Результат интеллектуальной деятельности: Способ культивирования одноклеточных микроводорослей Chaetoceros muelleri и Isochrysis galbana - живого корма для личинок морских беспозвоночных

Изобретение относится к аквакультуре, в частности, к культивированию микроводорослей для использования в качестве живого корма при выращивании личинок морских беспозвоночных в искусственных условиях, в том числе в промышленных масштабах.

Микроводоросли являются единственным полноценным кормом при выращивании личинок морских беспозвоночных в искусственных условиях. На практике применяются накопительный и непрерывный (квазинепрерывный) режимы культивирования микроводорослей. Чаще всего для получения кормовой биомассы используют накопительный режим культивирования, который является наиболее разработанным и изученным. Возможности проточной культуры, особенно в промышленных масштабах, реализованы слабо.

Известен способ культивирования диатомовой водоросли Chaetoceros calcitrans - корма для личинок гигантской устрицы Crassostrea gigas, предусматривающий накопительный режим культивирования в культиваторах закрытого типа (одноразовые полиэтиленовые мешки V=20 л) в течение 11 суток при температуре 22-24°С, освещенности 10 клк, аэрации смесью воздуха и углекислого газа (2%), на модифицированной питательной среде 4F на основе стерильной морской воды. Максимальная концентрация клеток в мешке на 11 сутки составляла 11,22×10⁶ кл/мл и 4,93 г/л сырой биомассы (патент №2663328, МПК A01K 61/00, опубл. 03.08.2018, Бюл. №22).

Недостатком данного способа является культивирование микроводорослей в накопительном режиме, при котором возможно периодическое, каждые 11 суток, получение кормовой биомассы, что неприемлемо при выращивании личинок и молоди (спата) беспозвоночных, когда требуется их ежесуточное, в течение более 25 суток обеспечение живым кормом с постоянным биохимическим составом.

Известен способ культивирования Chaetoceros calcitrans в непрерывном режиме в культиваторах закрытого типа (одноразовые полиэтиленовые мешки диаметром 15 см и объемом 20-40 л) при скорости протока среды 1,0-1,3 сут^-1, на питательной среде F/2 при круглосуточном режиме освещения и освещенности белыми люминесцентными лампами 750-850 лк, температуре 20-23°С, аэрации (0,9 л/мин^-1) смесью воздуха и углекислого газа (1%). Питательную среду готовили на основе пастеризованной природной морской воды соленостью 3,5%. Максимальная концентрация клеток составляла 7-13×10⁶ кл/мл. Для увеличения выхода кормовой биомассы увеличивали количество культиваторов до необходимого объема культуры. Указанный способ подтверждает возможность крупномасштабного получения (до 600 л суспензии) в непрерывном режиме кормовой биомассы для обеспечения живым кормом личинок и спата двустворчатых моллюсков («Continuous production of Chaetoceros calcitrans in a system suitable for commercial hatcheries», H.F. Kaspar, et al., J. Aquaculture, 420-421, 2014, p. 1-9).

Недостатками предложенного способа являются нестабильность продукционных характеристик культур микроводорослей, непредсказуемое снижение (до тысячекратных значений) концентрации клеток в культиваторах с последующим медленным восстановлением численности или полной гибелью культур, уменьшение плотности клеток, сопровождаемое появлением взвешенных хлопьев в суспензии и/или «меха» на внутренней стенке культиватора и изменением биохимического состава получаемой кормой биомассы, вынужденная необходимость оперативного увеличения (до 30%) количества культиваторов для обеспечения кормом выращиваемых организмов.

Наиболее близким к заявляемому техническому решению и достигаемому результату является способ культивирования микроводоросли Dunaliella salina в полунепрерывном (квазинепрерывном) режиме в резервуарах открытого типа (контейнеры площадью 3 м²), при естественном освещении, на открытом воздухе, с использованием питательной среды на основе морской воды соленостью 12,5%, стерилизованную хлором, объеме суспензии 180-360 л с плотностью клеток 0,7-0,9×10⁶ кл/мл. Температура и освещенность в резервуарах не контролировалась, рН культуры поддерживали на уровне 7,5-8,0 путем добавления СО² со скоростью потока 0,2 л мин^-1. Каждые двое суток осуществляли отбор 50% выращенной суспензии и добавляли свежую питательную среду до первоначального объема культуры. При таком режиме культивирования средняя продуктивность биомассы составила 2,4*10¹⁰ клеток с 1 м² в сутки или 1,44 г сухого вещества («Conditions for open-air outdoor culture of Dunaliella salina in southern Spain», M. García-González et al., J. Journal of Applied Phycology, 2003, p. 177-184).

