Результат интеллектуальной деятельности: Способ выявления ДНК бактерии Mycobacterium tuberculosis с помощью изотермической петлевой амплификации

Предлагаемое изобретение относится к области биотехнологии и, в частности, к генетической инженерии и может быть использовано для выявления генетического материала (ДНК) бактерии Mycobacterium tuberculosis в диагностических целях.

В течение нескольких столетий туберкулез (ТБ) входит в число самых сложных для лечения и летальных инфекционных заболеваний. Всемирная организация здравоохранения сообщает о почти 53 миллионах умерших с 2000 по 2016 годы. В 2016 было заявлено о 6,3 миллионах новых случаев туберкулеза, что на 200000 больше, чем было зарегистрировано в 2015 г. Своевременная диагностика ТБ абсолютно необходима как для эффективного лечения, так и для карантинных мероприятий, разрывающих пути передачи это контагиозного заболевания.

Классическими лабораторными методами диагностики возбудителя ТБ - бактерий комплекса Mycobacterium tuberculosis (МБТ) - являются микроскопический анализ мазков мокроты, окрашенных по Цилю-Нильсену или с помощью флуоресцентно меченных антител, специфичных к М. tuberculosis, а также изоляция микобактерий с помощью культуральных микробиологических методов. Культуральные методы диагностики ТБ сегодня являются золотым стандартом, однако требуют много времени (до 12 недель) и организационных мероприятий для поддержания адекватного лабораторного пространства.

Этим обусловлена потребность в более быстрых молекулярно-генетических тестах для выявления присутствия М. tuberculosis в клинических образцах и, сегодня, к ним также добавляются тесты для определения лекарственной резистентности возбудителя ТБ.

Уже через четыре года после эпохальной разработки ПЦР в 1985 году этот метод был предложен для выявления МБТ (1). В работе Hance с соавторами амплифицировали фрагмент размером 383 п.о. гена, кодирующего антиген с молекулярным весом около 65 кД (groEL шаперон), общий для микобактерий, с последующим определением вида путем гибридизации с внутренним специфичным радиоактивно меченным олигонуклеотидом (1). В последующие несколько лет разными авторами были предложены другие гены в качестве мишени для диагностического выявления микобактериальной ДНК (2).

Одним из наиболее значимых и интересных для клинической практики является открытие мобильного генетического элемента IS6110 и дальнейшее его использование в качестве мультикопийной мишени для ПЦР с повышенной чувствительностью в отношении выявления микобактерий туберкулеза (3, 4). Элемент IS6110 (GeneBank no. Х52471) является специфичной для туберкулезного комплекса микобактерий инсерционной последовательностью. Практически сразу после его открытия в 1990 году были разработаны олигонуклеотидные праймеры для выявления последовательности IS6110 с помощью ПЦР, которые были описаны (патент ЕР 0490951 В1, опубл. 24.04.1996). Фрагмент IS6110 был в дальнейшем также использован в качестве гибридизационной пробы для молекулярно-эпидемиологического анализа изолятов микобактерий туберкулеза, получив в этом качестве широкое распространение (5). Несмотря на расширение списка генетических мишеней для диагностики ТВ с помощью различных методов амплификаци ДНК: МТВ64 (6), рибосомальной РНК (7), МТВ65 (8) и других (9), IS6110 остается наиболее часто используемой мишенью для диагностических целей ввиду его специфичности и мультикопийности в большинстве описанных к настоящему моменту изолятов МБТ.

Сегодня огромный пласт информации о структуре генома тысяч изолятов микобактерий туберкулеза, публично доступный в международных базах данных, дает уникальную возможность анализа особенностей копийности и консервативности отдельных регионов генома МБТ in silico для оценки их потенциала в качестве мишеней для дизайна молекулярно-диагностических систем (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/).

Способы диагностики МБТ, основанные на использовании ПЦР, получили широкое распространение в клинической практике, однако ПЦР, как таковая, имеет ряд внутренних ограничений, вытекающих из сути метода. Так, ПЦР требует тщательной очистки образцов нуклеиновых кислот от ингибирующих примесей, наличия специальных приборов-амплификаторов и 1-2 часов на проведение реакции. Последнее обстоятельство в условиях высокой нагрузки на диагностические лаборатории является лимитирующим фактором и ограничивает пропускную способность лабораторий, то есть общее количество тестов, проводимых в течение рабочего дня. Таким образом, существует потребность в разработке более быстрых диагностических способов выявления МБТ.

