Результат интеллектуальной деятельности: КОМБИНАЦИЯ РЕТИНОИДА И ЭКСТРАКТА Silybum marianum (L.) Gaertn

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к комбинации ретиноида и экстракта Silybum marianum (L.) Gaertn. (расторопши пятнистой), а также к дерматологической или дермокосметической композиции, предпочтительно - для наружного применения, содержащей такую комбинацию, в частности - предназначенной для лечения акне, себореи, розацеа и/или себорейного дерматита.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Латинское название Silybum marianum (L.) Gaertn. относится к растению (расторопше пятнистой), принадлежащему к семейству Asteraceae, однолетнему или двулетнему, с твердым стеблем, которое может достигать высоты более одного метра. Его крупные, глянцевые, очередные, не имеющие прилистников листья покрыты белыми пятнами и окаймлены твердыми заостренными колючками. Цветки объединены в верхушечные соцветия, часто одиночные. Они окружены крупными колючими прицветниками с очень острыми верхушками. Пятилопастные трубчатые цветки имеют пурпурно-красный цвет. Плоды - это глянцевые, черные или желто-мраморные семянки, у основания окруженные кольцом зубчатых щетинок. Народное название этого растения - молочный чертополох.

Семянки (в литературе часто ошибочно называемые семенами) Silybum marianum (L.) Gaertn. и препараты, приготовленные из них, традиционно применяют перорально для симптоматического лечения функциональных расстройств пищеварения, связанных с нарушением функции печени.

Согласно литературе основным активным ингредиентом семянок Silybum marianum (L.) Gaertn. является силимарин - смесь нескольких флавонолигнанов (преимущественно силибина, изосилибина, силихристина и силидианина). Семянки содержат до 3 масс. % силимарина. Они также содержат масло (от 20 масс. % до 30 масс. %), слизи и белки.

Кроме того, в коже пациентов с акне был обнаружен дефицит витамина А Vahlquist, А. (1985). Vitamin A in skin and serum - studies of acne vulgaris, atopic dermatitis, ichthyosis vulgaris and lichen planus. Br. J. Dermatol. 113(4), 405-413), его сниженный метаболизм описан в сально-волосяном эпителии (Everts, Н.В. (2012). Endogenous retinoids in the hair follicle and sebaceous gland. Biochim. Biophys. Acta 1821(1), 222-229). Ретинальдегид при наружном применении обеспечивает доставку различных компонентов витамина А в кожу человека (Sorg, О., Saurat, J.Н. (2014). Topical retinoids in skin ageing: A focused update with reference to sun induced epidermal vitamin A deficiency. Dermatology 228(4), 314-325) - свойство, которое уже использовали для профилактики и лечения кожи, предрасположенной к акне.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В этом контексте, авторы настоящего изобретения неожиданно продемонстрировали, что ретиноид, такой как ретинальдегид (также называемый ретиналем), в комбинации с экстрактом Silybum marianum демонстрирует улучшенные свойства при лечении акне, себореи, розацеа или себорейного дерматита. В частности, полученные результаты исследований продемонстрировали синергистическую роль ретинальдегида в сочетании с экстрактом Silybum marianum в продукции ретиноидных кислот клетками кожи.

Поэтому объект настоящего изобретения относится к комбинации, содержащей ретиноид и экстракт Silybum marianum (L.) Gaertn.

Другой объект настоящего изобретения относится к комбинации, содержащей ретиноид и экстракт Silybum marianum (L.) Gaertn., для применения в качестве лекарственного средства.

Следующий объект настоящего изобретения относится к комбинации, содержащей ретиноид и экстракт Silybum marianum (L.) Gaertn., для применения при лечении акне, себореи, розацеа и/или себорейного дерматита.

Следующий объект настоящего изобретения относится к применению комбинации, содержащей ретиноид и экстракт Silybum marianum (L.) Gaertn., для производства лекарственного средства для лечения акне, себореи, розацеа и/или себорейного дерматита.

Следующий объект настоящего изобретения относится к применению комбинации, содержащей ретиноид и экстракт Silybum marianum (L.) Gaertn., при лечении акне, себореи, розацеа и/или себорейного дерматита.

Следующий объект настоящего изобретения относится к способу лечения акне, себореи, розацеа и/или себорейного дерматита, включающему введение нуждающемуся в этом лицу эффективного количества комбинации, содержащей ретиноид и экстракт Silybum marianum (L.) Gaertn.

Следующий объект настоящего изобретения относится к дерматологической или дермокосметической композиции, предпочтительно - для наружного применения, содержащей ретиноид и экстракт Silybum marianum (L.) Gaertn. в комбинации с по меньшей мере одним дерматологически или дермокосметически приемлемым вспомогательным веществом.