Описываемый способ подтверждает возможность устойчивого непрерывного получения кормовой биомассы микроводорослей в крупномасштабных культиваторах открытого типа, в которых нет возможности создавать стерильные условия при культивировании микроводорослей. Заражение культуры другими микроорганизмами не фиксировалось в связи с тем, что увеличение солености морской воды при подготовке питательной среды до 12,5% (против океанической солености морской воды 3,5%) ограничивает развитие сопутствующей микробиоты. Однако предложенный режим культивирования невозможно применить при выращивании микроводорослей Chaetoceros muelleri и Isochrysis galbana, поскольку эти виды не произрастают в питательной среде с соленостью 12,5%.

Задачей заявленного изобретения является непрерывное получение кормовой биомассы культур микроводорослей Chaetoceros muelleri и Isochrysis galbana с постоянным биохимическим составом и продуктивностью для дальнейшего использования в качестве живого корма при выращивании личинок морских беспозвоночных в течение длительного времени.

Диатомовая водоросль Chaetoceros muelleri и Золотистая водоросль Isochrysis galbana являются оптимальным кормом при выращивании личинок морских беспозвоночных в искусственных условиях благодаря своим морфолого-биохимическим характеристикам. Их размеры, тонкий панцирь, единичность способствуют легкому заглатыванию и быстрому перевариванию личинками морских беспозвоночных. Питательная ценность микроводоросли обусловлена высоким содержанием белка до 38%; липидов до 15%; углеводов до 43% (по сухому веществу) для фазы замедления (или завершающей фазы экспоненциального роста) скорости роста численности клеток в культуре. Кормовая биомасса культуры микроводорослей Chaetoceros muelleri и Isochrysis galbana может быть использована в качестве живого корма для таких морских беспозвоночных, как например, дальневосточный трепанг, приморский гребешок, мидия и гигантская устрица.

Поставленная задача достигается тем, что микроводоросли Chaetoceros muelleri и Isochrysis galbana выращивают в нескольких технологических циклах длительностью, равной 32-м суткам, с их повторением в течение неограниченного времени. Каждый технологический цикл состоит из двух этапов: этапа выращивания инокулята в культиваторах закрытого типа в накопительном режиме (16 сут) и этапа получения кормовой биомассы в культиваторах открытого типа (16 сут), сначала в накопительном режиме (10 сут), затем в квазинепрерывном режиме культивирования (6 сут). Срок начала каждого последующего цикла выращивания водорослей смещен относительно предыдущего на 8 суток.

Культивирование микроводорослей на всех этапах осуществляют в питательной среде F/2, приготовленной на основе очищенной природной морской воды, при круглосуточном освещении светодиодными лампами (4000К), создающими освещенность на поверхности культуры 14-16 клк, температуре 20-23°С, постоянной аэрации воздухом через аквариумный распылитель при скорости продувки 1,0-1,25 л/мин на 1 л культуры. Количество аэраторов для распыления атмосферного воздуха, содержащего 0,03% СО₂ с целью полного его растворения в культуре, определяют из расчета: один аэратор на 400-500 л культуры. При таких условиях аэрации не наблюдается застойных зон в культиваторах и рН среды не превышает 8,9 единиц.

