Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ ЗЕЛЁНОЙ МИКРОВОДОРОСЛИ DUNALIELLA SALINA ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЕЁ БИОМАССЫ В ПРОМЫШЛЕННЫХ УСЛОВИЯХ

Предлагаемое изобретение относится к биотехнологии микроводорослей и представляет собой стабильный по морфологическим признакам штамм зеленой микроводоросли Dunaliella salina (Dunal) Teodoresco, 1905. Культура Dunaliella salina из Коллекции живых культур планктонных микроводорослей (Научно-образовательного центра коллективного пользования «Коллекция гидробионтов Мирового океана») ФГБУН ФИЦ «Институт биологии южных морей имени А.О. Ковалевского РАН») депонирована в Коллекцию микроводорослей ИФР РАН (IPPAS) под регистрационным номером IPPAS В-2026.

Среди культивируемых в промышленных масштабах микроводорослей Dunaliella salina занимает одну из ведущих позиций по объемам производимой из нее продукции. Биомасса зеленой микроводоросли D. salina является источником биоактивных веществ, обладающих антиоксидантными свойствами, таких как липиды (полиненасыщенные жирные кислоты), каротиноиды (β-каротин, лютеин, зеаксантин и др.), витамины (токоферол) и др. [2]. В отличие от других водорослей, клетки D. salina лишены целлюлозной или пектиновой оболочки и окружены лишь тонкой эластичной протоплазматической мембраной (плазмалеммой), что существенно облегчает усвоение биомассы водоросли или выделение из ее клеток ценных веществ.

Основанием для подачи заявки является штамм Dunaliella salina IPPAS В-2026. Заявляемый штамм Dunaliella salina IPPAS В-2026 адаптирован для промышленного выращивания и позволяет получать ее высокоценную биомассу, являющуюся источником комплекса биологически активных веществ, в том числе β-каротина и других антиоксидантов.

Описание заявляемого штамма Dunaliella salina IPPAS В-2026:

Номенклатурные данные_(по Guiry, M.D. & Guiry, G.M. 2017. AlgaeBase. World-wide electronic publication, National University of Ireland, Galway. http://www.algaebase.org)

Филум: Chlorophyta

Род: Dunaliella

Вид: Dunaliella salina

Исходная культура Dunaliella salina получена из Коллекции культур Института гидробиологии НАН Украины в 2005 г. Новый штамм Dunaliella salina IPPAS В-2026 был выделен в процессе изучения естественной изменчивости исходной культуры путем длительного культивирования в открытых бассейнах при естественном уровне освещенности и температуры. Штамм был стабилен при длительном культивировании и хранении в коллекции по морфологическим признакам (10 лет наблюдений).

Идентифицирован по:

1) Масюк Н.П. Морфология, систематика, экология, географическое распространение рода Dunaliella Teod. K.: Наукова думка, 1973. 245 с. http://bookre.org/reader?file=696246

2) http://www.algaebase.org/search/species/detail/?species_id=Eee3022021f0ac d9e

1. Цитологическое описание штамма:

а) клетки овальные, эллипсоидные, яйцевидные, грушевидные, иногда шаровидные, цилиндрические или веретеновидные; радиально- или билатерально симметричные, редко дорсовентральные или слегка ассиметричные. Размер: ширина 9,58±0,31 мкм, длина 11,84±0,42 мкм, средний объем 513,96±49,18 мкм³, площадь поверхности 315,17±19,87 мкм².;

б) пиреноид один;

в) хроматофор чашевидного типа, чаще всего зеленый, иногда желтый, бурый до красного;

г) на выпуклом апикальном конце клетки два равных жгутика;

д) особенности морфологии при длительном хранении: клетки теряют зеленую окраску, деформируются, образуют цисты бесполого происхождения;

е) особенности морфологии в условиях оптимального роста: клетки имеют широкоовальную с расширенным задним и слегка суженным апикальным концом форму и зеленый оттенок, благодаря наличию хлоропласта, активно передвигаются веслоподобным движением жгутиков;

ж) особенности морфологии в условиях, обеспечивающих максимальный выход β-каротина: клетки, имеют желтую, бурую или красную окраску, округлую форму, могут образовываться цисты бесполого происхождения.

