Результат интеллектуальной деятельности: Способ дифференциальной диагностики глиальных опухолей головного мозга

Изобретение относится к области молекулярной биологии и медицины, в частности к онкологии и нейрохирургии.

В настоящее время актуальной проблемой является не только улучшение результатов лечения пациентов со злокачественными глиомами, но и возможность прогнозирования течения заболевания. Для этого необходима более надежная и достоверная оценка степени злокачественности опухоли, которая влияет на выбор оптимальной тактики комплексного лечения больных (1)

Известен стандартный способ диагностики степени злокачественности опухолей головного мозга, который заключается в гистологическом исследовании ткани опухолевого образования, на основании которого чаще всего ставится окончательный диагноз (2)

Образец ткани опухоли, полученный в момент ее хирургического удаления, фиксируют между предметными стеклами, получая четкий мазок. Далее предметное стекло с отпечатком помещают в фиксатор (формалин).

Впоследствии полученный мазок подсушивают на воздухе (10-15 мин), фиксируют в этаноле 96%, окрашивают гематоксилин-эозином, помещают в бальзам под покровное стекло, а через 24 часа готовят гистологический препарат. В общей сложности на диагностику уходит 4-5 суток. Если позволяет количество материала биопсии, то применяют также цитологические методы исследования, которые, в свою очередь, могут быть использованы для дополнительных методов исследования: иммуноцитохимических, флюоресцентных, электронно-микроскопических.

Существует более современный способ дифференциальной диагностики глиальных опухолей головного мозга человека, основанный на измерении экспрессии 10-ти микроРНК, подобранных так, чтобы их содержание отличалось в различных типах глиом. Затем рассчитывают комплексный коэффициент, который и служит критерием дифференциальной диагностики (3). Этот способ выбран нами в качестве прототипа.

Способ состоит в следующем.

Забор образца опухолевой ткани головного мозга человека осуществляют при операции или с помощью биопсии. Из полученных образцов выделяют суммарный пул РНК (в том числе содержащий и микроРНК) любым пригодным методом выделения нуклеиновых кислот. Далее проводят измерение уровней экспрессии 10 микроРНК, а именно микроРНК-21, -221, -31, -124, -125b, -16, -451, -191, -181b, -223 (диагностируемые микроРНК) в опухолевых образцах методом ОТ-ПЦР в реальном времени (qRT-PCR платформа), позволяющим селективно выявлять зрелые микроРНК с высокой чувствительностью и специфичностью. Метод ОТ-ПЦР включает в себя обратную транскрипцию зрелой микроРНК с помощью длинного праймера со шпилькой с последующей детекцией полученной кДНК с помощью ПЦР в реальном времени. В качестве внутреннего контроля используют малую РНК U58A, которая характеризуется стабильной экспрессией. Сочетание времени и температуры на каждом этапе протокола реакции подбирают специально для эффективной реакции с используемыми олигонуклеотидами (праймерами). Заключение о наличии и типе глиальной опухоли головного мозга составляют на основании значений комплексного критерия (К), рассчитанного на основе значений уровней экспрессии микроРНК в разных типах глиальных опухолей, характеризующихся специфическим профилем экспрессии. Значение критерия, по которому определяют злокачественность образца, получают путем суммирования всех слагаемых, каждое из которых соответствует значению уровня экспрессии конкретной диагностической микроРНК. Если в образце опухолевой ткани головного мозга, из специфического профиля экспрессии 10-ти микроРНК, получено значение К, равное или больше 1, то делают заключение о наличии глиобластомы, если значение К лежит в интервале от 0 до -3, то делают заключение о наличии диффузной астроцитомы, а если значение К меньше либо равно -4, то делают заключение о наличии анапластической астроцитомы.

На наш взгляд прототип обладает следующими недостатками. Использование в качестве маркеров 10-ти микроРНК делает осуществление способа достаточно трудоемким. А последующий расчет комплексного коэффициента К в качестве диагностического критерия чрезмерно усложняет способ. Кроме того прототип рассматривает только материал, относящийся к глиомам астроцитарного происхождения, что сужает возможность применения способа.

Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является упрощение способа дифференциальной диагностики злокачественных опухолей головного мозга и сокращение его трудоемкости.

