СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ СКОЛИОЗА НА КУРИНОМ ЭМБРИОНЕ

Изобретение относится к области экспериментальной медицины и биотехнологии - создание экспериментальной модели идиопатического сколиоза путем ингибирования экспрессии РАХ3 гена липофильными интерферирующими siPHК в склеротоме куриного эмбриона.

Идиопатический сколиоз - это тяжелейшая патология, поражающая 2-3% детей школьного возраста во всем мире (Sharma et al., 2011). Заболевание характеризуется прогрессирующей в процессе роста клиновидной и торсионной деформацией позвонков, приводящей к искривлению ребер и грудной клетки, при этом страдают органы сердечно-сосудистой и дыхательной систем. В итоге больные с тяжелой деформацией позвоночника становятся инвалидами.

Значительным препятствием для понимания причин и механизмов идиопатического сколиоза является отсутствие экспериментальной модели, позволяющей изучить генетические и биологические механизмы формирования патологии. Не смотря на огромное количество существующих теорий, до сих пор не сформировано представления о генетической природе идиопатического сколиоза. Поэтому создание экспериментальной модели идиопатического сколиоза с целью определения природы патологии является настоятельной необходимостью.

Подробный анализ существующих моделей сколиоза на животных представлен в статье (Bobyn J.D., Little D.G., Gray R., Schindeler A. Animal models of scoliosis. J Orthop. Res. 2015; 33(4):458-467. DOI 10.1002/jor.22797).

Существующие модели идиопатического сколиоза воспроизводят на четверо- и двуногих животных. Последние более точно имитируют позу человека, так как подвержены силе гравитации, что может способствовать развитию сколиоза. Отсутствие силы гравитации на модели четырехногих животных лишены этого преимущества. Модели, созданные на мелких животных, не могут быть сопоставимы со сколиозом человека, так как эти модели в некоторой степени объясняли механизм, но не причину деформации позвоночника.

Двуногие животные, как и люди, подвержены воздействию осевых сил нагрузки на позвоночник, вторичным по отношению к гравитации. Метод резекции ребер, используемый на четвероногих моделях, применяется и у двуногих животных, в частности у курицы (Deguchi М, Kawakami N, Kanemura Т. 1996. Correction of scoliosis by rib resection in pinealectomized chickens. J Spinal Disord 9:207-213; Deguchi M, Kawakami N, Kanemura T, et al. 1995. Experimental scoliosis induced by rib resection in chickens. J Spinal Disord 8:179-185.). Deguchi M. первый применил эту модель к цыплятам, у которых автор резецировал дорсальную часть ребра. Эти результаты согласуются с аналогичными экспериментами на четвероногих животных.

Создание сколиотической деформации путем резекции у цыплят оказалась неэффективным на приматах.

Широко обсуждалась «мелатониновая» модель идиоптического сколиоза. Прогрессирование сколиоза после пинеалэктомии, впервые наблюдалось у кур (Akel I, Kocak О, Bozkurt G, et al. 2009. The effect of calmodulin antagonists on experimental scoliosis: a pinealectomized chicken model. Spine 34:533-538.; Fagan A, Kennaway D, Oakley A. 2009. Pinealectomy in the chicken: a good model of scoliosis? Eur Spine J 18:1154- 1159. no Thillard (Thillard M. 1959. Deformation de la colonne vertebrale consecutives a l'epiphysectomie chez le poussin. Extrait des Comptes Rendus de Г Association des Anatomistes XL VI: 22-26.) в 1959 году. Подопытных цыплят подвергали пинеалэктомии после вылупления и наблюдали развитие деформации позвоночника от 52% до 100%. У таких животных, как курица и грызуны, шишковидная железа более хирургически доступна. Сколиоз у этих животных можно предотвратить с помощью мелатониновой терапии или повторной имплантации шишковидной железы (Fagan A, Kennaway D, Oakley А. 2009. Pinealectomy in the chicken: a good model of scoliosis? Eur Spine J 18:1154- 1159.; Wang X, Jiang H, Raso J, et al. 1997. Characterization of the scoliosis that develops after pinealectomy in the chicken and comparison with adolescent idiopathic scoliosis in humans. Spine 22:2626-2635.).

