Результат интеллектуальной деятельности: Способ выделения суммы таннинов, используемой для получения субстанции противоопухолевого препарата "Ханерол" из кипрея узколистного (иван-чая) (Chamaenerion angustifolium (L.)Scop.)

Изобретение относится к области химико-фармацевтической промышленности, в частности, к способу выделения из кипрея узколистного (иван-чая) суммы таннинов, входящей в состав субстанции препарата «Ханерол», обладающего противоопухолевой активностью.

Кипрей узколистный (иван-чай) (Chamaenerion angustifolium (L.) Scop.) (Epilobium angustifolium (L)) семейства кипрейных (Onagraceae) - растение, произрастающее на территории России, широко используется в традиционной медицине как лекарственное растение. Действующими веществами разработанного противоопухолевого препарата «Ханерол» являются макроциклические гидролизуемые таннины, структура которых доказана химическими и спектральными методами. Основным действующим компонентом препарата является димерный макроциклический таннин хаменерин-I состава C₆₈H₄₈O₄₄⋅nH₂O (до 60% от общего содержания биологически активных веществ препарата) (Сасов С.А. «Выделение противоопухолевого препарата ханерол из кипрея узколистного и данные о его структуре», автореферат диссертации, канд. хим. наук, Москва, 1986, 22 стр.; Спиридонов Н.А. и др. «Цитотоксичность таннинов Chamaenerium angustifolium (L.) Scop. и Hippophae rhamnoides L. и их влияние на дыхание митохондрий», Экспериментальная и клиническая фармакология, 1997, Т. 60, №4, С. 60-63; Сасов С.А. и др. «Макроциклические таннины кипрея узколистного», Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 2010, №10, С. 24-29; Петрова М.Ф. и др. «Оригинальный противоопухолевый препарат - ханерол», Материалы Всесоюзного совещания «Актуальные проблемы экспериментальной химиотерапии опухолей», Черноголовка 1980, Том 1, С. 210-212).

Структура действующего начала «Ханерола» - хаменерина-1 идентифицирована с энотеином В, полученным из энотеры (Т. Hatano et al. «Oenothein В, a dimeric hydrolysable tannin of cyclic structure», Chem. Pharm. Bull., 1989, V. 37, №8, P. 2269-2271; Igor A. Schepetkin et al. «Therapeutic Potential of Polyphenols from Epilobium angustifolium (Fireweed), Phytother. Res. 2016 Aug; V 30, №8. P. 1287-1297).

Известен способ получения субстанции противоопухолевого препарата «Ханерол» из суммы таннинов (Т.А. Алиева и др. «Способ получения фитогемагглютинина, обладающего противоопухолевой активностью», А.с. СССР №396040, 01.10.1971), включающий стадии экстракции цветков кипрея узколистного 25% раствором диметилформамида, осаждение таннинов основным ацетатом, свинца, разложение свинцового комплекса сероводородом, последующий диализ и обессоливание на катионите КУ-2-8 (Н⁺)

Позже разработан способ получения субстанции противоопухолевого препарата «Ханерол», включающий стадии экстракции цветков кипрея узколистного (иван-чая) 25% раствором диметилформамида, осаждение свинцового комплекса таннинов средним ацетатом свинца, промывание свинцового комплекса последовательно водой, спиртом и опять водой. Далее проводят частичное разложение свинцового комплекса катионитом КУ-2-8 (Н⁺) и окончательное обессоливание на колонке с катионитом КУ-2-8 (Н⁺), упаривание и лиофильную сушку, получение готового продукта. (Сасов С.А. «Выделение противоопухолевого препарата «Ханерол» из кипрея узколистного и данные о его структуре». Автореферат диссертации, канд. хим. наук, Москва, 1986, 22 стр.; Петрова М.Ф. и др. «Выделение активного начала Chamaenerion angustifolium», Химиотерапия опухолей в СССР. Выпуск 27, Москва, 1979, С. 9-11). Сасов С.А. и др. «Гидролизуемые гало-эллаго-танины кипрея узколистного Chamaenerion angustifolium (L.)) из биоколлекции питомника ботанического сада ФГБНУ ВИЛАР - перспективный источник для получения цитотоксических средств». Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, т. 22, 2019, №1) Последний способ был выбран нами в качестве прототипа.

