Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МАСЛЯНОЙ КОМПОЗИЦИИ, ОБОГАЩЕННОЙ ПОЛИНЕНАСЫЩЕННЫМИ ЖИРНЫМИ КИСЛОТАМИ И КАРОТИНОИДАМИ ИЗ МИДИИ M. GALLOPROVINCIALIS

Изобретение относится к области биотехнологии и предназначено для получения масляного раствора витамина Е, обогащенного полиненасыщенными жирными кислотами (ПНЖК) и каротиноидами, для применения как в чистом виде в фармацевтике, так и в производстве косметических и пищевых продуктов.

Известен способ обогащения оливкового масла фукоксантином (Пат. 2716082, РФ, МПК A23D 9/00, 2019), в котором производят смешивание в равных пропорциях спиртовой вытяжки из бурых водорослей рода Cystoseira, содержащей фукоксантин, с дистиллированной водой, оливковым маслом с добавлением поваренной соли, перемешиванием в течение 10 мин с последующим отделением масляной фракции и промыванием дистиллированной водой. Изобретение позволяет получать обогащенное фукоксантином оливковое масло, пригодное к применению как в чистом виде, так и в производстве пищевых продуктов и биологически активных веществ. Недостатком изобретения является большое количество процедур при реализации способа, в результате чего концентрация фукоксантина в масле снижается по сравнению с его концентрацией в спиртовой вытяжке. Обогащение оливкового масла таким ценным природным соединением, как фукоксантин, может значительно увеличить себестоимость полученного продукта.

Известен способ получения биологически активной добавки из асцидии (Пат. 2339387, РФ, МПК A61K 35/56 A23L 1/30, 2007), в котором сырое или высушенное сырье из мантии и/или туники асцидии экстрагируют 96% этанолом или ацетоном в соотношениях сырье - экстрагент: 1 : 1 или 1 : 3 - для сухого сырья и 1 : 5 - для сырого в течение 16-24 часов; полученный экстракт фильтруют, соединяют с маслом и водой в соотношениях: 5 : 1 : 10 - для сырого сырья и 2 : 1 : 4 - для сухого сырья; в темноте проводят реэкстракцию в течение 22-24 часов; отделяют масляный экстракт, промывают его водой и сушат. Недостатками изобретения являются длительное время экстракции и применение ацетона в качестве экстрагента.

Задачей изобретения является расширение ассортимента известных масляных композиций путем насыщения 10% масляного раствора витамина Е полиненасыщенными жирными кислотами и каротиноидами.

Технический результат от решения поставленной задачи проявляется: в получении обогащенного ПНЖК (эйкозапентаеновой (С20:5ω3), докозагексаеновой (С22:6ω3), арахидоновой (С20:4ω6)) и каротиноидами масляного раствора витамина Е, где источником полиненасыщенных жирных кислот и каротиноидов служат гонады или половые продукты мидии M. galloprovincialis; в максимальном сокращении количества процедур при переходе этих веществ из спиртового экстракта в 10% масляный раствор витамина Е в присутствии воды.

Заявленный технический результат достигается путем получения спиртового экстракта из морских гидробионтов, который смешивают с маслом и водой, отделяют масляную фракцию, при этом, в соответствии с изобретением, в качестве сырья для получения спиртового экстракта используют половые продукты (яйцеклетки и сперматозоиды) или гонады мидии М. galloprovincialis, собранные во время массового нереста. Спиртовой экстракт добавляют к 10% масляному раствору витамина Е и заливают водой в соотношении 1 : 1 : 1 соответственно. Смесь перемешивают в течение 5 мин, отстаивают 30-40 мин и отделяют обогащенную ПНЖК и каротиноидами масляную фракцию, не содержащую спирта (с возможным присутствием микроколичеств этилового спирта).