Недостатком предложенных моделей является формирование сколиоза у взрослых особей при помощи механических и гормональных воздействий (резекция ребер, хирургическое удаление шишковидной железы).

Наиболее близким к предлагаемому способу является модель сколиоза, основанная на исследовании дефицита мелатонина. Deguchi et al. успешно проводил эксперименты, в которых индуцировал сколиотическую деформацию позвоночника у цыплят путем резекции ребер (Deguchi М, Kawakami N, Kanemura Т, et al. 1995. Experimental scoliosis induced by rib resection in chickens. J Spinal Disord 8:179-185.) и пинеалэктомию (Kanemura T, Kawakami N, Deguchi M. 1997. Natural course of experimental scoliosis in pinealectomized chickens. Spine 22:1563-1567). Впоследствии, в когорте пинеалэктомированных цыплят, авторы выполнили резекцию ребра на вогнутой стороне деформации. У цыплят после резекции ребер развился сколиоз легкой степени (6° - 56°) по сравнению с контролем (24° - 85°).

Обсуждаемые модели идиопатического сколиоза предполагают формирование деформации позвоночника у экспериментальных животных путем комбинативной техники (нарушение биомеханики и эндокринные нарушения) без возможности анализа генетического субстратата.

Задача (технический результат предлагаемого изобретения) заключается в создании модели развития сколиоза, свободной от вышеназванных недостатков.

Поставленная задача решается тем, что в способе моделирования идиопатического сколиоза на курином эмбрионе, включающем индуцирование развития сколиоза, индуцирование развития сколиоза осуществляют путем введения в нервную трубку куриного эмбриона на 11 стадии развития по классификации Гамбургер-Гамильтон siPHК к гену РАХ3 в объеме, обеспечивающем полное заполнение нервной трубки.

Время прохождения клеток нервного гребня через склеротом соответствует 11 стадии эмбрионального развития цыпленка, именно на данном этапе ингибирование Рах3 должно приводить к «оседанию» мигрирующих клеток с последующим формированием деформации позвоночника.

Принципиальная новизна настоящего изобретения заключается в создании модели экспериментального сколиоза на двуногих животных (цыпленок), обеспечивающей изучение развития сколиоза на генном уровне.

В Новосибирском НИИТО в процессе исследования 50 случаев идиопатического сколиоза под руководством А.М. Зайдман впервые в мире выявлено наличие клеток нервного гребня на вогнутой стороне деформации позвоночника при идиопатическом сколиозе (A.M. Zaydman, Elena L. Strokova, Elena V. Kiseleva, Lubov A. Suldina, Anton A. Strunov, Alexander I. Shevchenko, Pavel P. Laktionov, Vladimir M. Subbotin. A New Look at Etiological Factors of Idiopathic Scoliosis: Neural Crest Cells. International Journal of Medical Sciences. 2018; 15(5):436-446. doi:10.7150/ijms.22894.) В результате была высказана гипотеза: причиной идиопатического сколиоза является депонирование клеток нервного гребня в формирующемся позвоночнике эмбриона.

Нервный гребень - это совокупность клеток, выделяющихся из дорзальных отделов нервного желобка во время его смыкания в нервную трубку. Клетки нервного гребня образуются практически на всем протяжении замыкающейся нервной трубки - от области промежуточного мозга (Diencephalon) до сакральных отделов ниже уровня 28-го сомита. На стадии гаструляции клетки нервного гребня отделяются от нейроэпителия нервной трубки и начинают активно мигрировать в организме развивающего зародыша. По данным литературных источников выделяют три главных пути движения -первый путь - через передний отдел сомита, второй - дорсо-вентральный и третий - дорсо-латеральный пути. Дорсо-вентральный и дорсо-латеральный пути объединяют в туловищный путь миграции. Дорсо-вентральный путь миграции клеток нервного гребня проходит через склеротом. Клетки уже сформированного склеротома являются эмбриональным зачатком тел позвонков. Контроль за миграцией клеток нервного гребня зависит от экспрессии эмбриональных генов группы Pax (Pax1, Рах3, Рах9), HNK1 и др. Но нарушение миграции по туловищному пути (миграция через склеротом) может быть связано с нарушением экспрессии Рах3 гена, регулирующего синтез матрикса вдоль миграционного пути. Изменение субстрата, по которому продвигаются клетки нервного гребня, может приводить к нарушению их пути продвижения.