Следующий объект настоящего изобретения относится к дерматологической или дермокосметической композиции, предпочтительно - для наружного применения, содержащей ретиноид и экстракт Silybum marianum (L.) Gaertn. в комбинации с по меньшей мере одним дерматологически или дермокосметически приемлемым вспомогательным веществом, для применения при лечении акне, себореи, розацеа и/или себорейного дерматита.

Следующий объект настоящего изобретения относится к применению дерматологической или дермокосметической композиции, предпочтительно - для наружного применения, содержащей ретиноид и экстракт Silybum marianum (L.) Gaertn. в комбинации с по меньшей мере одним дерматологически или дермокосметически приемлемым вспомогательным веществом, для лечения акне, себореи, розацеа и/или себорейного дерматита.

Следующий объект настоящего изобретения относится к способу лечения акне, себореи, розацеа и/или себорейного дерматита, включающему введение, предпочтительно - наружное, нуждающемуся в этом лицу эффективного количества дерматологической или дермокосметической композиции, содержащей ретиноид и экстракт Silybum marianum (L.) Gaertn. в комбинации с по меньшей мере одним дерматологически или дермокосметически приемлемым вспомогательным веществом.

Следующий объект настоящего изобретения относится к дерматологической или дермокосметической композиции, предпочтительно - для наружного применения, содержащей:

(i) ретиноид, и

(ii) экстракт Silybum marianum (L.) Gaertn.

в форме комбинации продуктов для одновременного, раздельного или последовательного применения.

Следующий объект настоящего изобретения относится к дерматологической или дермокосметической композиции, предпочтительно - для наружного применения, содержащей:

(i) ретиноид, и

(ii) экстракт Silybum marianum (L.) Gaertn.

в форме комбинации продуктов для одновременного, раздельного или последовательного применения при лечении акне, себореи, розацеа и/или себорейного дерматита.

Следующий предмет настоящего изобретения относится к одновременному, раздельному или последовательному применению ретиноида и экстракта Silybum marianum (L.) Gaertn. при лечении акне, себореи, розацеа и/или себорейного дерматита.

Следующий предмет настоящего изобретения относится к способу лечения акне, себореи, розацеа и/или себорейного дерматита, включающему одновременное, раздельное или последовательное применение эффективного количества ретиноида и эффективного количества экстракта Silybum marianum (L.) Gaertn. нуждающимся в этом лицом.

СВЕДЕНИЯ. ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

В настоящем описании растение Silybum marianum (L.) Gaertn. может быть сокращенно обозначено как Silybum marianum, а ретинальдегид может быть сокращенно обозначен как RAL (от англ.: retinaldehyde).

При использовании в контексте настоящего изобретения термин «жирная кислота» означает карбоновую кислоту R1CO₂H, в которой цепь R1 является линейной или разветвленной углеводородной цепью, насыщенной или содержащей С=С двойные связи, причем карбоновая кислота содержит от 16 атомов углерода до 22 атомов углерода (включая атом углерода в функциональной группе карбоновой кислоты).

При использовании в контексте настоящего изобретения термин «свободная» жирная кислота (включая линолевую кислоту) означает жирную кислоту, не связанную с другими молекулами (например, с глицеролом или его производными с образованием глицеридов или со спиртом с образованием сложного эфира жирной кислоты).

При использовании в контексте настоящего изобретения термин «С₁-С₃ спирт» означает спирт R2OH, у которого цепь R2 является насыщенной, линейной или разветвленной углеводородной цепью, содержащей от 1 атома углерода до 3 атомов углерода. Спирт может быть метанолом, этанолом, н-пропанолом или изопропанолом, в частности - метанолом, этанолом или изопропанолом. Предпочтительно он является изопропанолом.

При использовании в контексте настоящего изобретения термин «дерматологически или дермокосметически приемлемый» означает, что вещество может быть использовано для приготовления дерматологической или дермокосметической композиции, которая в целом является безопасной, нетоксичной и не является нежелательной с биологической или какой-либо иной точки зрения, и которую можно применять для терапевтических или косметических целей, в частности - посредством наружного нанесения.

При использовании в контексте настоящего изобретения термин «около» означает, что соответствующее значение может быть на 10%, в частности - на 5% или 1%, ниже или выше указанного значения.

При использовании в контексте настоящего изобретения термин «сухой экстракт» означает экстракт, который не содержит растворителя, использованного для экстракции, или который содержит лишь незначимые следовые количества растворителя, использованного для экстракции. Соответственно, такой сухой экстракт содержит только материал, происходящий от Silybum marianum (L.) Gaertn. Он может также содержать незначимые следы растворителя, использованного для экстракции.

При использовании в контексте настоящего изобретения термин «изосилибин» означает два диастереоизомера - изосилибин А и изосилибин В.

При использовании в контексте настоящего изобретения термин «силибин», также называемый «силибинином» в данной области техники, означает четыре диастереомера - силибин А, силибин В, 2,3-цис-силибин А и 2,3-цис-силибин В.