Общим с прототипом является экстракция биологически активных веществ из гидробионтов, насыщение масла путем смешивания в равных частях полученного экстракта, масла и воды. Новым в заявляемом способе является то, что для получения целевого продукта используют 10% масляный раствор витамина Е, спиртовой экстракт из гонад мидии М. galloprovincialis, собранных во время массового нереста моллюсков, или ее половых продуктов и дистиллированной воды; установленное экспериментальным путем соотношение компонентов 1 : 1 : 1, с последующим смешиванием экстракта, 10% масляного раствора витамина Е и дистиллированной воды в течение 5 мин; отстаивание смеси для осуществления процесса перехода ПНЖК и каротиноидов из спиртового экстракта гонад или половых продуктов мидии в 10% масляный раствор витамина Е с последующим отделением обогащенного ПНЖК и каротиноидами масляного раствора витамина Е, не содержащего спирта (с возможным присутствием микроколичеств этилового спирта). Для выделения ПНЖК и каротиноидов достаточно применять или гонады, расположенные у стенок створок, или половые продукты, не используя мясо мидии.

Перечисленные отличительные признаки позволяют сделать вывод о наличии новизны в предлагаемом техническом решении. Проведенные патентные исследования, а также изучение доступных научных публикаций, относящихся к теме изобретения, не обнаружили решений, имеющих признаки, сходных с заявляемым изобретением, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень». Критерий патентоспособности «промышленная применимость» подтверждается примерами конкретного выполнения.

Половые продукты и гонады мидии М. galloprovincialis, находящиеся не преднерестовой и нерестовой стадиях развития, являются ценным сырьевым ресурсом для получения ПНЖК (эйкозапентаеновой (С20:5ω3), докозагексаеновой (С22:6ω3) и арахидоновой (С20:4ω6)), так как содержат достаточное их количество для выделения [3]. ПНЖК являются обязательными компонентами многих клеточных структур всех живых организмов, прежде всего клеточных мембран, пластичность которых преимущественно определяется степенью ненасыщенности жирных кислот, входящих в состав липидов мембран. Изменения в мембранных структурах могут сказываться на водном балансе, ионных потоках и на многих других процессах, протекающих внутри клетки. Функциональная роль полиненасыщенных жирных кислот заключается в нормализации деятельности всех мембранных структур клеток и внутриклеточной передачи информации [7]. ПНЖК оказывают положительное влияние на здоровье человека [10, 11], препятствуют развитию кожных аллергий, сохраняют коллаген - эластичную основу кожи, отвечающую за упругость и отсутствие морщин, ускоряют заживление, обладают антиоксидантным действием [1]. Гонады и половые продукты также служат источником каротиноидов [2], обладающих множеством физиологических и биологических функций, включая их антиоксидантные и противоопухолевые свойства [6], а именно способностью улавливать синглетный кислород и другие радикалы, предотвращая различные заболевания [9, 14]. Витамин Е, входящий в масляный раствор, обладает мощными антиоксидантными свойствами [13].

Суммарное содержание ПНЖК в липидной фракции сперматозоидов, физико-химические свойства которой, в основном, обусловлены наличием в ее составе жирных кислот, достигает 58,8%, а каротиноидов - 0,44±0,28 мг/100 г сухого веса сперматозоидов. В яйцеклетках содержание ПНЖК - 52,4% от суммы всех идентифицированных жирных кислот, а каротиноидов - 4,88±1,51 мг/100 г сухого веса яйцеклеток [2, 3]. Содержание каротиноидов в мужских и женских гонадах мидии М. galloprovincialis одинаково - 2 мг на 100 г сухого веса гонад [2].

Культивируемая мидия Mytilus galloprovincialis из Черного моря представляет коммерческий интерес для получения веществ, обладающих физиологической активностью, особенно в период массового нереста, когда концентрация этих веществ максимальна [4, 5, 6]. У мидии Mytilus galloprovincialis наблюдают два пика нереста: осенью и весной, когда содержание ПНЖК в измельченных тканях мидий со средней длиной 48,58±0,86÷77,52±0,86 мм и средний весом 11,01±0,47÷42,18±4,51 г варьирует от 50,67±0,59% (осенью) до 55,80±1,29% (весной) [12]. Эксперименты, проведенные в ФИЦ ИнБЮМ [3], показали, что во время массового нереста мидии содержание ПНЖК составляет в женских гонадах 33,5%, в мужских - 25,3%, в яйцеклетках - 52,4% и в сперматозоидах - 58,8%.