Судьба клеток нервного гребня зависит от того места, куда они мигрируют и где оседают (С. Гилберт, 1993). Мигрировавшие клетки нервного гребня дифференцируются в нейроны и глию, формируя симпатическую и парасимпатическую нервную системы.

Депонированные клетки нервного гребня, как в норме так и при патологии, приобретают фенотип клеток, в которых они оседают, но исходный генотип сохраняется. Этим объясняется отсутствие хондрогенной дифференцировки в пластинке роста на вогнутой стороне деформации позвоночника, что приводит к асимметрии роста и формированию сколиоза. Следовательно, заложенные в эмбриогенезе нарушения морфогенеза позвоночника реализуются в сколиотическую болезнь со всеми клиническими и морфологическими признаками.

На основании полученных репрезентативных данных о наличии клеток нервного гребня в пластинках роста тел позвонков больных идиопатическим сколиозом, возникла гипотеза о нарушении экспрессии Рах3 гена как причине депонирования клеток нервного гребня в склеротоме, приводящей к формированию деформации позвоночника. Для изучения генетических причин возникновения деформаций позвоночника необходимо создание адекватной экспериментальной модели на эмбрионе двуногого животного, позволяющей ингибировать экспрессию Рах3 гена и приводить к депонированию клеток нервного гребня в склеротоме и как следствие к формированию деформации позвоночника.

Фертильное куриное яйцо в физиологическом смысле расценивается как обособленная оплодотворенная яйцеклетка, в результате чего модель создается на формирующемся эмбрионе в период миграции клеток нервного гребня. В связи с этим полученные результаты могут быть экстраполированы на эмбрион млекопитающего.

siPHК представляют собой 21 звенные дуплексы с 2 выступающими нуклеотидами на 3'-концах (19 в дуплексе, 2 выступают). Выбор последовательности siPHК, направленной на мРНК гена Рах3 проводили следующим образом. Последовательность мРНК гена Рах3 курицы брали из банка нуклеотидных последовательностей GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/). Последовательности siPHК выбирали исходя из температуры плавления, наличия термодинамической ассимметрии дуплекса, комплементарности антисмысловой цепи мРНК гена-мишени с помощью программ для выбора последовательности siPHК BLOCK-iT™ RNAi Designer (Invitrogen, https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) или siDESIGN Center (Darmacon, https://dharmacon.horizondiscovery.com/design-center/). Для увеличения устойчивости siPHК к действию рибонуклеаз в CpG, Up А, СрА мотивы последовательности вводили 2'-0-метильные модификации как описано нами ранее (Volkov et al., Oligonucleotides, 2009, 31-40). Для определения специфичности действия использовали контрольную siPHК (siScr) не имеющую значимой гомологии с мРНК человека и кур. Все выбранные siPHК были получены синтетически с использованием твердофазного автоматического синтезатора, их биологическая активность была определена по способности подавлять экспрессию гена-мишени в культуре фибробластов кур. Последовательности наиболее активной siPHК и контрольной siPHК были использованы для конструирования холестерин-содержащих конъюгатов. Конъюгат анти- Рах3 siPHК и конъюгат контрольной siScr были получены как описано нами ранее (Petrova et al., Nucleic Acids Research, 2012, 40, 2330-2344). siPHК дуплекс состоит из двух цепей:

смысловая цепь:

антисмысловая цепь:

Где X - остаток холестерина, присоединенный аминогексильным линкером (n=6):

Um, Cm - 2'-O-метильные аналоги уридина и цитидина, соответственно.

siPHК проникает в цитоплазму клетки и связывается с клеточными белками, образуя комплекс RISC (RNA induced silencing complex), после активации этого комплекса, он связывается с комплементарной последовательностью в составе мРНК и находящийся в составе комплекса белок Ago2, обладающий рибонуклеазной активностью, расщепляет мРНК-мишень. После этого комплекс диссоциирует и может взаимодействовать с другой молекулой мРНК, а расщепленная мРНК деградирует. В результате этого снижается концентрация в клетке мРНК-мишени и перестает синтезироваться белок Рах3, который кодируется мРНК-мишенью.