Предлагаемый способ решения данной задачи заключается в следующем. Производится забор образца опухолевой ткани головного мозга человека при операции или с помощью биопсии. Из полученных образцов выделяют общую РНК любым пригодным методом выделения РНК. Проводят синтез 1-й цепи кДНК в реакции обратной транскрипции. Осуществляют ПЦР в реальном времени с праймерами, подобранными к экзонным участкам генов MELK (F CAAACTTGCCTGCCATATCCT, R GCAAATCACTCCCTAGTGTGTT) и TIE2 (F TGTGCTGTTCCTTCTTGCCTCT, R CCATGGCACCTTCCACAGTTC). Нормализацию производят по трем референсным генам: GUSB (F CTTCTCTGACAACCGACGCC, R ACACCCAGCCGACAAAATGC), GAPDH (F AGATCCCTCCAAAATCAAGTGG, R GGCAGAGATGATGACCCTTTT) и HPRT (F TGAGGATTTGGAAAGGGTGT, R GAGCACACAGAGGGCTACAA). Протокол реакции ПЦР: предварительный прогрев при 95°С - 5 мин, 40 основных циклов: денатурация при 95°С - 10 сек, отжиг и элонгация: 60°С - 30 сек. Измеряют соотношение нормализованных уровней экспрессии генов MELK /ТIЕ2.

Определяющими отличиями заявляемого способа, по сравнению с прототипом, являются:

1) В образцах опухолевой ткани головного мозга измеряют уровни экспрессии экспериментально подобранных 2-х маркерных генов - MELK и TIE2 вместо 10-ти микроРНК по прототипу, что позволяет сократить трудоемкость в сравнении с прототипом

2) Заключение о наличии злокачественной опухоли головного мозга составляют на основании значений индекса экспрессии генов MELK/ TIE2, что по сравнению с прототипом, который предполагает расчет комплексного коэффициента К на основании анализа содержания 10-ти микроРНК, упрощает проведение способа.

Предварительно, для определения и обоснования диагностических значений индекса экспрессии генов MELK/ TIE2 проведен сравнительный анализ материала человеческих биоптатов из тканей глиомы и контрольных образцов. Исследован материал 34 пациентов с глиальными опухолями головного мозга. Диагноз был поставлен на основании морфологических, молекулярно-генетических и клинических исследований. Включение материалла в грейд злокачественности осуществляли на основе рекомендаций WHO-2016. Распределение по группам: II грейд-4, III-12, IV-18.

Контрольную группу составляли 9 пациентов, у которых биопсия была получена при операциях, не связанных с онкологией.

В материале были определены уровни нормализованной экспрессии генов MELK и TIE2, и на их основании рассчитано значение индекса экспрессии MELK/ TIE2.

С помощью корреляционного анализа оценили связь индекса MELK/ TIE2 со степенью злокачественности глиальной опухоли. Для оценки статистической значимости различий между выборками использовали критерий Манна-Уитни.

Найдена достоверная высокая прямая связь между значением индекса уровней экспрессии генов MELK/ TIE2 и степенью злокачественности опухоли: R=0,8497; р<0,0001. При сравнении выборок мы исключили группу грейда II из-за малого объема. Результаты сравнения значений индекса экспрессии генов MELK/ TIE2 по группам пациентов представлены на рисунке 1.

Различия между группами статистически значимы, р<0,01

Для различения групп грейдов III и IV мы выбрали значение индекса экспрессий MELK/ TIE2 равным 400. При значении индекса экспрессий MELK/ TIE2<400 опухоль относится к грейду ниже IV, а значение его более 400 - основание отнести опухоль к грейду IV.

Если ставить диагноз «глиобластома» на основании этого критерия, то наблюдается 8% ложноположительных и 22% ложноотрицательных результатов.

Для дифференцирования контрольной группы от III и IV грейдов злокачественности мы выбрали значение индекса экспрессий MELK/ TIE2 равным 1,8. При значении индекса экспрессий MELK/ TIE2<1,8 ткань не принадлежит группам III и IV грейдов, а при значении более 1,8 - принадлежит. При этом может быть до 17% ложноположительных диагнозов, а ложноотрицательных не обнаружено.

В силу этого предлагаемый способ не следует рассматривать, как замену существующих. Предполагается дополнить им имеющиеся, чтобы повысить точность и оперативность диагностики.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения способа.

Пример 1.

Больной X., 55 лет. Проведена операция по удалению внутримозговой опухоли лобных долей и мозолистого тела. Биоптат опухоли поместили в контейнер со средой DMEM/F12 при 4°С, доставили в лабораторию и обследовали заявленным способом.