Содержание каротиноидов в мужских и женских гонадах составляет 2 мг на 100 г сухого веса гонад, в яйцеклетках содержится 5 мг каротиноидов на 100 г сухого веса, в сперматозоидах - 0,4 мг на 100 г сухого веса [2].

Примеры реализации способа.

Пример 1

Из яйцеклеток мидии М. galloprovincialis предварительно получали спиртовой экстракт в соответствии с описанием к патенту [5]. К 50 мл спиртового экстракта яйцеклеток, содержащего ПНЖК и каротиноиды, добавляли 50 мл 10% масляного раствора витамина Е, а затем смесь тщательно перемешивали в течение 5 мин с 50 мл дистиллированной воды и отстаивали 30-40 минут в делительной воронке. После смешения спирта с водой и образования несмешивающейся с водой масляной фракции, удаляли водный слой. В результате получали 50 мл не содержащего спирта (с возможным присутствием микроколичеств этилового спирта) масляного раствора витамина Е, обогащенного ПНЖК (эйкозапентаеновой (С20:5ω3), докозагексаеновой (С22:6ω3), арахидоновой (С20:4ω6)) и каротиноидами. Содержание липидов в яйцеклетках, выраженное в мг/100 г сухого веса, составляло 7,03±5,56% от сухого веса [2]. Сухая масса выметанных одной самкой яйцеклеток составляла 0,36±0,12 г/особь [2]. Сухую массу яйцеклеток определяли после высушивания 1 мл взвеси гомогенизированных яйцеклеток при температуре 105°С [4]. У самок мидии М. galloprovincialis содержание ПНЖК в липидной фракции половых продуктов составляло 52,4% [3]. Жирные кислоты у морских двустворчатых моллюсков встречаются, главным образом, в связанном (этерифицированном) виде в составе эфиров холестерина, ацилглицеролов и фосфолипидов, что составляет примерно 70% от всех липидов [7]. Таким образом, в 0,025 г липидов, содержащихся в яйцеклетках, выметанных одной самкой, содержалось примерно 0,018 г жирных кислот и 0,01 г ПНЖК. Содержание ПНЖК в спиртовом растворе, выраженное в граммах, определяли расчетным методом, исходя из количества мидий, используемых для получения половых продуктов. Количество ПНЖК (г) в готовом продукте определяли по аддитивному принципу, суммируя количество ПНЖК в 10% масляном растворе витамина Е и количество ПНЖК в спиртовом растворе. Количество ПНЖК в 10% масляном растворе витамина Е определяли по количеству ПНЖК в подсолнечном масле, входящего в состав 10% масляном растворе витамина Е. ПНЖК подсолнечного масла преимущественно представлен линолевой (С18:2ω6) кислотой. Так как 100 г подсолнечного масла содержит 3,8 г ПНЖК, в 10% масляном растворе витамина Е содержалось 90 г подсолнечного масла с 3,4 г ПНЖК. В данном примере были получены яйцеклетки от 40 самок (0,4 г ПНЖК), использовали 50 мл 10% масляного раствора витамина Е с исходным содержанием 1,5 г ПНЖК. Массу каротиноидов определяли по количеству каротиноидов в яйцеклетках одной самки и используемому количеству самок. В яйцеклетках, выметанных одной самкой, содержалось 5 мг каротиноидов [2], а в яйцеклетках, выметанными 40 самками - 0,2 г каротиноидов. В результате получили 50 мл масляного раствора витамина Е, обогащенного эйкозапентаеновой (С20:5ω3), докозагексаеновой (С22:6ω3) и арахидоновой (С20:4ω6) полиненасыщенными жирными кислотами с общей массой 0,4 г, содержащими 1,9 г ПНЖК и 0,2 г каротиноидов. Полученный продукт обладал прозрачным цветом с лимонным оттенком, гомогенную консистенцию, вкусом и запахом масла.