При использовании в контексте настоящего изобретения термин «силихристин» означает два диастереомера - силихристин А и силихристин В.

При использовании в контексте настоящего изобретения термин «силимарин» означает очищенный экстракт семянок Silybum marianum (L.) Gaertn., содержащий преимущественно (по меньшей мере 95 масс. %) смеси следующих четырех флавонолигнанов: силибина, изосилибина, силихристина и силидианина (Kuki et al., 2012). Поэтому содержание силимарина менее 0,2 масс. % означает, что общее количество компонентов силимарина составляет менее 0,2 масс. %. Такое содержание можно определить, в частности, посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC; от англ.: high-performance liquid chromatography) или ультравысокоэффективной жидкостной хроматографии (UPLC; от англ.: ultra-high-performance liquid chromatography) посредством расчета общей площади пиков, соответствующих всем компонентам силимарина, в частности - с использованием эталонного образца силимарина, который можно получить, например, из компании Sigma Aldrich, для определения положения этих пиков.

При использовании в контексте настоящего изобретения термин «органический растворитель, не смешивающийся с маслом, полученным из семянок Silybum marianum (L.) Gaertn.» означает органический растворитель, который не способен смешиваться или лишь частично смешивается с маслом, полученным из семянок Silybum marianum (L.) Gaertn., так что смесь органического растворителя или масла, полученного из семянок Silybum marianum (L.) Gaertn., образует гетерогенную смесь, в которой можно наблюдать по меньшей мере две фазы.

При использовании в контексте настоящего изобретения термин «стерин (стерол)» означает молекулу, имеющую стерановое ядро, 3-ий атом углерода которого несет гидроксильную группу ОН; стерановое ядро имеет следующую структуру:

При использовании в контексте настоящего изобретения термин «токоферол» означает α-токоферол, β-токоферол, γ-токоферол и δ-токоферол.

Ретиноид

Ретиноид, используемый в контексте настоящего изобретения, может быть выбран из ретинола, ретинальдегида и ретиноевой кислоты в различных изомерных формах (в частности, транс, 13-цис и 9-цис). Предпочтительно ретиноид является ретинолом или ретинальдегидом. Более предпочтительно ретиноид является ретинальдегидом.

Экстракт Silybum marianum (L.) Gaertn.

Экстракт, используемый в контексте настоящего изобретения, является экстрактом Silybum marianum, и в частности - экстрактом из семянок Silybum marianum.

Согласно частному варианту осуществления настоящего изобретения экстракт по настоящему изобретению содержит менее 0,2 масс. % силимарина, предпочтительно - менее 0,1 масс. % силимарина, в пересчете на массу сухого экстракта.

Согласно частному варианту осуществления настоящего изобретения экстракт по настоящему изобретению содержит по меньшей мере 0,5 масс. % бета-ситостерина, предпочтительно - по меньшей мере 1,0 масс. % бета-ситостерина, в пересчете на массу сухого экстракта. В частности, экстракт по настоящему изобретению содержит от 0,5 масс. % до 2,5 масс. % бета-ситостерина, в частности - от 1,0 масс. % до 2,0 масс. % бета-ситостерина, например - примерно 1,5 масс. % бета-ситостерина, в пересчете на массу сухого экстракта. Предпочтительно экстракт по настоящему изобретению содержит менее 0,2 масс. % силимарина, более предпочтительно - менее 0,1 масс. % силимарина, в пересчете на массу сухого экстракта. Массовое соотношение силимарин/бета-ситостерин в экстракте по настоящему изобретению может быть менее 0,4, в частности - менее 0,07. Экстракт по настоящему изобретению может также содержать от 2 масс. % до 7 масс. % стеринов, в частности - от 3 масс. % до 6 масс. % стеринов, например - от 3 масс. % до 5 масс. % стеринов, в пересчете на массу сухого экстракта.

Согласно другому частному варианту осуществления настоящего изобретения экстракт по настоящему изобретению содержит по меньшей мере 3 масс. % свободной линолевой кислоты, предпочтительно - по меньшей мере 4 масс. % свободной линолевой кислоты, в пересчете на массу сухого экстракта. В частности, экстракт по настоящему изобретению содержит от 3 масс. % до 15 масс. % свободной линолевой кислоты, в частности - от 4 масс. % до 10 масс. % свободной линолевой кислоты, в частности - от 4 масс. % до 6 масс. % свободной линолевой кислоты, например - примерно 5 масс. % свободной линолевой кислоты, в пересчете на массу сухого экстракта. Предпочтительно экстракт по настоящему изобретению содержит менее 0,2 масс. % силимарина, более предпочтительно - менее 0,1 масс. % силимарина, в пересчете на массу сухого экстракта. Экстракт по настоящему изобретению может также содержать от 10 масс. % до 70 масс. % свободных жирных кислот, в частности - от 10 масс. % до 30 масс. % свободных жирных кислот, в частности - от 15 масс. % до 25 масс. % свободных жирных кислот, в пересчете на массу сухого экстракта.