Для приготовления питательной среды F/2 морскую воду подвергают комплексной очистке от растворенных и взвешенных органических веществ, в том числе, и планктона. Сначала морскую воду фильтруют, последовательно пропуская через фильтры с размерами пор 10; 5 и 1 мкм, и доводят ее температуру до 20-23°С. Затем воду хлорируют, избыточно насыщая активным хлором до концентрации 70-90 мг/л путем добавления в нее концентрата гипохлорита натрия, имеющего концентрацию активного хлора 120 г/л. Экспериментально определено, что время воздействия активного хлора на морскую воду не должно превышать 16-18 часов. За это время происходит полное окисление органической составляющей в морской воде. Превышение времени воздействия остаточного хлора приводит к изменению химизма морской воды, и она становится непригодной для выращивания микроводорослей. После полного окисления органической составляющей морскую воду дехлорируют, удаляя остаточный хлор путем внесения в нее пятиводного тиосульфата натрия, из расчета 200-250 мг/л, при активной аэрации воздухом в течение 2-3 часов. Концентрации активного хлора и тиосульфата натрия, которые необходимо создавать при обработке морской моды были определены экспериментально с учетом содержания органической составляющей в используемой природной морской воде.

В качестве культиваторов закрытого типа применяются 0,5; 1; 5-ти литровые стеклянные колбы и 30-ти литровые прозрачные пластиковые емкости, закрытые от контакта с атмосферой прозрачной пленкой. Культиваторы открытого типа представляют собой пластиковые ванны объемом 3 м³ с площадью поверхности 4 м².

При запуске первого цикла для выращивания инокулята используется суспензия водорослей из музейных (коллекционных) культур. При втором и последующих циклах используется суспензия микроводорослей из инокулята предыдущего цикла. Минимальная начальная концентрация клеток, при которой культура начинает активно развиваться с минимальной лаг-фазой, составляет 0,4-0,5×10⁶ кл/мл.

Период культивирования микроводорослей в цикле ограничен по времени, поскольку технически невозможно поддерживать необходимую стерильность культуры при выращивании микроводорослей в крупномасштабных культиваторах открытого типа, т.к. в таких условиях обязательно происходит инфицирование культуры посторонними видами микроорганизмов (бактериями, простейшими или другими видами микроводорослей) и их массовое развитие неизбежно приводит к угнетению и гибели культуры. Массовое развитие сопутствующих видов в культуре наступает после 16-18 суток ее выращивания в культиваторах открытого типа.

Использование квазинепрерывного режима культивирования в технологическом цикле позволяет ежесуточно получать биомассу, которая является полноценным кормом для личинок морских беспозвоночных. При заданном режиме выращивания концентрация клеток микроводорослей восстанавливается до первоначальной, что подтверждает стабильность биологической продуктивности и химического состава культуры микроводорослей.

После последнего отбора кормовой биомассы в любом из циклов выращивания объем культуры не восполняется равноценным объемом свежей питательной среды, а используется в необходимом количестве для кормления личинок беспозвоночных до начала (1 сут) отбора кормовой биомассы из следующего цикла. Оставшаяся часть комовой биомассы в каждом цикле концентрируется центрифугированием и упаковывается под вакуумом в пакеты и сохраняется при температуре 2-3°С для дальнейшего использования в качестве корма для молоди или взрослых особей беспозвоночных.

После завершения первого цикла выращивания освободившаяся ванна замывается, стерилизуется и используется в последующих циклах.

Технический результат достигается за счет культивирования микроводорослей в многократно повторяющихся технологических циклахтаким образом, что после завершения очередного цикла культивирования отбор выращенной биомассы начинают из следующего цикла, это обеспечивает неограниченное по времени ежесуточное получение кормовой биомассы с сохранением стабильного качества микроводорослей во всех циклах.

Способ осуществляют следующим образом.