Пример 2

Из сперматозоидов мидии М. galloprovincialis предварительно получали спиртовой экстракт в соответствии с описанием к патенту [5]. К 50 мл спиртового экстракта сперматозоидов, содержащего ПНЖК и каротиноиды, добавляли 50 мл 10% масляного раствора витамина Е, затем тщательно перемешивали смесь в течение 5 мин с 50 мл дистиллированной воды. Отстаивали 30-40 минут в делительной воронке. После смешения спирта с водой и образования несмешивающейся с водой масляной фракции, удаляли водный слой. В результате получали 50 мл не содержащего спирта (с возможным присутствием микроколичеств этилового спирта) масляного раствора витамина Е, обогащенного ПНЖК (эйкозапентаеновой (С20:5ω3), докозагексаеновой (С22:6ω3), арахидоновой (С20:4ω6)) и каротиноидами. Содержание липидов в сперматозоидах, выраженное в мг/100 г сухого веса, составляло 6,98±2,30% от сухого веса [2]. Сухая масса выметанных одним самцом сперматозоидов - 0,2±0,16 г/особь [2]. Сухую массу сперматозоидов определяли после высушивания 1 мл взвеси гомогенизированных сперматозоидов при температуре 105°С [4]. Содержание ПНЖК в липидной фракции сперматозоидов составляло 58,8% [3]. В сперматозоидах, выметанными одним самцом, на 0,01 г липидов приходилось примерно 0,007 г жирных кислот и 0,004 г ПНЖК. Содержание ПНЖК в спиртовом растворе, выраженное в граммах, определяли расчетным методом, исходя из количества мидий, используемых для получения сперматозоидов. Количество ПНЖК (г) в готовом продукте определяли, как в способе 1. В данном примере были получены сперматозоиды от 40 самцов, содержащие 0,16 г ПНЖК. Масса каротиноидов в сперматозоидах, выметанных одним самцом - 0,4 мг [2], а 40 самцами - 0,02 г.

В результате получили 50 мл масляного раствора витамина Е, обогащенного эйкозапентаеновой (С20:5ω3), докозагексаеновой (С22:6ω3) и арахидоновой (С20:4ω6) жирными кислотами массой 0,16 г, с общим содержанием ПНЖК 1,66 г, и каротиноидами массой 0,02 г. Полученный продукт обладал прозрачным цветом с лимонным оттенком, гомогенную консистенцию, вкусом и запахом масла.

Пример 3

Из гонад 40 самок мидии М galloprovincialis, окрашенных в ярко-оранжевый цвет, и находящихся на преднерестовой и нерестовых стадиях половой зрелости [8], предварительно получали спиртовой экстракт в соответствии с описанием к патенту [5].

К 50 мл спиртового экстракта гонад, содержащего ПНЖК и каротиноиды, добавляли 50 мл 10% масляного раствора витамина Е, затем смесь тщательно перемешивали в течение 5 мин с 50 мл дистиллированной воды. Отстаивали 30-40 минут в делительной воронке. После смешения спирта с водой и образования несмешивающейся с водой масляной фракции, удаляли водный слой. В результате получали 50 мл не содержащего спирта (с возможным присутствием микроколичеств этилового спирта) масляного раствора витамина Е, обогащенного ПНЖК (эйкозапентаеновой (С20:5ω3), докозагексаеновой (С22:6ω3), арахидоновой (С20:4ω6)) и каротиноидами. Масса липидов в женских гонадах одной самки составляла в среднем 10,68±5,12 мг. Концентрация ПНЖК в липидах гонад одной самки составила 33,5% от всех жирных кислот [3]. Концентрацию ПНЖК в готовом продукте определяли, как в способе 1. Масса всех жирных кислот в гонадах одной самки составила 7,5 мг. Содержание ПНЖК в гонадах одной самки составило 2,5 мг. Содержание ПНЖК в спиртовом растворе определяли расчетным методом, исходя из количества мидий, используемых для получения гонад. В способе 3 для приготовления спиртового экстракта извлекали гонады из 40 самок (0,1 г ПНЖК), использовали, как в способе 1 и 2, 50 мл 10% масляного раствора витамина Е, содержащего 1,5 г ПНЖК. Массу каротиноидов в спиртовом экстракте определяли, как в способе 1 и 2: в гонадах одной самки содержалось 2 мг каротиноидов [2], а в гонадах 40 самок - 0,08 г каротиноидов. Полученный масляный раствор витамина Е имел прозрачный цвет с лимонным оттенком, гомогенную консистенцию, вкус и запах масла и содержал 1,6 г ПНЖК и 0,08 г каротиноидов.