Согласно другому частному варианту осуществления настоящего изобретения экстракт по настоящему изобретению содержит от 0,5 масс. % до 2,5 масс. % бета-ситостерина, в частности - от 1,0 масс. % до 2,0 масс. % бета-ситостерина, например - примерно 1,5 масс. % бета-ситостерина, в пересчете на массу сухого экстракта, и от 3 масс. % до 15 масс. % свободной линолевой кислоты, в частности - от 4 масс. % до 10 масс. % свободной линолевой кислоты, в частности - от 4 масс. % до 6 масс. % свободной линолевой кислоты, например - примерно 5 масс. % свободной линолевой кислоты, в пересчете на массу сухого экстракта. Предпочтительно экстракт по настоящему изобретению содержит менее 0,2 масс. % силимарина, более предпочтительно - менее 0,1 масс. % силимарина, в пересчете на массу сухого экстракта. Массовое соотношение силимарин-бета-ситостерин в экстракте по настоящему изобретению может быть менее 0,4, в частности - менее 0,07. Экстракт по настоящему изобретению может также содержать от 2 масс. % до 7 масс. % стеринов, в частности - от 3 масс. % до 6 масс. % стеринов, например - от 3 масс. % до 5 масс. % стеринов, в пересчете на массу сухого экстракта, и от 10 масс. % до 50 масс. % свободных жирных кислот, в частности - от 10 масс. % до 30 масс. % свободных жирных кислот, в частности - от 15 масс. % до 25 масс. % свободных жирных кислот, в пересчете на массу сухого экстракта.

Экстракт по настоящему изобретению содержит по меньшей мере 0,01 масс. % токоферолов, в частности - по меньшей мере 0,05 масс. % токоферолов, в пересчете на массу сухого экстракта. В частности, экстракт по настоящему изобретению содержит от 0,01 масс. % до 0,5 масс. % токоферолов, в частности - от 0,05 масс. % до 0,2 масс. % токоферолов, например - примерно 0,1 масс. % токоферолов, в пересчете на массу сухого экстракта. Предпочтительно экстракт по настоящему изобретению содержит менее 0,2% силимарина, более предпочтительно - менее 0,1 масс. % силимарина, в пересчете на массу сухого экстракта. Массовое соотношение силимарин/токоферолы в экстракте по настоящему изобретению может быть менее 1, в частности - менее 0,1.

Согласно другому частному варианту осуществления настоящего изобретения экстракт по настоящему изобретению содержит менее 0,2 масс. % силимарина, предпочтительно - менее 0,1 масс. % силимарина, в пересчете на массу сухого экстракта; от 0,5 масс. % до 2,5 масс. % бета-ситостерина, в частности - от 1,0 масс. % до 2,0 масс. % бета-ситостерина, например - примерно 1,5 масс. % бета-ситостерина, в пересчете на массу сухого экстракта; от 3 масс. % до 15 масс. % свободной линолевой кислоты, в частности - от 4 масс. % до 10 масс. % свободной линолевой кислоты, в частности - от 4 масс. % до 6 масс. % свободной линолевой кислоты, например - примерно 5 масс. % свободной линолевой кислоты, в пересчете на массу сухого экстракта; и от 0,01 масс. % до 0,5 масс. % токоферолов, в частности - от 0,05 масс. % до 0,2 масс. % токоферолов, например - примерно 0,1 масс. % токоферолов, в пересчете на массу сухого экстракта. Экстракт по настоящему изобретению может также содержать от 2 масс. % до 7 масс. % стеринов, в частности - от 3 масс. % до 6 масс. % стеринов, например - от 3 масс. % до 5 масс. % стеринов, в пересчете на массу сухого экстракта, и от 10 масс. % до 50 масс. % свободных жирных кислот, в частности - от 10 масс. % до 30 масс. % свободных жирных кислот, в частности - от 15 масс. % до 25 масс. % свободных жирных кислот, в пересчете на массу сухого экстракта. Массовое соотношение силимарин-бета-ситостерин в экстракте по настоящему изобретению может быть, в частности, менее 0,4, в частности - менее 0,07. Массовое соотношение силимарин/токоферолы в экстракте по настоящему изобретению может быть, в частности, менее 1, в частности - менее 0,1.

Предпочтительно экстракт по настоящему изобретению является сухим экстрактом.

Экстракт по настоящему изобретению можно получить посредством экстракции масла, происходящего из семянок Silybum marianum (L.) Gaertn., с использованием экстракционного растворителя, содержащего (в частности, состоящего из этих компонентов) водный гидротропный раствор, субкритическую воду или органический растворитель, не смешивающийся с маслом, происходящим из семянок Silybum marianum (L.) Gaertn., необязательно - в смеси с водой, в частности - органический растворитель, не смешивающийся с маслом, происходящим из семянок Silybum marianum (L.) Gaertn., такой как С₁-С₃ спирт, необязательно - в смеси с водой.