В течение последних 30 лет, по мере общего развития методологической базы молекулярной биологии, было разработано большое количество методов амплификации нуклеиновых кислот, отличных от классической ПЦР. В части из них, для разделения цепей нуклеиновых кислот не используется циклическое нагревание-охлаждение реакционных смесей, такие изотермические методы подразумевают проведение реакции при постоянной температуре (NASBA, RPA, LAMP, HDA, MDA, RCA, SDA и ряд других подходов (10-12). В результате становится возможным отказ от специального приборного обеспечения и проведение анализа с помощью простейших устройств, в том числе вне рамок диагностических лабораторий, непосредственно пациентами или так называемое тестирование у постели больного (point-of-care testing).

Среди известных методов изотермической амплификации, одним из наиболее широко используемых, является изотермическая петлевая амплификация (LAMP, loop-mediated isothermal amplification) (12). В основе LAMP лежит цепь-вытесняющая активность ряда ДНК-полимераз и 2-3 пары олигонуклеотидных праймеров. Как и в случае ПЦР, результаты LAMP могут быть визуализированы с помощью колориметрии, флуоресцентных интеркалирующих красителей или зондов, турбидиметрически или электрохимически, как в режиме реального времени, так и по окончанию реакции. Чувствительность и специфичность LAMP находится на уровне ПЦР, в то время как устойчивость к ингибиторам и скорость реакции (30-40 минут вместо 1-2 часов) у LAMP выше. Метод LAMP применялся при создании тестов для диагностики патогенов человека, домашних животных и культурных растений, в том числе возбудителей гриппа, лихорадки Зика и малярии (13-16).

Наиболее близким к заявляемому способу - прототипом, является способ выявления ДНК бактерии М. tuberculosis путем выделения ДНК из анализируемой пробы, проведения LAMP с двумя наборами праймеров, комплементарных двум участкам генома М. tuberculosis, gyrA и IS6110 и детекции результатов LAMP с помощью турбидиметра. Наличие в пробе ДНК М. tuberculosis устанавливают по изменению количества рассеянного света при увеличении мутности раствора из-за накопления в реакционной смеси пирофосфата магния и продукта амплификации участков генома М. Tuberculosis (патент KR 20170038995 А, опубл. 10.04.2017).

Недостатками данного способа являются его недостаточная точность, связанная с отсутствием возможности определения степени консервативности нуклеотидной последовательности мобильного генетического элемента IS6110, комплементарных праймерам, что может привести к неспособности выявить некоторые штаммы М. tuberculosis, длительность, связанная с низкой скоростью амплификации и высокий предел чувствительности LoD, составляющий 100 фг ДНК М. tuberculosis, что эквивалентно 23 генам-эквивалентам ДНК М. tuberculosis при среднем размере генома 4000 т.п.о.

Задачей изобретения является разработка более быстрого и высокочувствительного способа выявления ДНК М. tuberculosis с помощью изотермической петлевой амплификации наиболее консервативного участка нуклеотидных последовательностей IS6110.

Технический результат: сокращение длительности анализа и повышение чувствительности способа выявления ДНК М. tuberculosis как по количеству выявляемой ДНК, так и по числу выявляемых штаммов М. tuberculosis.

Поставленная задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.

Проводят изотермическую петлевую амплификацию (LAMP) ДНК, выделенной из анализируемой пробы с помощью специально подобранных олигонуклеотидных праймеров, комплементарных консервативным участкам мобильного генетического элемента IS6110 в геномной ДНК М. tuberculosis. Амплификацию фрагмента ДНК осуществляют, используя большой фрагмент Gss-полимеразы. Детекцию результатов амплификации проводят с помощью интеркалирующего флуоресцентного красителя. Непосредственную амплификацию проводят в приборе для ПЦР в реальном времени. Присутствие ДНК М. tuberculosis в анализируемой пробе устанавливают путем анализа результатов амплификации по появлению кривых накопления флуоресценции, соответствующих накоплению продуктов амплификации. Время проведения амплификации составляет 30-40 минут.