К недостаткам прототипа относится использование в процессе выделения токсичного среднего ацетата свинца.

Нами предлагается новый способ выделения суммы таннинов для субстанции противоопухолевого препарата «Ханерол» из соцветий или побегов кипрея узколистного (Chamaenerion angustifolium (L.) Scop.), свободный от недостатков прототипа, в котором исключено использование токсичных солей свинца.

Задача решается тем, что при выделении суммы таннинов субстанции противоопухолевого препарата «Ханерол» для осаждения целевой фракции ацетат свинца заменен на ацетат цинка.

Технический результат

Разработан новый, простой в исполнении и экологически чистый способ выделения субстанции препарата «Ханерол» на основе димерного макроциклического гидролизуемого таннина из кипрея узколистного (иван-чая) (Chamaenerion angustifolium (L.) Scop) семейства кипрейных (Onagraceae), обладающего противоопухолевой активностью.

Заявляемый способ включает следующие стадии:

1. Экстракцию соцветий или побегов кипрея узколистного водным раствором диметилформамида.

2. Фильтрацию и концентрирование полученного раствора.

3. Двухстадийное осаждение цинковых солей танниновой фракции.

4. Отделение осадка и промывка водой, спиртом и водой.

5. Обработка предпочтительно катионитом КУ 2-8 (H⁺).

6. Концентрирование в вакууме, лиофильная сушка и получение готового продукта.

Способ осуществляется следующим образом:

Высушенное растительное сырье экстрагируют водным 25% диметилформамидом в течение 24 час, фильтруют, а затем концентрируют в вакууме. К полученному концентрату при температуре 45°С и перемешивании прибавляют 20%-ный раствор ацетата цинка. Выпавший осадок центрифугируют и отделяют.

К раствору снова при 45°С прибавляют 20%-ный раствор ацетата цинка при перемешивании, охлаждают до комнатной температуры, выпавший осадок центрифугируют, тщательно перемешивают с дистиллированной водой и снова центрифугируют.

Осадок повторно промывают 2 раза дистиллированной водой, далее его дважды обрабатывают этанолом ректификатом, центрифугируют, вновь промывают водой и центрифугируют.

Цинковую соль суспендируют с дистиллированной водой, к смеси прибавляют катионит КУ-2-8 в Н⁺ форме и интенсивно перемешивают в течение 20-30 мин. Далее осадок отделяют на центрифуге, промывают и вновь центрифугируют.

Объединенные растворы и промывные воды пропускают через колонку с катионитом КУ-2-8 в Н⁺ форме. Водный элюат концентрируют в вакууме, а затем его лиофилизируют. Выход препарата 4-5% от веса растительного сырья, [α]_D+221 - 228°.

Пример осуществления способа выделения суммы таннинов для получения субстанции противоопухолевого препарата «Ханерол» на основе димерного гидролизуемого таннина из соцветий кипрея узколистного (иван-чая):

Пример 1. Экстракцию 500 г соцветий кипрея узколистного проводят в течение 24 часов 5 литрами 25% водного раствора диметилформамида. Экстракт отделяют и концентрируют в ваккууме до объема 1200-1300 мл. Осаждение цинковой соли танниновой фракции проводят в две стадии путем прибавления 20% раствора ацетата цинка, сначала 40 мл, потом еще 140 мл и отделяют центрифугированием. Осадок центрифугируют, промывают водой, спиртом и еще раз водой. Осадок суспендируют в 1 литре воды, добавляют 80 мл катионита КУ-2-8 (Н⁺) и перемешивают 20-30 минут. Раствор отделяют от осадка центрифугированием. Остатки солей отделяют пропусканием через колонку с катионитом КУ-2-8 (H⁺) в количестве 125-150 мл. Водный раствор концентрируют в вакууме до 100-150 мл и высушивают в лиофильной сушке. Выход субстанции противоопухолевого препарата «Ханерол» 20-25 г (4-5% от веса исходного сырья, [α]_D+221 - 228° (вода).