Технологический цикл начинается с выращивания инокулята в культиваторах закрытого типа в накопительном режиме в течение 16 суток. Для создания начальной концентрации клеток в культуре 0,4-0,5×10⁶ кл/мл используется суспензия микроводорослей из музейной культуры или из инокулята предыдущего цикла выращивания. По мере увеличения концентрации клеток до 1,5-1,7×10⁶ кл/мл, при которой активно делящаяся культура находится на линейной стадии роста, осуществляют разведение культуры до начальной концентрации, путем добавления предварительно подготовленной свежей питательной среды F/2, при этом, объем культиваторов, в которых выращивается культура, увеличивается. При достижении объема инокулята 100 л и концентрации клеток до 1,5-1,7×10⁶ кл/мл, культуру перемещают в культиваторы открытого типа для выращивания кормовой биомассы, куда добавляют свежеприготовленную питательную среду до начальной концентрации клеток 0,4-0,5×10⁶ кл/мл. Далее, в течение 10 суток, культивирование продолжают в накопительном режиме без отбора выращенной биомассы. По мере увеличения концентрации клеток до 1,5-1,7×10⁶ кл/мл, культуру разводят свежей питательной средой до начальной концентрации. При получении объема культуры в ванне 2200 л и концентрации клеток до 1,8-2,0×10⁶ кл/мл, что соответствует фазе замедления (или завершающей фазе экспоненциального роста) скорости роста численности клеток, культуру переводят в завершающий квазинепрерывный режим культивирования. В течение последующих 6 суток, периодически с интервалом в 24 ч, осуществляют отбор 20-25% суспензии микроводорослей и восполняют равноценным объемом свежеприготовленной питательной среды F/2. Культивирование микроводорослей на всех этапах проводят при круглосуточном освещении 14-16 клк и температуре 20-23°С. Культуру непрерывно барботируют воздухом через аквариумные распылители со скоростью продувки 1,0-1,25 л/мин на 1 л культуры, что обеспечивает поддержание рН среды в оптимальном диапазоне 8,5-8,9 единиц.

Выход кормовой биомассы Chaetoceros muelleri и Isochrysis galbana при квазинепрерывном культивировании складывается из ежедневных 20-25% отборов биомассы и биомассы, собираемой из культиваторов по окончании технологического цикла. Объем сливаемой суспензии составляет 440-550 л, число клеток в сливаемой суспензии - (7,92-11)×10¹¹ клеток.

Продуктивность по численности клеток микроводорослей составляет (7,92-11)×10¹¹ кл × ванна^-1 × сут^-1 или (1,98-2,75)×10¹¹ кл × м^-2 × сут^-1.

Продуктивность по сухому весу:

для Chaetoceros calcitrans при сухом весе (с.в.) 1-ой клетки 85×10^-12 г составляет (67,5-93,5) г с.в. × ванна^-1 × сут^-1 или (16,8-23,3) г с.в. × м^-2 × сут^-1;

для Isochrysis galbana при сухом весе (с.в.) 1-ой клетки 19×10^-12 г составляет (15-20,9) г с.в. × ванна^-1 × сут^-1 или (3,75-5,22 г с.в. × м^-2 × сут^-1.

Изобретение подтверждается следующими примерами:

Пример 1

Первый технологический цикл выращивания микроводорослей Chaetoceros muelleri и Isochrysis galbana.

Запуск первого технологического цикла начинали с выращивания инокулята из музейных (коллекционных) культур в накопительном режиме в стеклянных колбах объемом 0,5; 1; 5 и 30-и литровых прозрачных пластиковых емкостях, закрытых от контакта с атмосферой прозрачной пленкой. Для сокращения времени получения необходимого объема инокулята выращивание осуществляли параллельно в четырех культиваторах. Предварительно для культивирования микроводорослей готовили свежую питательную среду из морской воды, которую сначала фильтровали, последовательно пропуская через фильтры с размерами пор 10; 5 и 1 мкм и доводили до температуры 20-23°С. Затем хлорировали, насыщая активным хлором до концентрации 80 мг/л путем добавления в нее концентрата гипохлорита натрия (с концентрацией активного хлора 120 г/л) из расчета 0,67 мл гипохлорита натрия на 1 л морской воды. Через 18 часов воду дехлорировали, внося в нее пятиводный тиосульфат натрия из расчета 200 мг/л, при активной аэрации воздухом в течение 3 часов.

Для адаптации музейных культур микроводорослей к условиям культивирования использовали уровень освещенности 5 клк, который через 7 суток увеличивали до 16 клк. Начальная концентрация клеток и объем культуры составляла 0,45×10⁶ кл/мл и 0,1 л суспензии соответственно. По мере увеличения концентрации клеток до 1,7×10⁶ кл/мл, проводили разведение культуры свежей питательной средой до начальной концентрации, при этом объем выращиваемого инокулята увеличивался и суспензию микроводорослей последовательно перемещали из 0,5-литровых колб в 1-литровые, а далее в 5-литровые колбы. Когда объем суспензии в 5-ти литровых колбах достигал 4,5 л при концентрации клеток 1,7×10⁶ кл/мл, 4,0 литра суспензии переносили в 30-ти литровые емкости и разводили свежей питательной средой до концентрации клеток 0,45×10⁶ кл/мл.