В качестве мишени для праймеров LAMP были выбраны наиболее консервативные участки нуклеотидной последовательности IS6110 44-71, 98-122, 179-205, 259-280, 358-381, 487-511, выявленные в результате выравнивания их последовательностей из геномов 3609 изолятов М. tuberculosis, полученных из базы данных Genome NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/166). В качестве референсного генома использовали геном штамма H37Rv (сборка NC_000962.3), в том числе из него была получена последовательность мобильного элемента IS6110 (имеет координаты в референсном геноме 889021-890375). Для поиска последовательности IS6110 в геномах всех исследуемых штаммов применяли программу blastn из пакета NCBI-BLAST+ (версия 2.7.1) (17). Поиск проводили с выявлением последовательностей, перекрывающихся со всей последовательностью IS6110, а также перекрывающихся хотя бы на 15% (около 200 нуклеотидов). Для анализа последовательностей, статистической обработки данных и визуализации полученных результатов использовали собственные Python-скрипты с применением пакетов scipy (18), numpy (19), pandas (20) и matplotlib (21). Праймеры подбирали в соответствии с рекомендациями, размещенными на сайте primerexplorer.jp. Для разработанной системы праймеров для проведения LAMP предсказанная in silico чувствительность, полученная при анализе геномов 3609 изолятов МТ составила 96,9% против 96,4% для праймеров из литературы.

Эффективность амплификации с помощью подобранных праймеров оценивали, проводя LAMP с ДНК-стандартами в виде плазмид, несущих фрагмент IS6110, которые получали с помощью клонирования рестриктазно-лигазным методом, а также с помощью ДНК из клинических изолятов М. tuberculosis. Концентрацию ДНК-стандартов измеряли с помощью цифровой капельной ПЦР на платформе QX200 (Bio-Rad; США).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1

Предел детекции ДНК бактерии М. tuberculosis с помощью LAMP оценивали двумя способами, используя плазмидные стандарты и образцы искусственной мокроты.

В качестве модельных микобактериальных клеток использовали лиофилизированную вакцину БЦЖ-1 (Микроген). Лиофилизат разводили 5 мл стерильного физиологического раствора, для инактивации прогревали 60 мин при 95°С. Суспензию дополнительно гомогенизировали, пропуская 5 раз через иглу 21G, крупные конгломераты клеток осаждали центрифугированием 5 мин при 2000×g. Далее готовили 10-кратные разведения суспензии БЦЖ в физиологическом растворе. Определение концентрации клеток в разведениях осуществляли с помощью метода Виноградского-Брида (22). Бактериальные клетки в мазке окрашивали с помощью метода Циля-Нильсена (Mycobacteriology Laboratory Manual, First Edition, April 2014, https://www.who.int/tb/laboratory/mycobacteriology-laboratory-manual.pdf). Подсчет клеток вели с помощью объектива 100× с масляной иммерсией и окулярной измерительной сеткой.

Искусственная мокрота, содержащая ДНК из спермы лосося, муцин из желудка свиньи (тип II), полный набор L-аминокислот, диэтилентриаминпентауксусную кислоту, (все регенты Sigma, США), NaCl, KCl (хч, производства Реахим, Россия) и эмульсию яичного желтка, была приготовлена, как описано Kirchner с соавторами (23). Полученную искусственную мокроту контаминировали клетками БЦЖ в концентрации 10-10000 клеток на мл и использовали для выделения ДНК. Для этого 200 мкл искусственной мокроты контаминировали клетками БЦЖ и центрифугировали 5 мин при 6000×g. ДНК выделяли из осадка с использованием набора реагентов QIAGEN QIAamp DNA mini kit (QIAGEN, Германия) с небольшими модификациями, ранее описанными в (24). Добавляли стадию ферментативного переваривания в течение 15 мин с добавлением лизоцима 30 мг/мл в буфер для лизиса ткани с последующим кипячением в течение 15 мин, инкубацию с протеиназой К осуществляли при 56°С в течение 1 ч. Далее ДНК очищали в соответствии с рекомендациями производителя.