Выделение РНК. В микропробирке «Эппендорф» гомогенизировали навеску ткани 100 мг в 200 мкл «ТРI reagent» (MRC, США) пластиковым пестиком, после чего добавили еще 1 мл «ТРI reagent». 10 минут перемешивали на роторном смесителе, затем центрифугировали 5 минут при 10000 об./мин. Отбирали 1 мл супернатанта, смешивали с 200 мкл хлороформа и встряхивали на шейкере 15 сек. В течение 10 минут пробирку оставляли при комнатной температуре, а затем центрифугировали 15 мин при 4°С и 12000 об./мин. Супернатант в объеме 600 мкл смешивали с 700 мкл изопропанола. Пробирку оставляли на столе, а через 10 мин РНК осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 12000 и 4°С. Осадок РНК промывали 75% этанолом, центрифугировали при тех же условиях, высушивали на вакуумном центробежном концентраторе и растворяли в 50 мкл ДЭПК воды с добавлением 1 мкл ингибитора рнк-аз «RiboLock» (Thermo Scientific, США). Определяли концентрацию РНК на спектрофотометре Biowave II (Biochrom Ltd. Великобритания), после чего обрабатывали ДНК-зой DNase I (Thermo Scientific, США) согласно прилагаемому протоколу. Повторяли процедуры осаждения изопропанолом, промывания 75% этанолом, высушивания осадка РНК и растворения в ДЭПК воде. Измеряли концентрацию РНК и оценивали степень ее деградации, проводя электрофорез в 1% агарозном геле.

Реакция обратной транскрипции. Реакцию обратной транскрипции для получения кДНК проводили в объеме 25 мкл. Использовали готовые наборы «MMLV RT kit» (Евроген, Россия). Реакция обратной транскрипции содержала: 2 мкг выделенной РНК, 1 мкл Random-6 праймера, 10 мкл 2,5х Реакционной смеси, 1 мкл (50 ед) обратной транскриптазы MMLV-RT и 0,5 мкл «RiboLock». Реакцию проводили в течение 40 мин при 41°С, после чего реакционную смесь инкубировали 4 мин при 92°С для инактивации обратной транскриптазы. Полученную реакционную смесь, содержащую кДНК, сразу использовали в качестве матрицы для проведения ПЦР.

ПЦР в реальном времени. Измерение уровней экспрессии генов проводили методом ПЦР в реальном времени готовыми наборами реактивов «Набор реагентов для проведения ПЦР-РВ в присутствии красителя SYBR Green I R-402» (СИНТОЛ, Россия) на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad Laboratories, США). Реакцию проводили в объеме 25 мкл согласно протоколу набора, смесь прямого и обратного праймеров в концентрации 1,5 мкМ каждого добавляли в объеме 5 мкл. Ставили каждую реакцию в трех параллельных пробах. Протокол реакции ПЦР: предварительный прогрев при 95°С - 5 мин, 40 основных циклов: денатурация при 95°С - 10 сек, отжиг и элонгация: 60°С - 30 сек.

Нормализованную экспрессию генов MELK и TIE2 рассчитывали, используя программное обеспечение прибора. Значение индекса экспрессии генов MELK /TIЕ2 составило 612. Это значение превышает граничное значение, равное 400, поэтому мы отнесли этот случай к грейду IV. Последующее гистологическое исследование подтвердило наш диагноз - глиобластома, WHO IV grade.

Пример 2.

Больная Г., 60 лет. Прооперирована по поводу опухоли лобной доли головного мозга.

Материал мозга исследован заявленным способом.

Значение индекса экспрессии генов MELK /ТIЕ2 составило 360. Это значение меньше 400, поэтому мы отнесли случай к III грейду злокачественности.

Гистологический анализ впоследствии подтвердил диагноз, у больной анапластическая астроцитома, WHO grade III.

Пример 3.

Больной К., 56 лет. Проведена операция по поводу эпилептических припадков. Операционный материал исследован заявленным способом. Значение индекса экспрессии генов MELK /ТIЕ2 составило 0,41. Это значение меньше, чем 1,8. Следовательно, материал не обладает злокачественностью. Врачами на основании комплексного обследования больному был поставлен диагноз - склероз гиппокампа. Это заболевание не связано со злокачественным новообразованием.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Ступак Е.В. и др. Поиск новых микроРНК-маркеров для дифференциальной диагностики глиом головного мозга различной степени злокачественности // Сибирский научный медицинский журнал. - 2018. - Т. 38. - №. 6.

2. Батороев Ю.К. Цитологическая диагностика опухолей центральной нервной системы, возможности и особенности: возможности и границы применения. Сибирский медицинский журнал. - 2009. - №2. - с. 5-9.

3. Патент РФ 2583871 «СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ГЛИОМ ГОЛОВНОГО МОЗГА ЧЕЛОВЕКА».