В частности, экстракционный растворитель содержит (в частности, состоит из) метанол, этанол или изопропанол, необязательно - в смеси с водой, в частности - в объемном соотношении органический растворитель/вода, лежащем в диапазоне от 80/20 до 100/0, в частности - от 85/15 до 95/5, в частности, в объемном соотношении, примерно равном 90/10.

Масло из семянок Silybum marianum предпочтительно можно получить посредством экстракции из семянок Silybum marianum (L.) Gaertn. (семянки могут быть цельными или иметь форму кусков), в частности - посредством прессования, предпочтительно - посредством холодного прессования (то есть без нагрева, при комнатной температуре).

Стадию экстракции масла из семянок Silybum marianum можно провести посредством смешивания масла с экстракционным растворителем на период времени, лежащий в диапазоне от 1 часа до 12 часов, в частности - при температуре, лежащей в диапазоне от 15°С до 25°С, в частности - при температуре, примерно равной 20°С. Количество экстракционного растворителя, используемое для проведения этой экстракции, предпочтительно лежит в диапазоне от 0,5 г до 3 г на 1 г масла, более конкретно - в диапазоне от 1 г до 3 г на 1 г масла.

Полученную при этом экстракционную фазу затем отделяют от липидной фазы, после чего ее сушат и выпаривают, частично или полностью, в частности - под вакуумом, чтобы по существу удалить экстракционный растворитель и получить либо сухой экстракт, если растворитель полностью удален, либо концентрированный экстракт, который разбавлен остаточным количеством растворителя.

Комбинация по настоящему изобретению

Комбинация по настоящему изобретению содержит ретиноид, определенный выше, и экстракт Silybum marianum (L.) Gaertn., определенный выше.

Комбинация по настоящему изобретению предпочтительно является комбинацией ретинальдегида в качестве ретиноида с экстрактом Silybum marianum, в частности - с экстрактом из семянок Silybum marianum, по существу не содержащим силимарина, то есть содержащим менее 0,2 масс. % силимарина, предпочтительно - менее 0,1 масс. % силимарина, в пересчете на массу сухого экстракта.

Дерматологические и дермокосметические композиции по настоящему изобретению

Объектом настоящего изобретения также является дерматологическая или дермокосметическая композиция, содержащая по меньшей мере одну комбинацию, определенную выше, в комбинации с по меньшей мере одним дерматологически или дермокосметически приемлемым вспомогательным веществом, более конкретно - предназначенная для наружного применения, в частности - для нанесения на кожу.

Дерматологические и дермокосметические композиции по настоящему изобретению могут быть представлены в традиционных формах для наружного применения, то есть, в частности, в форме лосьонов, пенок, гелей, дисперсий, эмульсий, спреев, сывороток, масок или кремов, содержащих вспомогательные веществ, обеспечивающие, в частности, проникновение через кожу для улучшения свойств и доступности активного начала. Предпочтительно композиция является кремом.

Эти композиции обычно содержат, кроме ингредиентов комбинации по настоящему изобретению, физиологически приемлемую среду, обычно на основе воды или растворителя, например - спиртов, простых эфиров или гликолей. Они могут также содержать поверхностно-активные вещества, комплексообразующие вещества, консерванты, стабилизаторы, эмульгаторы, загустители, гелеобразующие вещества, увлажнители, умягчители, микроэлементы, эфирные масла, отдушки, красители, матирующие агенты, химические или минеральные фильтры, увлажняющие средства, термальные воды и т.п.

Эти композиции также могут содержать другие активные ингредиенты, приводящие к дополнительному или возможному синергистическому эффекту.

Предпочтительно композиции по настоящему изобретению содержат от 0,01 масс. % до 10 масс. %, предпочтительно - от 0,05 масс. % до 5 масс. %, экстракта Silybum marianum по настоящему изобретению (предпочтительно - в пересчете на массу сухого экстракта) от общей массы композиции.

Предпочтительно композиции по настоящему изобретению содержат от 0,001 масс. % до 5 масс. % ретиноида, предпочтительно - от 0,01 масс. % до 1 масс. % ретиноида от общей массы композиции.

Терапевтические применения

Комбинации по настоящему изобретению и дерматологические или дермокосметические композиции по настоящему изобретению можно применять для лечения акне (например, ювенильного акне, также называемого подростковым акне, или позднего акне, которое может быть кистозным), себореи, себорейного дерматита и/или розацеа, предпочтительно - посредством наружного применения, в частности - нанесения на кожу.