Плазмидные стандарты, несущие фрагмент IS6110 размером 1342 п.н. для конструирования стандартных образцов амплифицировали с помощью праймеров IS61-cl1b и IS61-cl2b, последовательности которых представлены в таблице 1. Реакционная смесь ПЦР объемом 50 мкл содержала: 1× буфер для Taq- полимеразы (65 мМ Tris-HCl (рН 8,9); 16 мМ (NH₄)₂SO₄; 0,05% Tween 20; 3,5 мМ MgCl₂, 0,2 мМ дНТФ, 50 нг геномной ДНК М. tuberculosis H37Rv, 1 е.а. Taq-полимеразы (Биосан, Россия), 0,5 е.а. Pfu-полимеразы (Биосан, Россия). Амплификацию проводили в амплификаторе «Терцик» (ДНК-технология, Россия) по следующей программе: 3 мин при 95°С начальной денатурации, 30 циклов: 10 с при 95°С для денатурации, 10 с при 60°С для гибридизации праймеров, 60 с при 72°С для элонгации.

Продукты амплификации гидролизовали эндонуклеазой рестрикции HindIII и EcoRI (Сибэнзим, Россия) и лигировали с вектором pBluscriptII SK(+), гидролизованным теми же эндонуклеазами, в течение 3-х часов с 100 е.а. Т4 ДНК-лигазы (Биосан, Россия). Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки Е. coli штамма XL1-Blue (Stratagene, США). У плазмидных клонов, отобранных по результатам рестрикционного анализа, для подтверждения структуры определяли нуклеотидную последовательность вставки секвенированием по методу Сенгера. Секвенирование было выполнено на автоматическом секвенаторе ABI 3130XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) с использованием набора BigDye 3.1 (Центр коллективного пользования «Геномика», ИХБФМ СО РАН). Плазмидные ДНК (pST-IS6110) выделяли из 100 мл ночной культуры в среде LB с помощью QIAGEN Plasmid Midi Kit (QIAGEN, Германия) согласно инструкции фирмы-производителя.

Концентрацию полученных стандартных плазмидных ДНК определяли спектрофотометрически и флюорометрически (набор Qubit™ BR, Invitrogen, США). 2 мкг ДНК подвергали гидролизу эндонуклеазой рестрикции EcoRI (Сибэнзим, Россия) для линеаризации. Полученные линейные стандарты разводили до концентрации 10⁷-1 копий плазмидной ДНК на мкл в стерильном буфере, содержащем 10 мМ Tris-HCl, рН7,6 и полиА РНК (5 нг/мкл). Концентрацию ДНК в полученных стандартах уточняли с использованием цифровой ПЦР на платформе QX100™ Droplet Digital™ PCR System (Bio-Rad, США) согласно инструкциям фирмы-производителя. Для этого готовили 20 мкл ПЦР-смеси, содержащей исследуемую ДНК (<20000 копий на 20 мкл), 1× ПЦР-смесь (Bio-Rad, США), 900 нМ олигонуклеотидные праймеры Lac-U, Lac-R и 250 нМ TaqMan-зонд Lac-P, специфичные для гена бета-лактамазы, содержащегося в плазмиде. Последовательности праймеров и зонда представлены в таблице 1. Для получения микрокапель 20 мкл приготовленной ПЦР-смеси и 70 мкл масла для генерации капель помещали в соответствующие лунки картриджа DG8, который переносили в генератор капель (Bio-Rad, США). 40 мкл полученных микрокаплей переносили в 96-луночный ПЦР-планшет, запечатывали фольгой и помещали в амплификатор. Программа амплификации: 96°С - 10 мин и далее 50 циклов 96°С - 30 сек, 57°С - 60 сек с финальным прогревом в течение 10 мин при 98°С. После этого микрокапли подвергали считыванию с помощью считывателя капель (Bio-Rad, США), полученные данные обрабатывали в программе QuantaSoft (Bio-Rad, США).