2. Устойчивость культуры:

а) сезонность: устойчива

б) бактерицидность (устойчивость к контаминации): устойчива

в) автолиз: в крайне неблагоприятных условиях

г) агглютинация: при неблагоприятных условиях

3. Условия выращивания штамма:

- модифицированная минеральная питательная среда по [3]:

Компоненты:

NaCl- 120 г/л

KNO₃ - 0,505 г/л

MgSO₄ × 7H₂O - 1,23 г/л

CaCl₂ × 2H₂O - 0,147 г/л

KH₂PO₄ × 3H₂O - 0,038 г/л

Na₂EDTA - 0,04 г/л

FeCl₃ × 6H₂O - 0,00054 г/л

MnC1₂ × 4H₂O - 0,0001 г/л

CuC1₂ × H₂O - 0,0001 г/л

ZnCl₂ × H₂O - 0,0001 г/л

CoCl₂ × 6H₂O - 0,0001 г/л

(NH₄)₆Mo₇O₂₄ × 4H₂O - 0,001236 г/л

NaHCO₃ - 4,2 г/л.

- рН 8 - 9 единиц;

- источник CO₂: гидрокарбонат натрия NaHCO₃, скорость барботажа атмосферным воздухом до 1 л/мин

- температура: 28-30°С

- освещение: круглосуточное при лабораторном выращивании и естественное при промышленном

- освещенность: варьирует в широком диапазоне (от 5 до 100 кЛк) в зависимости от толщины культурального слоя и плотности культуры

- источник света: лампы любого типа (люминесцентные, ДРЛ, диодные) или солнечное освещение.

4. Биохимический состав в оптимальных для роста условиях (% от сухой массы):

а) белок 38-47%

б) углеводы: 21-28%

в) липиды: 15-18%

г) другие соединения: каротиноиды до 1%

Под действием стрессовых факторов (солености, содержания и соотношения отдельных осмотически действующих и биогенных элементов, температуры, освещенности) наблюдаются значительные изменения в биохимическом составе: повышается содержание липидов и каротиноидов (последних до 10%).

Известен Штамм одноклеточных водорослей Dunaliella salina IPPAS 295 -продуцент биологически активных веществ, обладающих антиоксидантной активностью (патент №2497945, С2, RU, дата публикации 10.11.2013). Выделенный штамм одноклеточных водорослей Dunaliella salina IPPAS 295 является продуцентом антиоксидантных веществ и может быть использован как основа для разработки биологически активной добавки, применяемой для непосредственного употребления в пищу в качестве профилактического средства или для создания функциональных пищевых продуктов.

Недостатком этого известного изобретения можно признать выращивание штамма только в малом объеме (50 мл), который недостаточен для апробации его в качестве источника БАД.

Наиболее близким по достигаемому результату является изобретение Термофильный штамм микроводоросли Dunaliella bardawil Masazir для получения биомассы и способ получения биомассы данного штамма (патент №017565, B1, ЕА, дата публикации 30.01.2013), в котором известный штамм получен путем прямого выделения из природного водоема (озера Масазыр) и предназначен для использования в качестве продуцента белково-каротиновой биомассы. Изобретение предназначено для получения и переработки биомассы солеустойчивой микроводоросли Dunaliella bardawil в качестве добавки в корма для птицеводства, животноводства, рыбоводства и шелководства, а также может быть использовано в фармакологии и косметологии.

Выращивание штамма Dunaliella bardawil Masazir ССАР 19/38 происходит методом накопительной культуры на питательной среде с содержанием 3 г/л NaNO₃ и 58 г/л NaCl при естественном освещении. Водоросли выращивают в открытом бетонном резервуаре с глубиной жидкости 0,55 м, шириной 4 м и длиной 10 м либо в стеклотрубном культиваторе объемом 15 л. Бассейн имеет систему сдвижного накрытия прозрачной полимерной пленкой (дугообразная конструкция, в случае необходимости может быть автоматизирована). Перемешивание суспензии микроводорослей осуществляют механически и/или барботированием воздухом. Термостатирование (подогрев) суспензии (культивируемой жидкости) обеспечивают за счет солнечного освещения, а также резервной системы электрообогрева.

Культивирование в трубчатом культиваторе проводят при постоянной облученности лампами ТЗ SLIM SPIRAL Е27 в проточном режиме. Процесс перемешивания осуществлялся микрокомпрессорами. Интенсивность воздухообмена 70 г/л суспензии/ч. Насыщение CO₂ (углекислым газом) осуществляют барботированием смесью воздух: СО₂ - 99,5:0,5. Средний уровень накопления биомассы 0,3-0,5 г асв/л в сутки.