Принципиальной новизной предлагаемой модели является сочетание двуногости модели (цыпленок) и моделирование на генетическом уровне, позволяющее выявить патогенетические механизмы развития деформации позвоночника.

Предлагаемое изобретение поясняется фотографиями, где на фиг. 1-4 представлена последовательность метода: фиг. 1 - куриный эмбрион 11 стадии развития по классификации Гамбургер-Гамильтон, фиг. 2 - введение вещества в нервную трубку куриного эмбриона, фиг. 3 - диффузия вещества в склеротоме, фиг. 4 - куриный эмбрион после введения вещества. На фиг. 5 и 6 представлены результаты компьютерной томограммы (КТ) позвоночника цыпленка, полученного в результате эксперимента.

Реализация предлагаемого способа поясняется примером конкретного выполнения.

Эксперимент проводился в стерильных условиях. Для реализации поставленной задачи, при выполнении эксперимента, скорлупу фертильного куриного яйца и яйца-донора обрабатывали 70% спиртом. Далее экспериментальное яйцо укладывали на подложку горизонтально, делали прокол стерильной иглой с вертикальной стороны, далее стерильными хирургическими ножницами делали отверстие в размере 0,8×1,5 см, отрезанную скорлупу убирали. Также удаляли подскорлуповую оболочку. Визуально при вскрытии контролировали развитие эмбриона и при достижении 11 стадии по классификации Гамбургер-Гамильтон отбирали яйцо для проведения эксперимента, не достигшие 11 стадии яйца в эксперимент не включали. На фиг. 1 видна полость нервной трубки 1 эмбриона. При помощи инжекторного шприца фирмы NARISHAGE и стеклянного капилляра под визуальным контролем через конфокальный микроскоп фирмы (Ziess Discovery V12 SteREO) в нервную трубку 1 куриного эмбриона 11 стадии развития по классификации Гамбургер-Гамильтон вводили siPHК, визуально контролируя заполнение нервной трубки до мозговых пузырей при помощи микроскопа фирмы (Ziess Discovery V12 SteREO) на увеличении 90. Введенная в полость нервной трубки 1 липофильная siPHК хорошо видна на фиг. 2. Для лучшей визуализации siPHК была предварительно подкрашена трепановым синим. На фиг. 3 визуализируется полная диффузия введенной siPHК в склеротоме. На фиг. 4 хорошо видно, что анатомическая целостность эмбриона и нервной трубки 1 сохранены.

Из скорлупы яйца-донора стерильными ножницами вырезали фрагмент для закрытия отверстия на скорлупе экспериментального яйца. После выполнения манипуляций накладывали и закрепляли крышечку из скорлупы яйца-донора вместе с подскорлуповой оболочкой. Оставляли на сутки дефектом вверх, после чего ротировали яйцо в соответствии с физиологией развития куриного эмбриона.

Дальнейшее развитие эмбриона показало, что ингибирование Рах3 гена на 11 стадии эмбриогенеза по Гамбургер-Гамильтон приводит к остановке в склеротоме клеток нервного гребня. Механизм ингибирования Рах3: siRNA блокирует участок мРНК, с которого считывается синтез белка, обеспечивающего миграцию клеток нервного гребня. В результате клетки нервного гребня оседают в склеротоме - зачатке тела позвонка. Клетки нервного гребня в зоне локализации принимают фенотип малодифференцированных хондроцитов. Но генотип остается нейральным. Нейральные клетки генетически не подвергаются дифференцировке, пролиферации и, соответственно, росту, как это происходит в склеротоме - зоне локализации хондроцитов. Нарушение роста в зоне депонирования клеток нервного гребня приводит к ассиметрии роста, что является причиной возникновения сколиоза, которая представлена на КТ.