LAMP проводили в реакционном объеме 20 мкл, содержавшем 1× реакционный буфер для Bst-полимеразы (20 мМ Tris-HCl рН 8,8, 10 мМ (NH₄)₂SO₄, 150 мМ KCl, 0,1% Tween-20, 2 мМ М MgSO₄), 1,4 мМ каждого дНТФ, по 0,2 мкМ внешних праймеров (IS6-F3/IS6-B3), 0,6 мкМ петлевых праймеров (IS6-LF/IS6-BF), 1,6 мкМ внутренних праймеров (IS6-FIP/ IS6-BIP), последовательности которых представлены в таблице 1, ДНК-матрицу, 2 е.а. Gss-полимеразы из Geobacillus sp. 777 (25), интеркалирующий краситель SYTO-82 до концентрации 1 мкМ. Реакцию проводили в амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, США). Программа включала в себя следующие стадии: отжиг праймеров и элонгацию при температуре 64°С 90 циклов длиной 20 с каждый с регистрацией сигнала флуоресценции на канале HEX; определение температуры плавления продуктов амплификации в диапазоне 70-95°С после амплификации для определения наработанных продуктов амплификации. Результаты изотермической амплификации оценивали по параметру Tt (time-to-threshold - времени до пересечения кривой накопления продукта амплификации порогового значения).

Количество плазмидных стандартов варьировали от 2 до 32 копий на реакцию (2, 4, 8, 16, 32 копии на реакцию), несущих участок IS6110 и линеаризованных эндонуклеазой рестрикции EcoRI. С каждой концентрацией плазмидного стандарта проводили 20 повторов LAMP и рассчитывали LoD (95%), согласно методике Forootan с соавторами (26). Измеренный для LAMP LOD (95%), полученный на ДНК плазмиды с участком IS6110, составил 16 копий на реакцию. Образцы искусственной мокроты контаминировали известным количеством клеток БЦЖ (100, 200, 400, 800 и 1600 бактериальных клеток на мл) в 10 повторах с последующим выделением ДНК, амплификацией и расчетом LOD (90%) согласно методике Forootan с соавторами (26). Измеренный для LAMP LOD (90%), полученный на образцах искусственной мокроты, составил 400 клеток БЦЖ на мл.

Пример 2

Оценку чувствительности LAMP для определения Mycobacterium tuberculosis проводили с помощью коллекции ДНК из 282 позитивных культур.

Клинические изоляты М. tuberculosis были выделены в микробиологической лаборатории НИИТуб г. Новосибирска от пациентов, проживающих в г. Новосибирске и Новосибирской области. При заборе материала соблюдали все биоэтические нормы и было получено одобрение локального комитета по медицинской этике. Грубые лизаты бактериальных клеток получали нагреванием в 300 мкл буфера, содержащего 10 мМ тетраборат натрия и 1% 2-метоксиэатанола, в течение 10 мин при 98°С с последующим центрифугированием для осаждения клеточного дебриса. Выделение геномной ДНК МБТ осуществляли как описано в Eric с соавторами (27).

LAMP проводили в реакционном объеме 20 мкл, содержавшем 1× реакционный буфер для Bst-полимеразы (20 мМ Tris НС1 рН 8,8, 10 мМ (NH₄)₂SO₄, 150 мМ KCl, 0,1% Tween-20, 2 мМ М MgSO₄), 1,4 мМ каждого дНТФ, по 0,2 мкМ внешних праймеров IS6-F3/ IS6-B3), 0,6 мкМ петлевых праймеров (IS6-LF7IS6-BF), 1,6 мкМ внутренних праймеров (IS6-FIP/ IS6-BIP), последовательности которых представлены в таблице 1, ДНК-матрицу, 2 е.а. Gss-полимеразы из Geobacillus sp. 777 (25), интеркалирующий краситель SYTO-82 до концентрации 1 мкМ. Реакцию проводили в амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, США). Программа включала в себя следующие стадии: отжиг праймеров и элонгацию при температуре 64°С 90 циклов длиной 20 с каждый с регистрацией сигнала флуоресценции на канале HEX; определение температуры плавления продуктов амплификации в диапазоне 70-95°С после амплификации для определения наработанных продуктов амплификации. Результаты изотермической амплификации оценивали по параметру Tt (time-to-threshold - времени до пересечения кривой накопления продукта амплификации порогового значения).