Оставшийся объем 0,5 л использовали при выращивании инокулята в следующем технологическом цикле.

При достижении объема инокулята в четырех 30-ти литровых емкостях до 100 л с концентрацией клеток 1,7×10⁶ кл/мл суспензию микроводорослей переносили в полном объеме в открытую пластиковую ванну объемом 3 м³ с площадью поверхности 4 м², разбавили свежей питательной средой до начальной концентрации клеток 0,45×10⁶ кл/мл и продолжали выращивание кормовой биомассы в накопительном режиме в течение 10 суток. При мере увеличения концентрации клеток в культуре до 1,7×10⁶ кл/мл в ванну добавляли свежую питательную среду, разбавляя до начальной концентрации. При достижении объема культуры до 2200 л и концентрации клеток 2,0×10⁶ кл/мл, культуру переводили в квазинепрерывный режим культивирования. В течение последующих 6 суток, периодически с интервалом в 24 ч, осуществляли отбор 25% суспензии микроводорослей и восполняли равноценным объемом свежей питательной среды. На всех этапах культивирования микроводоросли выращивали при температуре 23°С, постоянной аэрации воздухом через аквариумные распылители при скорости продувки 1,25 л/мин. на 1 л культуры, из расчета: один аэратор на 400-500 л культуры, и рН 8,6.

Объем ежедневно сливаемой суспензии клеток и их количество составили 550 л и 11×10¹¹ клеток соответственно.

Продуктивность по клеткам микроводорослей составила 11×10¹¹ кл × ванна^-1 × сут^-1 или 2,75×10¹¹ кл×м^-2 × сут^-1.

Продуктивность по сухому весу:

для Chaetoceros calcitrans при сухом весе (с.в.) 1-ой клетки 85×10^-12 г составила 93,5 г с.в. × ванна^-1 × сут^-1 или 23,3 г с.в. × м^-2 × сут^-1;

для Isochrysis galbana при сухом весе (с.в.) 1-ой клетки 19×10^-12 г составила 20,9 г с.в. × ванна^-1 × сут^-1 или 5,22 г с.в. × м^-2 × сут^-1.

После завершения первого цикла выращивания освободившаяся ванна замывалась, стерилизовалась и использовалась в последующих циклах.

Пример 2

Второй технологический цикл выращивания микроводорослей Chaetoceros muelleri и Isochrysis galbana.

Для выращивания инокулята использовали 5-ти литровые стеклянные колбы и 30-и литровые прозрачные пластиковые емкости. Для создания начальной концентрации клеток 0,45×10⁶ кл/мл в культуре использовали суспензию микроводорослей (0,5 л) из 5-ти литровых колб первого цикла с концентраций клеток 1,7×10⁶ кл/мл, которую помещали в четыре 5-ти литровые колбы. Дальнейшее выращивание микроводорослей осуществляли так же, как и в первом технологическом цикле. При достижении объема культуры до 2200 л и концентрации клеток 2,0×10⁶ кл/мл, культуру переводили в квазинепрерывный режим культивирования. В течение последующих 6 суток, периодически с интервалом в 24 ч, осуществляли отбор 20% суспензии микроводорослей и восполняли равноценным объемом свежей питательной среды

Объем ежедневно сливаемой суспензии клеток и их количество составили 500 ли 10×10¹¹ клеток соответственно.

Продуктивность по клеткам микроводорослей составила 10×10¹¹ кл × ванна^-1 × сут^-1 или 2,5×10¹¹ кл × м^-2 × сут^-1.

Продуктивность по сухому весу:

для Chaetoceros calcitrans при сухом весе (с.в.) 1-ой клетки 85×10^-12 г составила 85 г с.в. × ванна^-1 × сут^-1 или 21,25 г с.в. × м^-2 × сут^-1;

для Isochrysis galbana при сухом весе (с.в.) 1-ой клетки 19×10^-12 г составила 19 г с.в. × ванна^-1 × сут^-1 или 4,75 г с.в. × м^-2 × сут^-1.