Пример 4

Из гонад 40 самцов мидии М. galloprovincialis, окрашенных в бледный молочно-белый цвет, и находящихся на преднерестовой и нерестовой стадиях половой зрелости [8], предварительно получали спиртовой экстракт в соответствии с описанием к патенту [5].

К 50 мл спиртового экстракта гонад, содержащего ПНЖК и каротиноиды, добавляли 50 мл 10% масляного раствора витамина Е, затем смесь тщательно перемешивали в течение 5 мин с 50 мл дистиллированной воды. Отстаивали 30-40 минут в делительной воронке. После смешения спирта с водой и образования несмешивающейся с водой масляной фракции, удаляли водный слой. В результате получали 50 мл не содержащего спирта (с возможным присутствием микроколичеств этилового спирта) масляного раствора витамина Е, обогащенного ПНЖК (эйкозапентаеновой (С20:5ω3), докозагексаеновой (С22:6ω3), арахидоновой (С20:4ω6)) и каротиноидами. Масса липидов в мужских гонадах одного самца составляла - 3,94±1,32 мг. Масса всех жирных кислот в гонадах одного самца - 2,8 мг. Концентрация ПНЖК в липидах гонад одного самца - 25,3% от всех жирных кислот [3]. Масса ПНЖК в гонадах одного самца - 0,7 мг, а в гонадах 40 самцов - 0,03 г. В гонадах одного самца содержалось 2 мг каротиноидов [2], а в используемых для приготовления спиртового экстракта гонадах 40 самцов - 0,08 г. 50 мл 10% масляного раствора витамина Е, содержало 1,5 г ПНЖК. Количество ПНЖК (г) в готовом продукте рассчитывали, как в способах 1-3. Содержание ПНЖК в готовом продукте составило 1,53 г, а содержание каротиноидов - 0,08 г. Полученный масляный раствор витамина Е имел прозрачный цвет с лимонным оттенком, гомогенную консистенцию, вкус и запах масла.

Масляный раствор витамина Е, обогащенный эйкозапентаеновой (С20:5ω3), докозагексаеновой (С22:6ω3), арахидоновой (С20:4ω6) полиненасыщенными жирными кислотами и каротиноидами, выделяемыми из гонад или половых продуктов мидии М. galloprovincialis, обладает хорошими органолептическими свойствами, способ его получения достаточно прост и экономичен, не требует сложных физико-химических методов исследований. Способ может быть применен для получения функциональных пищевых и косметических добавок на основе витамина Е, обогащенных эйкозапентаеновой (С20:5ω3), докозагексаеновой (С22:6ω3), арахидоновой (С20:4ω6) полиненасыщенными жирными кислотами и каротиноидами, обладающих протекторными, антиоксидантными и противоопухолевыми свойствами.

Источники литературы

1. Гроза Н.В. Терапевтическая роль полиненасыщенных жирных кислот и их производных в патофизиологических процессах / Н.В. Гроза, А.Б. Голованов, Е.А. Наливайко, Г.И. Мягкова // Тонкие химические технологии. - 2012. - Т. 7, №5. - С. 3-16.