С помощью LAMP была выявлена ДНК 280 изолятов МБТ. С помощью секвенирования было установлено, что два негативных изолята не несут инсерционного элемента IS6110.

Пример 3

Оценка клинической диагностической значимости коллекции ДНК из образцов мокроты от пациентов, проживающих в Новосибирской области, собранной в 2012-2013 годах.

ДНК из собранных образцов мокроты выделяли методом, описанным Eric с соавторами (27) и хранили при -70°С до использования. Коллекция составляла 46 образцов положительных в культуральном анализе и 41 образец с отрицательными результатами бактериального посева.

LAMP проводили в реакционном объеме 20 мкл, содержавшем 1× реакционный буфер для Bst-полимеразы (20 мМ Tris-HCl рН 8,8, 10 мМ (NH₄)₂SO₄, 150 мМ KC1, 0,1% Tween-20, 2 мМ M MgSO₄), 1,4 мМ каждого дНТФ, по 0,2 мкМ внешних праймеров IS6-F3/ IS6-B3), 0,6 мкМ петлевых праймеров (IS6-LF/IS6-BF), 1,6 мкМ внутренних праймеров (IS6-FIP/ IS6-BIP), последовательности которых представлены в таблице 1, ДНК-матрицу, 2 е.а. Gss-полимеразы из Geobacillus sp. 777 (25), интеркалирующий краситель SYTO-82 до концентрации 1 мкМ. Реакцию проводили в амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, США). Программа включала в себя следующие стадии: отжиг праймеров и элонгацию при температуре 64°С 90 циклов длиной 20 с каждый с регистрацией сигнала флуоресценции на канале HEX; определение температуры плавления продуктов амплификации в диапазоне 70-95°С после амплификации для определения наработанных продуктов амплификации. Результаты изотермической амплификации оценивали по параметру Tt (time-to-threshold - времени до пересечения кривой накопления продукта амплификации порогового значения).

Из положительных в культуральном анализе образцов с помощью LAMP было определено 40 из 46 образцов (86,9%) как содержащие ДНК МБТ, все негативные по бактериальному посеву образцы были негативными по анализу с помощью LAMP.

Таким образом, разработанный новый способ выявления ДНК бактерии М. tuberculosis с помощью изотермической петлевой амплификации консервативного участка нуклеотидной последовательности мобильного генетиеского элемента IS6110 позволяет детектировать в режиме реального времени генетический материал МБТ в течение 30-40 минут с пределом детекции LoD (95%) не менее 16 геном-эквивалентов МБТ в реакционной смеси.

Источники информации

1. Hance AJ, Grandchamp В, V, Lecossier D, Rauzier J, Bocart D, et al. Detection and identification of mycobacteria by amplification of mycobacterial DNA. Mol Microbiol Mol Microbiol; 1989; 3: 843-9.

2. Tiwari RP, Hattikudur NS, Bharmal RN, Kartikeyan S, Deshmukh NM, Bisen PS. Modern approaches to a rapid diagnosis of tuberculosis: promises and challenges ahead. Tuberculosis (Edinb) 2007; 87: 193-201.

3. Thierry D, A, V, Nguyen S, Guesdon JL, Gicquel B. Characterization of a Mycobacterium tuberculosis insertion sequence, IS6110, and its application in diagnosis. J Clin Microbiol 1990; 28: 2668-73.

4. Eisenach KD, Cave MD, Bates JH, Crawford JT. Polymerase chain reaction amplification of a repetitive DNA sequence specific for Mycobacterium tuberculosis. J Infect Dis 1990; 161: 977-81.

5. Cave MD, Eisenach KD, McDermott PF, Bates JH, Crawford JT. IS6110: conservation of sequence in the Mycobacterium tuberculosis complex and its utilization in DNA fingerprinting. Mol Cell Probes 1991; 5: 73-80.

6. Manjunath N, Shankar P, Rajan L, Bhargava A, Saluja S, Shriniwas. Evaluation of a polymerase chain reaction for the diagnosis of tuberculosis. Tubercle 1991; 72: 21-7.

