторных животных и Правилами лабораторной практики (приказ МЗ РФ №267 от 19.06.2003). По истечении времени эксперимента крысы забивались с использованием тиопенталового наркоза.

Для исследования мочеобразовательной функции почек определяли объем 6-часового спонтанного диуреза, клубочковую фильтрацию, относительную канальцевую реабсорбцию воды (R_H2O). В плазме крови и моче определяли концентрацию общего белка и креатинина (спектрофотометр SOLAR 300, Беларусь; наборы реактивов Агат-Мед, Москва, Россия), осмолярность мочи (миллиосмометр Osmomat-2). В слоях тканей почки определяли концентрацию мочевины (методом С.Г. Гасанова (1962) в нашей модификации - рац. предложение 241 и 242, от 20.12.2006 г.), натрия (Фотометр пламенный автоматический ФПА-2). Экстракция натрия из слоев тканей почек производилась азотной кислотой (0,75 Н). По клиренсу эндогенного креатинина определяли скорость клубочковой фильтрации. Рассчитывали C_osm - осмотическое очищение, Ef_osm - экскретируемая фракция осмотически активных веществ (ОАВ), U_osm х V - экскреция ОАВ, T^Сн2o - транспорт осмотически свободной воды для количественной оценки осморегулирующей функции почек.

Полученные результаты обрабатывались статистически (Microsoft Excel 2016 и STATISTICA 10.0., StatSoft) с учетом распределения признаков в группах (критерий Шапиро-Уилка). Рассчитывали описательные статистические показатели (Me) и [Q25÷Q75] процентили выборки. Статистическую значимость различий в группах животных оценивали с использованием U-критерий Манна-Уитни. Различия считались достоверными при вероятности ошибки р<0,05.

Внутрижелудочное введение крысам бихромата калия в дозе 0,5 мг/кг вызывало достоверное увеличению шестичасового спонтанного диуреза, вследствие снижения относительной канальцевой реабсорбции воды Rmo через две недели и один месяц по срокам исследования (Табл. 1), скорость клубочковой фильтрации от контроля не отличалась. Рост диуреза сопровождался достоверным уменьшением осмолярности мочи (U_osm). Однако экскреция с мочой осмотически активных веществ (Uosm*V) и экскретируемая фракция (Efosm) достоверно возрастали вследствие уменьшения канальцевой реабсорбции ОАВ. При этом транспорт осмотически свободной (несвязанной) воды в канальцах ТСн2о был выше чем у интактных крыс (Табл. 1).

Для выяснения механизмов нарушения мочеобразовательной функции проводилось исследование кортико-папиллярного осмотического градиента слоев ткани почек у крыс (Табл. 2). Через один месяц интоксикации при естественном уровне гидратации содержание мочевины и натрия в слоях тканей почки достоверно не отличалось от уровня контроля. Следовательно, выявляемое в эксперименте достоверное увеличение транспорта осмотически свободной воды T^Сн2o из просвета канальцев в интерстиций мозгового вещества почки не зависит от изменения электролито-мочевинного профиля тканей почки. Анализ литературы позволяет объяснить полученные экспериментальные данные избирательностью токсического действия хрома на эпителий проксимальных извитых канальцев (почки), вследствие избирательного накопления металла, обусловленное реабсорбцией белков транспортеров в этих отделах нефрона (El-Mahalaway, Abeer М., Salem, Maysara М., Mousa, Ayman M. 2015, https://doi.org/10.1097/01.EHX.0000464738.41270.06: Wu Y. H, Lin J.C., Wang T.Y., Lin T.J., Yen M. C. [et al]. 2020, https://doi.org/10.3892/mmr.2019.10885:).

При токсическом воздействии хрома происходит снижение проксимальной реабсорбции, что может приводить к увеличению объема жидкости, поступающей в дистальные отделы канальцев и собирательные трубочки, приводя к росту дистальной реабсорбции осмотически свободной воды. Следовательно, увеличение диуреза сопровождается одновременно повышением экскреции осмотически активных веществ, не реабсорбированных в канальцевом аппарате и ростом транспорта осмотически свободной воды Т^сH2O. Об этом также может свидетельствовать выявляемое увеличение экскреции бета-2 микроглобулина с мочой у рабочих с хромовой интоксикацией. (Junaid М., Hashmi М.Z., Malik, R.N. 2016, https://doi.org/10.1007/s11356-016-7463-x).

Через два месяца интоксикации регистрировалось резкое уменьшение клубочковой фильтрации, но на фоне снижения канальцевой реабсорбции воды уровень диуреза оставался выше фоновых значений. Развивалась протеинурия (Табл. 1). Увеличение объема диуреза сопровождалось ростом Efosm, однако осмотическое очищение Cosm и экскреция ОАВ достоверно не менялись, так как одновременно уменьшалась фильтрационная загрузка нефронов. Снижение осмолярности мочи на фоне роста диуреза происходило вследствие значительного падения T^СН2O. Уменьшение канальцевого транспорта осмотически свободной воды в канальцах коррелировало с увеличением диуреза (r_s=0,70) у экспериментальных животных.

Изучение мочевинно-натриевого профиля слоев тканей почки показало, что градиент концентрации натрия и мочевины от коркового вещества к мозговому уменьшается относительно контроля (Табл. 2). Полученные результаты могут свидетельствовать о том, что диуретический эффект соли хрома и уменьшение концентрирующего транспорта осмотически свободной воды у крыс при длительном токсическом воздействии хрома связан с уменьшение величины кортико-папиллярного осмотического градиента.

Предлагаемый способ моделирования хронической токсической нефропатии является эффективным, позволяет изучать эту патологию в динамике развития и может способствовать разработке и поиску средств для лечения и профилактики хронической токсической нефропатии.