Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ИММУНОГЕННОСТИ ВАКЦИОННОГО ШТАММА ЧУМНОГО МИКРОБА

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологии и иммунологии, и может быть использовано для усиления иммуногенности вакцинного штамма чумного микроба для применения в изготовлении медицинских иммунобиологических препаратов.

Профилактика чумы - особо опасной инфекционной болезни с природной очаговостью, возбудитель которой Yersinia pestis относится к микроорганизмам I группы патогенности, предусматривает проведение комплекса многоплановых профилактических мероприятий, включая вакцинацию, которая внесена в календарь профилактических прививок по эпидемическим показаниям [1]. За рубежом отсутствуют лицензированные вакцины для специфической профилактики чумы [2]. В России единственным препаратом, используемым для специфической профилактики чумы, является вакцина чумная живая на основе вакцинного штамма чумного микроба Yersinia pestis EV линии НИИЭГ, вызывающая развитие иммунитета длительностью до 1 года, что обусловливает необходимость проведения ежегодной ревакцинации прививаемого контингента [1, 3]. В этой связи большую значимость приобретают разработки эффективных способов повышения иммуногенных и протективных свойств вакцины чумной живой при снижении дозы вводимого антигена и реактогенности.

Иммуногенные свойства вакцины определяются биологическими свойствами вакцинного штамма чумного микроба, входящего в ее состав, поэтому поиск новых способов усиления иммуногенности вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, включая прямое действие адъювантов на его биологические свойства, с одновременным уменьшением трудоемкости и ускорением способа за счет исключения использования живого организма (анимализация) и клеточных культур (перитонеальные макрофаги, клеточные линии) является актуальной задачей.

Известен способ получения препарата на основе вакцинного штамма чумного микроба [4], предусматривающий на начальном этапе биотехнологического процесса получение пассированной стабилизированной стартовой культуры (ПССК) с повышенными иммуногенными свойствами, для приготовления которой проводят последовательные трехкратные тестикулярные пассажи эталонной культурой вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ через организм восприимчивых животных (морских свинок).

Пассированную микробную культуру стерильно выделяют из организма животных и смешивают в соотношении 2:1 со стабилизирующей жидкостью (глицерин, лактоза и полиглюкин). Приготовленную ПССК разливают во флаконы по 60...80 мл и хранят в замороженном состоянии при температуре минус 18…22°С для дальнейшего использования в биотехнологии производства вакцины чумной живой. Основным недостатком способа является то, что для повышения иммуногенности вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV НИИЭГ используется его многократное пассирование через организм морской свинки с последующим выделением культуры из организма аутбредной биомодели, проверкой культурально-морфологических свойств, приготовлением микробной взвеси, смешиванием со стабилизирующей жидкостью с последующим замораживанием, что отличается продолжительностью во времени, трудоемкостью и многоэтапностью.

Известен способ приготовления вакцины для профилактики чумы [5], при котором повышение иммуногенности вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV линии НИИЭГ достигается путем анимализации культуры 2-ой генерации, выращенной в течение 48 часов при 28°С на агаре Хоттингера (рН 7.2). Анимализацию осуществляют путем внутривенного введения (в краевую вену уха) беспородным кроликам 1 мл культуры 2-ой генерации концентрацией 2×10⁹ м.к./мл с последующей через 4 часа эфтаназией, посевом легких, селезенки, печени, крови на пластинки агара Хоттингера (рН 7.2). После инкубирования посевов в течение 48 часов при 28°С отбирают типичные колонии, которые пересевают на скошенный агар Хоттингера (рН 7.2), повторно инкубируют в тех же условиях, после чего смывают выросшую микробную массу стерильным бульоном Хоттингера (рН 7.2) и пересевают в матрацы с бульоном Хоттингера (рН 7.2), инкубируют при тех же параметрах. Выросшие культуры пересевают на матрацы с агаром Хоттингера (рН 7.2), выдерживают в течение 48 часов при 28°С, затем смывают полученную биомассу средой высушивания, содержащей сахарозу, желатин, глютаминовокислый натрий, тиомочевину, пептон, для изготовления серии вакцины.