7. B, Rogall T, Flohr T, H, EC. Detection and identification of mycobacteria by amplification of rRNA. J Clin Microbiol 1990; 28: 1751-9.

8. KIKUCHI Y, OKA S, KIMURA S, MITAMURA K, SHJMADA K. Clinical Application of the Polymerase Chain Reaction for a Rapid Diagnosis of Mycobacterium tuberculosis Infection. Intern Med 1992; 31: 1016-22.

9. Zhao J, Wang Y, Li D, Liu J, Zhang X, He Y, et al. An efficient alternative marker for specific identification of Mycobacterium tuberculosis. World J Microbiol Biotechnol 2014; 30: 2189-97.

10. Compton J. Nucleic acid sequence-based amplification. Nature 1991; 350: 91-2.

11. Fire A, Xu SQ. Rolling replication of short DNA circles. Proc Natl Acad SciUS A 1995; 92: 4641-5.

12. Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res 2000; 28: E63.

13. Yongkiettrakul S, Kampeera J, Chareanchim W, Rattanajak R, Pornthanakasem W, Kiatpathomchai W, et al. Simple detection of single nucleotide polymorphism in Plasmodium falciparum by SNP-LAMP assay combined with lateral flow dipstick. Parasitol Int 2017; 66: 964-71.

14. Global Tuberculosis Programme. The use of loop-mediated isothermal amplification (ТВ-LAMP) for the diagnosis of pulmonary tuberculosis: policy guidance.

15. Guo XG, Zhou YZ, Li Q, Wang W, Wen JZ, Zheng L, et al. Rapid and reliable diagnostic method to detect Zika virus by real-time fluorescence reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. AMB Express 2018; 8.

16. Poon LLM, Leung CSW, Chan KH, Lee JHC, Yuen KY, Guan Y, et al. Detection of human influenza A viruses by loop-mediated isothermal amplification. J Clin Microbiol 2005; 43: 427-30.

17. Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. Basic local alignment search tool. J Mol Biol 1990; 215: 403-10.

18. Oliphant ТЕ. Python for Scientific Computing. Comput Sci Eng 2007;9:10-20.

19. van der Walt S, Colbert SC, Varoquaux G. The NumPy Array: A Structure for Efficient Numerical Computation. Comput Sci Eng 2011; 13: 22-30.

20. McKinney W. Data Structures for Statistical Computing in Python. In: van der Walt S, Millman J, editors. Proc 9th Python Sci Conf 2010. page 51-6.

21. Hunter JD. Matplotlib: A 2D graphics environment. Comput Sci Eng IEEE COMPUTER SOC; 2007; 9: 90-5.

22. Prescott SC, Breed RS. The Determination of the Number of Body Cells in Milk by a Direct Method. Am J Public Hygiene 1910; 20: 663.

23. Kirchner S, Fothergill JL, Wright EA, James CE, Mowat E, Winstanley C. Use of artificial sputum medium to test antibiotic efficacy against Pseudomonas aeruginosa in conditions more relevant to the cystic fibrosis lung. J Vis Exp 2012; e 3857.

24. Aldous WK, Pounder JI, Cloud JL, Woods GL. Comparison of six methods of extracting Mycobacterium tuberculosis DNA from processed sputum for testing by quantitative real-time PCR. J Clin Microbiol 2005; 43: 2471-3.

25. Oscorbin IP, Boyarskikh UA, Filipenko ML. Large Fragment of DNA Polymerase I from Geobacillus sp.777: Cloning and Comparison with DNA Polymerases I in Practical Applications. Mol Biotechnol 2015; 57: 947-59.

26. Forootan A, R, Bjorkman J, B, Linz L, Kubista M. Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR). Biomol Detect Quantif 2017; 12: 1-6.

27. Leung ETY, Zheng L, Wong RYK, Chan EWC, Au TK, Chan RCY, et al. Rapid and simultaneous detection of Mycobacterium tuberculosis complex and Beijing/W genotype in sputum by an optimized DNA extraction protocol and a novel multiplex real-time PCR. J Clin Microbiol 2011; 49: 2509-15.