Однако изобретение Термофильный штамм микроводоросли Dunaliella bardawil Masazir для получения биомассы и способ получения биомассы данного штамма имеет некоторые ограничения для использования известного штамма в промышленных масштабах. Наиболее важными из них являются:

а) сравнительно невысокий уровень выхода биомассы известного штамма как при его выращивании в трубчатом фотобиореакторе (4,5-7,5 г/сут), так и в специальных стеклянных лотках (0,4 г/л), а характеристики по продуктивности штамма в открытых бассейнах и содержанию каротиноидов отсутствуют;

б) значительные материальные затраты на изготовление и эксплуатацию трубчатого фотобиореактора, искусственное освещение и дополнительное внесение СО₂ в культуру известного штамма, при его небольшом рабочем объеме (15 л), что, вероятно, не рентабельно для промышленного культивирования,

в) высокие материальные затраты на круглосуточное искусственное освещение и поддержание оптимальной температуры, замену среды в культуре при проточном выращивании и поддержание скорости воздухообмена в установке.

б) более низкая продуктивность с единицы полезной площади (0,8 г СВ⋅м^-2⋅сут^-1) по сравнению с заявляемым изобретением (7 г СВ⋅м^-2⋅сут^-1).

Задачей изобретения Штамм зеленой микроводоросли Dunaliella salina для получения ее биомассы в промышленных условиях является получение штамма, сохраняющего стабильно высокую скорость роста не только в лабораторных условиях при контроле всех параметров выращивания, но и в культиваторах открытого типа при промышленном культивировании в естественно изменяющихся температурных и световых условиях.

Техническим результатом данного изобретения является выращивание адаптированного к промышленным условиям штамма Dunaliella salina Teod. IPPAS В-2026, обеспечивающее:

использование заявляемого штамма, стабильного по своим морфологическим признакам и биохимическому составу в аналогичных условиях выращивания;

- коммерчески значимую продуктивность культуры D. salina по биомассе (7 г СВ⋅м^-2⋅сут^-1);

- содержание каротиноидов к окончанию «зеленой» стадии выращивания не менее 700 мг⋅м"- при соотношении Кар/Хл а не менее 1,8.

Поставленная задача достигается тем, что в изобретении Штамм зеленой микроводоросли Dunaliella salina для получения ее биомассы в промышленных условиях, включающем использование штамма IPPAS В-2026, стабильного по споим морфологическим признакам и адаптированного к выращиванию в культиваторах-открытого-типа, предусмотрены следующие отличия. Культивирование штамма Dunaliella salina Teod. IPPAS В-2026 проводят в бассейнах размером 100x100 см на среде по [3] это общеизвестная среда? в накопительном режиме (фиг. 2Б). При этом рН среды находится в диапазоне 8-9 ед., температура 23-35°С, освещенность от 0 до 100 кЛк (освещение естественное солнечное одностороннее), источником углерода является гидрокарбонат натрия NaHCO₃, а перемешивание культуры осуществляется с помощью водяной помпы «Atman АТ-201» (Chuangxing Electrical Appliances Co., Ltd, Китай).

Для достижения технического результата изобретения культуру зеленой микроводоросли Dunaliella salina штамм IPPAS В-2026 выращивают накопительным способом на среде по [3] в культиваторах открытого типа для достижения коммерчески значимой продуктивности и получения ее биомассы, обогащенной биологически активными веществами.

Общим для прототипа и заявляемого способа является культивирование Dunaliella salina (bardawil) накопительным способом в бассейнах открытого типа. Основные отличия от прототипа заключаются в том, что в отличие от известного, в заявляемом изобретении используется штамм Dunaliella salina IPPAS В-2026, а его продуктивность при выращивании в тепличном модуле, находящимся на базе отдела Биотехнологий и фиторесурсов ФИЦ ИнБЮМ, г. Севастополь, Россия (44°36'54.6''N 33°30'11.7''Е), достигает 7 г СВ/(м²⋅сут), содержание каротиноидов 750 мг⋅м"², а соотношение Кар/Хл а - не менее 1,8.

Заявляемое изобретение поясняется иллюстрациями: Фиг. 1. Общий вид клеток D. salina штамм IPPAS В-2026, Фиг. 2. Общий вид альгобиотехнологического модуля ФИЦ ИнБЮМ (А); выращивание D. salina штамм IPPAS В-2026 в культиваторах открытого типа (Б), Фиг. 3. Динамика плотности культуры (г СВ/м²) D. salina штамм IPPAS В-2026 при ее выращивании в бассейнах и Фиг. 4. Содержание каротиноидов и соотношение Кар/Хл а в культуре D. salina штамм IPPAS В-2026 при культивировании в бассейнах.