Недостатком способа является включение этапа анимализации для повышения иммуногенности вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV НИИЭГ с использованием беспородных кроликов с последующим выделением культуры вакцинного штамма чумного микроба из органов забитых животных и использованием ее для приготовления вакцины для профилактики чумы, что повышает трудоемкость способа, временные затраты. Помимо этого осуществление анимализации на генетически неоднородной популяции животных (беспородных кроликах) может влиять на стабильность показателей иммуногенности как вакцинного штамма, так и самого конечного продукта (вакцины живой чумной).

Известен способ повышения иммуногенности вакцинных штаммов чумного микроба [6] путем 20-кратного пассирования (продолжительность одного пассажа 24 ч) субкультуры Y. pestis EV, выращенной при 28°С на агаре Хоттингера (рН 7.2), через монослойную культуру перитонеальных макрофагов, полученных путем промывания брюшной полости морских свинок средой 199 с гепарином и содержащей 20% сыворотки крови человека, предварительно инактивированной при 56°С в течении 30 мин.

Основным недостатком способа является то, что для повышения иммуногенности вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV НИИЭГ используется его многократное пассирование через культуру макрофагов, выделенных из организма аутбредных лабораторных животных (морских свинок), что предполагает получение для каждого последующего пассажа свежевыделенных перитонеальных макрофагов от других групп животных, высвобождение клеток чумного микроба из макрофагов предыдущего пассажа с последующим инфицированием нового монослоя макрофагов. Данный способ отличается трудоемкостью, многоэтапностью, продолжительностью во времени (до 20 дней), нестандартностью получаемых клеточных культур.

Известен способ получения иммуногенных вакцинных штаммов чумного микроба [7] путем посева микроорганизмов в цельную нормальную свежую сыворотку крови человека с последующей инкубацией в течение 16-24 часов при 37°С, после чего разводят культуру 0.9% раствором натрия хлорида до соответствующих КОЕ/мл для вакцинации биомоделей.

Основным недостатком способа является использование в качестве культуральной среды свежеполученной сыворотки крови человека, что связано с биоэтическими ограничениями и отсутствием стандартизации среды (различные доноры), невозможностью применения указанного способа в процессе изготовления вакцины для получения больших объемов биомассы, отсутствием данных о сохранении повышенной иммуногенности вакцинных штаммов чумного микроба в условиях хранения на питательных средах.

Предложен способ повышения иммуногенности вакцинного штамма Yersinia pestis EV НИИЭГ [8] путем культивирования в среде RPMI-1640 («Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов», г. Москва), в результате чего отмечалось формирование защиты от экспериментальной чумы лишь у 80% аутбредных мышей в условиях заражения вирулентным штаммом Y. pestis 231 в дозе 50 DCL, которые были предварительно иммунизированы внутрибрюшинно трехкратно с 14-дневным интервалом возрастающими дозами м. кл. Y. pestis EV НИИЭГ (1×10⁵; 2×10⁵; 4×10⁵ КОЕ).

Основным недостатком способа является то, что для оценки иммуногенности в схеме иммунизации автором используется трехкратное введение выращенной на среде RPMI-1640 культуры вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV НИИЭГ и небольшая заражающая доза (50 DCL) вирулентного штамма Y. pestis 231 вместо стандартного однократного введения вакцинного штамма чумного микроба и высоко летальной заражающей дозы 200 DCL вирулентного штамма Y. pestis 231 при оценки иммуногенности (биологический метод) согласно ФС.3.3.1.0022.15 [3], что затрудняет оценку реального эффекта предлагаемого способа.