2. Иванов В.Н. Содержание липидов и каротиноидов в выметанных половых продуктах черноморской Mytilus galloprovincialis Lam. / В.Н. Иванов, Н.В. Караванцева, М.В. Нехорошее // Морской экологический журнал. - 2009. - Т. 4, №1. - С. 84.

3. Капранова Л.Л. Жирнокислотный состав гонад и половых продуктов двустворчатого моллюска Mytilus galloprovincialis Lam. (1819) из Черного моря на разных стадиях половой зрелости / Л.Л Капранова, М.В. Нехорошев, Л.В Малахова, В.И Рябушко, С.В. Капранов, Т.В. Кузнецова // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. - 2019. - Т. 55, №6. - С. 398-406. doi: 10.1134/S0044452919050085.

4. Никонова Л.Л. Общий тестостерон и эстрадиол в гонадах и половых продуктах двустворчатого моллюска Mytilus galloprovincialis Lam. / Никонова Л.Л., Нехорошев М.В., Рябушко В.И. // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. - 2017. - Т. 53, №6. - С. 459-461.

5. Пат. 2599834, Российская Федерация, МПК A23L/10, A23L 17/50. Способ получения биологически активного вещества из средиземноморской мидии Mytilus galloprovincialis Lam / Никонова Л.Л. (RU), М.В. Нехорошев (RU); заявитель и патентообладатель Институт морских биологических исследований (Россия) - №2014138314/13; заявл. 22.09.2014, опубл. 20.10.2016, Бюл. №29.

6. Пат. 2674033 Российская Федерация, МПК⁷ A61K 35/618, А61Р 35/00. МПК⁷ A61K 35/618, А61Р 35/00. Способ получения вещества из гонад мидий М. galloprovincialis, обладающего противоопухолевой активностью / Капранова Л.Л. (RU), Рябушко В.И. (RU), Нехорошев М.В. (RU), Апрышко Г.И. (RU); заявитель и патентообладатель Институт морских биологических исследований (Россия) - №2017139047; заявл. 09.11.2017, опубл. 04.12.201, Бюл. №34.

7. Фокина Н.Н., Нефедова З.А., Немова Н.Н. Липидный состав мидий Mytilus edulis L. Белого моря. Влияние некоторых факторов среды обитания / Н.Н. Фокина, З.А. Нефедова, Н.Н. Немова. - Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2010. - 243 с.

8. Холодов В.И., Пиркова А.В., Ладыгина Л.В. Выращивание мидий и устриц в Черном море / В.И. Рябушко - Воронеж: ООО "Издатпринт", 2017. - 240 с.

9. Aldini G. Biomarkers for antioxidant defense and oxidative damage / G. Aldini, K. - J. Yeum, E. Niki, R.M. Russell. - John Wiley & Sons, 2011. - 363 p.

10. Calder P.C. Mechanisms of action of (n-3) fatty acids / P.C. Calder // J. Nutr. - 2012. - Vol. 142. - P. 592-599. doi: 10.3945/jn. 111.155259

11. Dembitsky V.M. Allenic and cumulenic lipids / V.M. Dembitsky, T. Maoka // Prog. Lipid Res. - 2007. - Vol. 46. - P. 328-375. doi: 10.1016/j.plipres.2007.07.001

12. The Fatty Acid Composition of Cultured Mussels (Mytilus galloprovincialis Lamarck 1819) in Offshore Longline System in the Black Sea / //Journal of Aquaculture & Marine Biology. - 2015. - Vol. 2, iss. 6, article 00049. doi: 10.15406/jamb. 2015.02.00049

13. Rizvi S. The role of vitamin E in human health and some diseases / S. Rizvi, S.T. Raza, A. Faizal, A. Absar, S. Abbas, and F. Mahdi // Sultan Qaboos University medical journal. - 2014. Vol. 14, iss. 2: el57-e165. PMID: 24790736

14. Stahl W. Photoprotection by dietary carotenoids: Concept, mechanism, evidence and future development / W. Stahl, H. Sies // Molecular Nutrition & Food Research. - 2012. - Vol. 56. - P. 287-295. doi: 10.1002/mnfr.201100232.