Для реализации предлагаемого изобретения и получения биомассы D. salina используют штамм IPPAS В-2026. Выращивание культуры D. salina проводят в бассейнах, находящихся в теплице и имеющих размеры: 100×100×15 см в весенне-летне-осенний период (Фиг. 2Б). Глубина рабочего слоя суспензии составляет 14 см, объем - 140 л, перемешивание осуществляется посредством водяной помпы. Продолжительность культивирования определяется естественными световыми и температурными условиями (до фазы замедления роста культуры), которую выявляют по результатам измерения показателей плотности культуры (например, оптической плотности культуры или содержания сухого вещества (СВ)). Действующими факторами при направленном биосинтезе биомассы D. salina является обеспеченность минеральным и энергетическим субстратом; дефицит элементов минерального питания, повышенная соленость и освещенность способствуют повышению содержания таких ценных компонентов ее биомассы, как β-каротин и липиды.

При выращивании заявляемого штамма D. salina IPPAS В-2026 в августе 2019 г. в тепличном модуле, находящимся на базе отдела Биотехнологий и фиторесурсов ФИЦ ИнБЮМ, получена накопительная кривая роста D. salina в бассейнах глубиной 7 и 14 см, представленная на Фиг. 3. Для определения максимальной продуктивности P_m провели аппроксимацию линейного участка роста уравнением [1]:

B=B₀+P_m⋅t,

где В₀ - начальная плотность культуры.

Значение максимальной продуктивности составило 7 г СВ/(м²⋅сут).

Пример реализации изобретения Штамм зеленой микроводоросли Dunaliella salina для получения ее биомассы в промышленных условиях.

В качестве объекта выращивания используют культуру зеленой микроводоросли Dunaliella salina Teod. штамм IPPAS В-2026.

Получение инокулята (посевного материала). Штамм микроводоросли Dunaliella salina Teod. IPPAS В-2026 до проведения исследования хранят на питательной среде по [3] при Т=25-30°С и освещенности 5-10 кЛк с пересевом каждые 30 суток. Для получения инокулята штамм переносят в среду по [3] и выращивают в течение 7 суток в стеклянных конических колбах объемом 500 мл при освещенности 10-20 кЛк, Т=25-30°С и продувке воздухом со скоростью до 1 л⋅мин^-1⋅л^-1 культуры. Затем культуру D. salina переносят в культиваторы объемом 5 л со свежей средой по [3] и снова культивируют в течение 7 дней при освещенности 10-20 кЛк, Т=25-30°С. Полученную культуру, состоящую из молодых, активно делящихся клеток D. salina штамма IPPAS В-2026 используют в качестве инокулята для засева культиваторов открытого типа в тепличном модуле.

Культуру D. salina штамм IPPAS В-2026 выращивают в альгобиотехнологическом модуле из поликарбоната для защиты от возможных атмосферных осадков и колебаний температуры (Фиг. 2А). Культиваторами служат квадратные бассейны (1×1 м), застеленные полиэтиленовой пленкой, уложенные на выровненную поверхность грунта (Фиг. 2Б). К инокуляту добавляют питательную среду по [3], таким образом, чтобы начальная плотность культуры составляла не менее 0,1 г/л. Высота слоя раствора составляет 14 см, объем культуры - 140 л. D. salina выращивают при естественном уровне освещенности и температуры, и непрерывном перемешивании с помощью аквариумной помпы «Atman АТ-201» (Chuangxing Electrical Appliances Co., Ltd, Китай). Средняя освещенность рабочей поверхности бассейнов в дневной период в летний период составляет 60-80 кЛк, температура культуры на протяжении суток варьирует в диапазоне 25-35°С. При накопительном режиме выращивания систематического внесения биогенных элементов в культуру не происходит, а плотность культуры D. salina увеличивается и достигает максимального значения (Фиг. 3). Накопительное выращивание микроводоросли проводят в бассейнах в течение 4-6 суток (в зависимости от погодных условий) до стадии замедления роста. Общий выход биомассы дуналиеллы при накопительном культивировании определяется конечным сбором биомассы, собираемой из культиваторов по окончании технологического цикла. Продуктивность штамма IPPAS В-2026 в летний период для южных регионов РФ составляет около 7 г СВ/(м²⋅сут), а содержание каротиноидов 700-800 мг м^-2 при соотношении Кар/Хл а - не менее 1,8 (Фиг. 4).

Источники информации, принятые во внимание

1. Тренкеншу Р.П. Простейшие модели роста микроводорослей.

1. Периодическая культура // Экология моря. 2005. Вып. 67. С. 89-97.

2. Demmig-Adams В., Adams W. Antioxidants in photosynthesis and human nutrition // Science. 2002. Vol.2 98, №. 5601. P. 2149-2153.

3. Shaish, A., Avron, M., Ben-Amotz, A. Effect of inhibitors on the formation of stereoisomers in the biosynthesis of (3-carotene in Dunaliella bardawil II Plant and cell physiology. 1990. Vol. 31, №5. P. 689-696.