Известен способ получения иммуногенного препарата из Yersinia pestis EV [9], включающий культивирование Y. pestis EV на плотной питательной среде, смыв микробной массы, ее экстракцию, центрифугирование, многократную очистку осадка с последующим центрифугированием и лиофильную сушку, отличающийся тем, что перед экстракцией микробную массу доводят до концентрации 100×10⁹ м.к./мл 0.9% раствором натрия хлорида, экстрагирование осуществляют равным объемом 0.125% раствора цетавлона в течение двух суток, центрифугирование проводят дважды: первый раз при 6000 об/мин при 4°С в течение 20-30 мин, и затем полученный супернатант центрифугируют второй раз - при 16000 об/мин 20-30 мин при 4°С, а очистку осадка проводят промыванием дважды 0.9% раствором натрия хлорида, дистиллированной водой с центрифугированием при 16000 об/мин в течение 20-30 мин после каждой промывки, полученный осадок ресуспендируют в 0,1% растворе дезоксихолата натрия и встряхивают суспензию в течение 10-20 мин, затем суспензию обрабатывают ультразвуком при частоте 20 кГц 3-4 циклами по 5-7 с в ледяной бане, центрифугируют при 16000 об/мин в течение 30-40 мин при 4°С, полученный осадок ресуспендируют в дистиллированной воде, центрифугируют при 16000 об/мин в течение 30-40 мин, затем осадок ресуспендируют в минимальном объеме дистиллированной воды. Данный способ получения иммуногенного препарата из Y. pestis EV предлагается для дальнейшего использования при разработке и производстве химической вакцины.

Основным недостатком способа является многоэтапность (культивирование вакцинного штамма чумного микроба на плотной питательной среде с последующим смывом микробной массы, обработка выращенной биомассы химическими веществами (катионный детергент цетавлон и др.), многократная очистка осадка с последующим дифференциальным центрифугированием, многократная обработка ультразвуком), продолжительность во времени.

Все вышеизложенное свидетельствует об актуальности поиска оптимального подхода в разработке простого в исполнении способа, позволяющего получить культуру вакцинного штамма чумного микроба, обладающую высокой иммуногенностью, при уменьшении трудоемкости, временных и материальных затрат путем исключения использования живого организма (анимализация), клеточных культур (перитонеальные макрофаги), биологического материала организма человека (сыворотка крови).

В России синтезирован и внедрен в практику не имеющий аналогов за рубежом адьювант-иммуноактиватор полиоксидоний (азоксимера бромид) с молекулярной массой 80 kD. Данный препарат представляет собой водорастворимое N-оксидированное производное полиэтиленпиперазина с наличием на поверхности молекулы большого количества различных активных групп, которые могут взаимодействовать с белками поверхностных структур бактериальных клеток [10, 11]. Установлено, что он изменяет адгезивные свойства патогенных и условнопатогенных бактерий и грибов {Shigella flexneri, Salmonella enteritidis, Corynebacterium diphtheria, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Clostridium difficile, Staphylococcus aureus, Candida albicans), снижает антилизоцимную и антикомплементарную активность микроорганизмов, повышает чувствительность ряда микроорганизмов к определенным антибиотикам групп линкозамидов, фторхинолонов, цефалоспоринов [12, 13].

Известно, что полиоксидоний (ПО) обладает выраженным иммуномодулирующим, детоксицирующим, антиоксидантным, мембраностабилизирующим и антигенусиливающим эффектом, широко применяется в комплексном лечении инфекционно-воспалительных процессов любой локализации и этиологии, входит в состав вакцины против гриппа [14, 15].

В эксперименте совместное введение ПО с антигенами чумного микроба (Pla, LcrV, YopM) усиливает выработку специфических антител [16].

Таким образом, двойная направленность действия препарата полиоксидония с иммунопотенциирующим эффектом, проявляющаяся, с одной стороны, активацией механизмов иммунологической защиты организма, а с другой стороны, прямым воздействием на биологические свойства микроорганизмов, может быть использована для повышения протективности вакцинных штаммов и эффективности специфической профилактики особо опасных инфекционных заболеваний при использовании живых вакцин.

Технический результат изобретения заключается в разработке простого способа, позволяющего получить культуру вакцинного штамма чумного микроба, обладающего высокой иммуногенностью без использования живого организма, клеточных культур, биологического материала организма человека. Экономический эффект использования изобретения состоит в уменьшении трудоемкости, сокращении продолжительности процесса получения высокоиммуногенной культуры вакцинного штамма (препарата) и снижении материальных затрат при повышении иммуногенности вакцинного штамма чумного микроба.