Настоящее изобретение проиллюстрировано следующими не ограничивающими его примерами.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1 демонстрирует UPLC хроматограмму экстракта I Silybum marianum, полученного согласно Протоколу 1.

Фиг. 2А, 2В и 2С представляют, соответственно, UPLC хроматограмму экстракта М, экстракта Е и экстракта I Silybum marianum, полученных согласно Протоколу 2.

Фиг. 3А, 3В и 3С представляют, соответственно, 10-22-минутную зону (соответствующую зоне жирных кислот) ГХ-МС хроматограммы (GC/MS; от англ.: gas chromatography-mass spectrometry) экстракта Е, экстракта М и экстракта I Silybum marianum, полученных согласно Протоколу 3.

Фиг. 4А, 4В и 4С представляют, соответственно, 22-28-минутную зону (соответствующую зоне стеринов) ГХ-МС хроматограммы (GC/MS; от англ.: gas chromatography-mass spectrometry) экстракта Е, экстракта М и экстракта I Silybum marianum, полученных согласно Протоколу 3.

Фиг. 5 представляет общее количество ретиноидов, продуцируемых клетками кожи, как функцию полученного лечения, то есть только носителя (ЕtOН), 2 мкМ ретинальдегида (2 мкМ RAL), 50 мкг/мл экстракта Silybum marianum (50 мкг/мл SYL) или комбинации 2 мкМ ретинальдегида и 50 мкг/мл экстракта Silybum marianum (RAL + SYL).

Фиг. 6 представляет общее количество ретиноидов, продуцируемых клетками кожи, как функцию полученного лечения, то есть только носителя (ЕtOН), 2 мкМ ретинола (2 мкМ ROL), 50 мкг/мл экстракта Silybum marianum (50 мкг/мл SYL) или комбинации 2 мкМ ретинола и 50 мкг/мл экстракта Silybum marianum (ROL + SYL).

ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I - Примеры препаратов экстрактов по настоящему изобретению

Изопропанольный экстракт 90 (Экстракт I) получили следующим способом:

- холодное прессование семянок Silybum marianum с получением масла из семянок Silybum marianum,

- экстракция масла, полученного из семянок Silybum marianum, смесью изопропанол/вода (объемное отношение 90/10) с использованием 1 грамма смеси изопропанол/вода на грамм масла в течение 2 часов при 20°С;

- выделение изопропанольной фазы, и

- выпаривание растворителя.

Метанольный экстракт (Экстракт М) и этанольный 90 экстракт (Экстракт Е) получили сходным образом, заменив смесь изопропанол/вода (объемное отношение 90/10) метанолом и смесью этанол/вода (объемное отношение 90/10), соответственно. Экстракцию масла из семянок Silybum marianum выполнили с использованием 3 объемов метанола и 3 объемов смеси этанол/вода (объемное отношение 90/10) на 1 объем масла в течение 2 часов при 20°С, соответственно.

Характеристики этих различных экстрактов определили посредством ультравысокоэффективной жидкостной хроматографии (UPLC) или газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (GC-MS) согласно протоколам, подробно описанным ниже.

Протоколы оценки полученных экстрактов:

1. Протокол 1: Оценка содержания силимарина посредством UPLC

• Приготовление исследуемого образца и контрольного образца

- Контрольный образец силимарина: Приготовить раствор 5 мг силимарина в 10 мл смеси метанол/вода (объемное соотношение 60:40).

- Исследуемый образец:

• Экстракт А: Приготовить раствор 100 мг экстракта, подлежащего анализу, в 10 мл смеси метанол/дихлорметан (объемное соотношение 70:30)

• Экстракты М, Е, I: Нагревать сухой экстракт, подлежащий анализу, до 35°С при перемешивании до получения гомогенного и прозрачного раствора. Точно отвесить 200 мг (ре) экстракта, солюбилизировать его в 10 мл смеси метанола/дихлорметана до полной солюбилизации экстракта и гомогенизировать раствор. Эта смесь варьируется от объемного отношения метанол/дихлорметан, равного 1:1, до чистого метанола.

• Условия анализа:

- Колонка: Acquity ВЕН Shield С18 150 мм × 2,1 мм - 1,7 мкм (производства компании Waters)

- Мобильная фаза:

• А: Вода + 0,1% муравьиной кислоты

• В: Ацетонитрил + 0,1% муравьиной кислоты

- Градиент:

- Температура колонки: 40°С

- Объемная скорость потока: 0,4 мл/мин

- Детектирование: 287 нм

- Инжектируемый объем: 1 мкл

2. Протокол 2: Оценка содержания линолевой кислоты посредством UPLC

• Приготовление исследуемого образца и контрольного образца

- Контрольный образец линолевой кислоты: Приготовить раствор 10 мг линолевой кислоты в 10 мл смеси метанол/дихлорметан (объемное соотношение 1:1).