Способ выделения противоопухолевого препарата из побегов кипрея узколистного осуществляют вышеописанным способом. Осаждение цинковых солей проводят в две стадии: вначале 40 мл, затем 150 мл. Выход препарата 4-5% от веса растительного сырья, [α]_D+225°.

Пример 2. Экстракцию 500 г побегов кипрея узколистного проводят в течение 24 часов 5 литрами 25% водного раствора диметилформамида. Экстракт отделяют и концентрируют в ваккууме до объема 1200-1300 мл. Осаждение цинковых солей танниновой фракции проводят в две стадии путем прибавления 20% раствора ацетата цинка сначала 40 мл потом еще 150 мл. Осадок центрифугируют, промывают водой, спиртом и еще раз водой. Осадок суспендируют в 1 литре воды добавляют 80 мл катионита КУ-2-8 (Н⁺) и перемешивают 20-30 минут, осадок отделяют центрифугированием. Остатки солей отделяют пропусканием через колонку с катионитом КУ-2-8 (Н⁺) в количестве 125-150 мл. Водный раствор концентрируют в ваккууме до 100-150 мл и высушивают в лиофильной сушке. Выход субстанции противоопухолевого препарата «Ханерол» также 20-25 г (4-5% от веса исходного сырья, [α]_D+225° (вода).

Контроль процессов разделения и подлинности соединений осуществляют методами препаративной и аналитической хроматографии на бумаге, на полиакриламидном геле (фракционирование по молекулярной массе) и использования специфических хромогенных реакций на полифенольные соединения, а также данными перманганатометрического титрования, удельного показателя поглощения и величины углов оптического вращения ([α]_D+225°) в сравнении с заведомыми образцами суммы таннинов для получения субстанции противоопухолевого препарата «Ханерол», полученными по прототипу.

Изобретение иллюстрируется фигурами 1 и 2.

На фиг. 1 - данные ВЭЖХ суммы таннинов для получения субстанции противоопухолевого препарата «Ханерол», полученного из иван-чая узколистого (Chamaenerium angustifolium (L.) Scop) по предлагаемому способу с использованием солей цинка.

На фиг. 2 - данные ВЭЖХ суммы таннинов для получения субстанции противоопухолевого препарата «Ханерол», полученной известным способом из иван-чая узколистого (Chamaenerion angustifolium (L.) Scop) с использованием солей свинца.

По данным ВЭЖХ исследования образцов, полученных по заявляемому способу и заведомых образцов субстанции «Ханерола», полученных ранее, образцы идентичны по своему составу. ВЭЖХ (фиг. 1 и 2) проводили на спектрографе Agilent Quaternary LC (US) с автомультисемплером, на колонке Eclipse plus 4,5×250 мм С18, зернением 5 мкм, детектирование при длине волны 265±2 нм с использованием фотодиодного детектора G7121B. Образец растворяли в элюенте, концентрация вводимого раствора 1 мг/мл, объем вводимого раствора 5 мкл. Для работы использовали ацетонитрил UN1648 квалификации ChromAR HPLC (Польша), деионизированную воду, очищенную в системе Milipore 0,2 mkm. Хроматографирование проводили в изократическом режиме при термостатировании 40°С, скорости элюирования 2,00 мл/мин в течение 20 мин. Элюент А:В=1:9, где А - 0,04 об. % муравьиновая кислота в ацетонитриле, В - вода.