Технический результат достигается тем, что агаровую культуру I генерации вакцинного штамма чумного микроба, приготовленную путем выращивания на агаре Хоттингера рН 7.2±0.1 лиофилизированной культуры вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, культивируют in vitro при температуре 28°С в течение 48 часов на питательной среде LB agar, Miller рН 7.2±0.1 с добавлением иммуноадъюванта полиоксидония (азоксимера бромид) в конечной концентрации 60 мкг/мл.

Заявляемый способ позволяет получить значимое повышение иммуногенности и протективности вакцинного штамма чумного микроба Yersinia pestis EV НИИЭГ и исключает многоэтапность (многократное пассажи через организм восприимчивых животных (анимализация) или клеточные культуры, культивирование вакцинного штамма чумного микроба на плотной питательной среде с последующим смывом микробной массы, обработка выращенной биомассы химическими веществами (катионный детергент цетавлон, водно-фенольная экстракция и др.), дифференциальное центрифугирование), что сокращает продолжительность процесса и трудоемкость, является экологически безопасным.

Сущность и возможность осуществления заявляемого изобретения поясняется следующими примерами. Пример 1.

Агаровую культуру I генерации вакцинного штамма чумного микроба, приготовленную путем выращивания на агаре Хоттингера рН 7.2±0.1 лиофилизированной культуры вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, культивировали in vitro при температуре 28°С в течение 48 часов на питательной среде LB agar, Miller рН 7.2±0.1 с добавлением иммуноадъюванта полиоксидония (азоксимера бромид) в конечной концентрации 60 мкг/мл. Для сравнения параллельно проводили выращивание культуры I генерации вакцинного штамма чумного микроба в аналогичных условиях на питательной среде LB agar, Miller рН 7.2±0.1 без добавления иммуноадъюванта полиоксидония.

Иммуногенность полученных культур II генерации определяли в условиях моделирования чумной инфекции по интегральному показателю ImD50 на мышах инбредной линии BALB\c массой (18±2) г при заражении вирулентными штаммами основного подвида Y. pestis 231(708) (Pgm, pFra, pCad, pPst), LD₅₀ для белых мышей 5 м.кл.; Y. pestis P-13268 (Pgm⁺, pFra⁺, pCad⁺, pPst⁺) Вьетнам, LD50 для белых мышей 5 м.кл., полученых из Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб». Вакцинный штамм Y. pestis EV НИИЭГ, выращенный на питательной среде LB agar, Miller рН 7.2±0.1 с добавлением иммуноадъюванта полиоксидония и без, вводили соответствующим группам мышей BALB\c (по 10 особей обоего пола в каждой группе) в дозах 2×10², 10³, 5×10³ и 2.5×10⁴ колониеобразующих единиц (КОЕ). Заражение осуществляли подкожно дозой 400 LD₅₀ на 21 сутки после вакцинации в соответствии с МУ 3.3.1.1113-02 «Основные требования к вакцинным штаммам чумного микроба» [17]. После инфицирования за животными наблюдали в течение 20 суток. Величину ImD50 -количество живых микробных клеток, выраженных в колониеобразующих единицах и способных защитить через 21 сутки 50% взятых в опыт животных от заражения высоковирулентными штаммами Y. pestis дозой 400 LD50, рассчитывали по методу Кербера в модификации И.П. Ашмарина [18] по формуле:

где D_N - максимальная величина дозы;

N - общее число испытанных доз;

Σ L_i - сумма значений L_i, найденных для всех испытанных доз;

Δ - логарифм кратности испытанных разведений.

Гибель от чумы подтверждалась наличием характерных для чумной инфекции патологоанатомических изменений, результатами высевов из органов и крови на агар Хоттингера рН 7.2±0.1, содержащий (130±10) мг % аминного азота со стимулятором роста (0,024±0,001) % сульфитом натрия и (0,0045±0,0005) % генцианвиолета. Наличие чумного микроба было подтверждено бактериоскопически при исследовании окрашенных по Граму мазков-отпечатков печени, селезенки, легких и крови.

Сравнительные характеристики иммуногенности культур II генерации вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ, выращенных по заявляемому способу на питательной среде LB agar, Miller рН 7.2±0.1 с добавлением иммуноадъюванта полиоксидония и без, представлены в таблице 1.