- Исследуемый образец:

• Экстракты М, Е, I: Нагревать сухой экстракт, подлежащий анализу, до 35°С при перемешивании до получения гомогенного и прозрачного раствора. Точно отвесить 50 мг (ре) экстракта, солюбилизировать его в 1 мл смеси метанола/дихлорметана до полной солюбилизации экстракта и гомогенизировать раствор. Эта смесь варьируется от объемного отношения метанол/дихлорметан, равного 1:1, до чистого метанола.

• Условия анализа:

- Колонка: Acquity ВЕН Shield С18 150 мм × 2,1 мм - 1,7 мкм (производства компании Waters)

- Мобильная фаза:

• А: Вода + 0,1% муравьиной кислоты

• В: Ацетонитрил + 0,1% муравьиной кислоты

- Градиент:

- Температура колонки: 40°С

- Объемная скорость потока: 0,4 мл/мин

- Детектирование: 215 нм

- Инжектируемый объем: 1 мкл

3. Протокол 3: Оценка содержания жирной кислоты и стерина посредством GC-MS

• Приготовление исследуемого образца

- Нагревать сухой экстракт, подлежащий анализу, до 35°С при перемешивании до получения прозрачной гомогенной жидкости.

- Солюбилизировать 20 мг экстракта в 800 мл смеси метанола/дихлорметан (объемное отношение 1:1).

- Добавить 200 мкл дериватизирующего реагента N,O-бис(триметилсилил)трифторацетамид (BSTFA; от англ.: N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide) + триметилхлорсилан (TMCS; от англ.: trimethylchlorosilane) (99:1) (Supelco - производства компании Sigma Aldrich).

- Перемешать с помощью вихревой мешалки в течение 1 минуты.

• Условия газовой хроматографии (GC)

- Колонка: DB-5ms (производства компании Agilent technologies); 30 м × 0,25 мм; 0,25 мкм.

- Инжекция: Т=300°С; режим: деление потока; отношение деления = 100:1

- Термостат: Градиент температуры (°С):

• Начальная температура = 150°С

• Градиент = 7°С/мин до конечной температуры = 340°С

• Поддерживать температуру, равную 340°С, в течение 10 минут

- Объемная скорость потока газа-носителя: 1 мл/мин

- Детектирование: MS-EI (масс-спектрометрия с электронной ионизацией); Т=300°С; время сканирования = 0,2 с; начальная масса полного сканирования = 40; конечная масса полного сканирования=600

- Инжектируемый объем: 1 мкл

Результаты:

Экстракт I содержит преимущественно вещества с временем удержания, лежащим в диапазоне от 13 минут до 30 минут, при UPLC (см. Фиг. 1). Он имеет следующие характеристики:

UPLC и GC/MS хроматограммы 3 экстрактов (экстракты I, М и Е) Silybum marianum были сходными (см. Фиг. 2 и Фиг. 3).

II - Примеры композиций, содержащих ретиноид и/или экстракт Silybum marianum по настоящему изобретению

КОМПОЗИЦИЯ 1 (крем) на основе ретинальдегида = RAL1

КОМПОЗИЦИЯ 2 (крем) на основе ретинальдегида = RAL2

КОМПОЗИЦИЯ 3 (крем) на основе ретинальдегида = RAL3

КОМПОЗИЦИЯ 4 (крем) на основе ретинальдегида = RAL4

Ретинальдегид добавили в количестве 0,1 масс. % в смесь, содержавшую:

5% глицерина

1,5% гелеобразующего агента

1% диоксида кремния

Воды - сколько потребуется.

КОМПОЗИЦИЯ 5 (крем) на основе экстракта Silybum marianum = SYL1

Экстракт I, полученный в Примере 1, добавили в количестве 7 масс. % в смесь изопропанола/ПЭГ 300 (массовое соотношение 1:1).

КОМПОЗИЦИЯ 6 (крем) на основе экстракта Silybum marianum = SYL2 (масс. проценты)

25% SYL1

5% глицерина

1,5% гелеобразующего агента

1% диоксида кремния

Воды - сколько потребуется.

КОМПОЗИЦИЯ 7 (крем), содержащая комбинацию экстракта Silybum marianum и ретинальдегида = ASSO1 (масс. проценты)

25% SYL1

0,1% ретинальдегида

5% глицерина

1,5% гелеобразующего агента

1% диоксида кремния

Воды - сколько потребуется.

КОМПОЗИЦИЯ 8 (крем), содержащая комбинацию экстракта Silybum marianum и ретинальдегида = ASSO2 (масс. проценты)

12,5% SYL1

0,1% ретинальдегида

5% глицерина

1,5% гелеобразующего агента

1% диоксида кремния

Воды - сколько потребуется.

III - Клинические исследования

Различные исследуемые кремы наносили на лицо (очищенную кожу) 2 раза/день утром и вечером посредством легкого массажа, за исключением композиций, содержавших RAL: их наносили только вечером.