Иммуногенность культур вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ, выращенных по заявляемому способу, повысилась (р<0,05) в 13 раз в условиях заражения штаммом Y. pestis 231(708), применяющегося в качестве заражающего тест-штамма при контроле вакцины чумной живой, и в 30 раз при инфицировании штаммом основного подвида Y. pestis Р-13268 (Вьетнам).

Пример 2.

Изучено влияние длительного хранения (в течение 1 года) культуры II генерации вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ, выращенной по заявляемому способу при температуре 28°С в течение 48 часов на питательной среде LB agar, Miller рН 7.2±0.1 с добавлением иммуноадъюванта полиоксидония (азоксимера бромид), на протективные свойства вакцинного штамма чумного микроба. Две группы мышей инбредной линии BALB\c массой (18±2) г по 8 особей обоего пола в каждой вакцинировали подкожно 1×10⁵ КОЕ культурами II генерации вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ, одновременно выращенных на питательной среде LB agar, Miller рН 7.2±0.1 с добавлением ПО при температуре 28°С в течение 48 часов как после длительного хранения (в течение 1 года), так и полученную стандартным способом из агаровой культуры I генерации вакцинного штамма чумного микроба, приготовленную путем выращивания на агаре Хоттингера рН 7.2±0.1 лиофилизированной культуры вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ. Заражение осуществляли подкожно вирулентным штаммом основного подвида Y. pestis 231(708) (LD₅₀ для белых мышей 5 м.кл.) дозой 400 LD₅₀ на 21 сутки после вакцинации в соответствии с МУ 3.3.1.1113-02 [17]. После инфицирования за животными наблюдали в течение 20 суток. Как видно из полученных результатов, представленных в таблице 2, длительное хранение (в течение 1 года) на питательной среде LB agar, Miller рН 7.2±0.1 с добавлением ПО при температуре 4°С не снижает протективные свойства вакцинного штамма чумного микроба, выращенного по заявляемому способу.

Пример 3.

Вакцинный штамм Y. pestis EV НИИЭГ, выращенный на питательной среде LB agar, Miller рН 7.2±0.1 с добавлением иммуноадъюванта полиоксидония и без, вводили соответствующим группам мышей BALB\c (по 10 особей обоего пола в каждой группе) в дозе 2.5×10⁴ колониеобразующих единиц (КОЕ). Для получения сыворотки забор крови осуществляли на 21 сутки после вакцинации. Антитела к капсульному антигену F1 чумного микроба в сыворотке крови определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА) с применением сертифицированной иммуноферментной тест-системы «ИФА-АТ-Ф1 YERSINIA PESTIS» per. уд. №ФСР 2012/13946 - 101012 (ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб») в строгом соответствии с инструкцией по применению. Учет оптической плотности осуществляли на микропланшетном фотометре Stat Fax-3200 (USA) при длине волны 405 нм. Наличие антител в сыворотке определяли в трех повторах и выражали в виде обратного среднегеометрического титра и его среднего квадратического отклонения. Достоверность уровня различия сравниваемых величин оценивали по непараметрическому критерию Манна-Уитни. Статистически значимыми считались различия при р<0.05.

Характеристики антигенной активности культур II генерации вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ, выращенных по заявляемому способу на питательной среде LB agar, Miller рН 7.2±0.1 с добавлением иммуноадъюванта полиоксидония и без, представлены в таблице 3. Показано, что уровень антител к капсульному антигену чумного микроба F1 в 1,7 раза выше в группе животных, иммунизированных вакцинным штаммом Y. pestis EV НИИЭГ, выращенным согласно заявляемому способу.

Таким образом, заявленный способ повышения иммуногенности вакцинного штамма чумного микроба специфичен и эффективен. Экономический эффект использования изобретения состоит в уменьшении трудоемкости и сокращении временных и материальных затрат при повышении иммуногенности вакцинного штамма чумного микроба.

Литература

1. Профилактика чумы. Санитарно-эпидемиологические правила СП 3.1.7.3465-17

2. WHO Workshop Meeting Report "Efficacy trials of Plague Vaccines: endpoints, trial design, site selection" 2018, INSERM, Paris, 12 p.