Анализ полученных терапевтических эффектов выполнили согласно способу Глобальной оценки исследователем (IGA; от англ.: Investigator Global Assessment), одобренному Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA; от англ.: Food and Drug Administration) для акне и подходящему для розацеа и себорейного дерматита, которую выполняют врачи-дерматологи (Guidance for Industry Acne vulgaris: Developing Drugs for Treatment).

С использованием этого способа установили следующие оценки по шкале IGA в соответствии со степенью тяжести наблюдавшегося акне:

Результаты различных анализов представлены ниже.

Анализ 1: Сравнение состояния до лечения, состояний после лечения экстрактом Silybum marianum без RAL и лечения комбинацией RAL + экстракт Silybum marianum

Анализ 2: Сравнение состояния до лечения, состояний после лечения RAL без экстракта Silybum marianum и лечения комбинацией RAL + экстракт Silybum marianum

Заключение

Результаты, полученные с различными видами лечения, основанными, соответственно, на комбинации ретинальдегида и экстракта Silybum marianum, только ретинальдегида или только экстракта Silybum marianum, в клинических исследованиях, описанных выше, показывают, что ретинальдегид в комбинации с экстрактом Silybum marianum позволяет получить лучший клинический результат.

IV - Исследования in vitro: оценка коррекции дефицита витамина А комбинацией ретинальдегида (RAL) или ретинола (ROD + экстракт Silybum marianum (SYL)

Материалы и методы:

Культура:

• За 3 дня до эксперимента культивировали клетки А431 эпидермоидной карциномы в 2 6-луночных планшетах с плотностью, равной 40000 клеток/ячейку (2 мл/ячейку).

Обработка клеток (3 ячейки для каждого условия, 2 мл/ячейку; конечные концентрации):

• Этанол (растворитель): 1%-ный этанол

• ROL: 10 мкМ ROL в 1%-ном этаноле

• RAL: 2 мкМ RAL в 1%-ном этаноле

• SYL: 50 мкг/мл Экстракта I Silybum marianum в 1%-ном этаноле

• ROL+SYL: 10 мкМ ROL + 50 мкг/мл экстракта Silybum marianum в 1%-ном этаноле

• RAL+SYL: 2 мкМ RAL + 50 мкг/мл экстракта Silybum marianum в 1%-ном этаноле

Инкубация: 1 час

Сбор клеток:

• Удалить среду, дважды промыть фосфатным буферным раствором (PBS; от англ.: phosphate saline buffer);

• Добавить 500 мкл/ячейку ЭДТА-NaOH (0,02% этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) + 200 мкМ NaOH), дать постоять в течение 10-15 минут, затем отделить клетки резиновым скребком и перенести в стеклянные пробирки для экстракции;

• Добавить 10 мкл 20 мМ раствора HCl, обработать ультразвуком в течение непродолжительного времени, затем перенести по 10 мкл суспензии в пробирки Эппендорфа объемом 1,5 мл для определения белка;

• В стеклянные пробирки добавить по 500 мкл 200 мкМ раствора бутилированного гидрокситолуола (ВНТ; от англ.: butylated hydroxytoluene) в этаноле, 20 мкл 20 мкМ раствора ретинилацетата (внутренний стандарт), затем 4 мл гексана;

• Энергично перемешать с использованием вихревой мешалки, затем центрифугировать пробирки (900g, 5 минут);

• Перенести супернатант в открытые стеклянные пробирки, выпарить досуха в атмосфере азота;

• Повторно растворить в 200 мкл метанола, затем перенести во флаконы для высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC).

Анализ на ретиноид посредством HPLC:

• Измерительная цепь для ВЭЖХ Agilent 1100 с насосом для нагнетания четырехкомпонентных смесей и диодно-матричным детектором

• Колонка Nucleodur С₁₈ производства компании Macherey-Nagel, пирамидная, 3 мкм

• Мобильная фаза:

- 0-6 минут: 100%-ный метанол

- 6-8 минут: линейный градиент до метанол/тетрагидрофуран (THF) (4:1)

- 8-18 минут: метанол/THF (4:1)

-18-20 минут: линейный градиент до 100% метанола

- 20-30 минут: 100%-ный метанол

• Детектирование: 325 нм (ретинол, сложные эфиры ретинола); 383 нм (ретиналь).

Результаты:

Полученные результаты представлены на Фиг. 5 и Фиг. 6.

Заключение:

Экстракт Silybum marianum сам по себе не вызвал значимой продукции ретиноида. С другой стороны, клетки кожи продуцировали значимо больше ретиноидов в присутствии комбинации экстракта Silybum marianum с ретинальдегидом или ретинолом, чем в присутствии только ретинальдегида или только ретинола, что демонстрирует синергистический эффект комбинации по настоящему изобретению.