3. Зуенко A.A., Абзаева H.B., Гостищева C.E., Старцева О.Л., Гридина Т.М., Богданова Ю.В., Иванова Г.Ф., Ростовцева Д.В. Анализ стабильности производства вакцины чумной живой и основных показателей качества препарата // Проблемы особо опасных инфекций. 2018. №4. С. 54-57. DOI:10.21055/0370-1069-2018-4-54-57

4. Патент 2 510 825 Российская Федерация, МПК С2. Способ получения препарата на основе вакцинного штамма чумного микроба/ Тетерин В.В., Ежов А.В., Бирюков В.В., Мохов Д.А., Багин СВ., Хонин А.З., Логвинов С. В.; заявитель и патентообладатель Федеральное бюджетное учреждение "33 испытательный институт Министерства обороны Российской Федерации". - №2012107170/10; заявл. 27.02.2012. опубл. 10.04.2014.

5. Патент KZ А4 №22419 (15.04.2010, бюл. №4)

6. Авторское свидетельство на изобретение SU №1249939 А1

7. Авторское свидетельство на изобретение SU №1520098 А1

8. Голова А.Б. Разработка биотехнологических аспектов повышения иммуногенности вакцинного штамма Yersinia pestis EV НИИЭГ: автореф. дис.... канд. биол. наук: 03.01.06, 03.02.03 /Голова Алина Борисовна. -Саратов, 2012 - 22 с.

9. Патент 2248217 Российская Федерация, МПК С2. Способ получения иммуногенного препарата из Yersinia pestis EV/ Николаев В.Б., Иванова Т.А., Половинкина B.C., Саппо С.Г., Попова Ю.О., Марков Е.Ю., Голубинский Е.П; заявитель и патентообладатель Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока (НИПЧИ Сибири и ДВ) - №2003115185/13, заявл. 22. 05.2003. опубл. 20.03.2005.

10. Петров Р.В., Хаитов P.M., Некрасов А.В., Аттаулаханов Р.И., Пучкова Н.Г., Иванова А.С., Пинегин Б.В., Хамидуллина К.Ф., Дамбаева С.В., Климова С.В. Поликси доний: Механизм действия и клиническое применение //Медицинская иммунология. - 2000. -Т. 2, №3. - С. 271-278.

11. Козлов И.Г., Тимаков М.А. Иммунотерапия: вчера, сегодня, завтра // Педиатрия. - 2009. - Т. 87. - №4. - С. 161-163.

12. Кириллов Д.А., Чайникова И.Н., Перунова Н.Б., Челпаченко О.Е., Паньков А.С., Смолягин А.И., Валышев А.В. Влияние иммуномодулятора поликсидония на биологические свойства микроорганизмов //ЖМЭИ.- 2003. №4. - С. 74-78.

13. Харсеева Г.Г., Москаленко Е.П., Алутина Э.Л., Бреадо A.M. Влияние полиоксидония на адгезивные свойства Corynebacterium diphtheria //ЖМЭИ. -2009. -№2. С. 11-15.

14. Хаитов P.M., Некрасов А.В., Пучкова Н.Г. и др. Эпидемиологическая и экономическая эффективность иммунизации вакциной «Гриппол» при гриппе и ОРВИ у взрослых и детей //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2003. -№3. - С. 83-86.

15. Караулов А.В., Евстигнеев И.В. Современные подходы к вакцинопрофилактике гриппа // Вакцинация. -2011. - №1(1). - С. 43-52.

16. Ляпина A.M., Полянина Т.И., Ульянова О.В., Елисеев Ю.Ю., Телепнев М.В., Мотин В.Л., Федорова В.А. Применение полиоксидония для получения специфических антител к бактериальным антигенам. Современные проблемы науки и образования 2012, 2.

17. МУ 3.3.1.1113-02. Основные требования к вакцинным штаммам чумного микроба: Методические указания - М.: Минздрав России, 2002. - 64 с.

18. Ашмарин И.П., Воробьев А. А. Статистические методы в микробиологических исследованиях /Л.: Медгиз. - 1962 - 180 с.