Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ШТАММА Е. coli BL21 Star™(DE3) pET302/NT-His tcpA - ПРОДУЦЕНТА РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА Тср А ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА БИОВАРА ЭЛЬ ТОР

Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии и касается штамма-продуцента рекомбинантного белка токсин-корегулируемых пилей адгезии холерного вибриона (ТсрА).

Холера - особо опасная инфекция, эпидемии которой регистрируются на территориях многих стран Азии, Африки, Южной Америки. Возникновение эпидемических осложнений по холере в России связано с ее заносами из зарубежных стран, неблагополучных по этой инфекции. Возбудителем текущей седьмой пандемии холеры с 1961 г. по настоящее время является Vibrio cholerae O1 биовара Эль Тор. К ключевым факторам, определяющим патогенный потенциал возбудителя холеры, относятся холерный токсин (СТ от cholera toxin), вызывающий основной клинический симптом - профузную диарею, а также токсин - корегулируемые пили (TCP от toxin-coregulated pilus), ответственные за колонизацию холерными вибрионами тонкого кишечника человека. Основной субъединицей TCP является белок ТсрА, кодируемый геном tcpA [1]. TCP представляют собой пучки из тонких и гибких нитей длиной несколько микрометров и диаметром менее 10 нм, образующих на поверхности клетки длинные тяжи. Каждая нить состоит из гомополимерных повторяющихся белковых субъединиц ТсрА с молекулярной массой 20,5 кДа, которые относятся к IV типу пилей, встречающихся у большинства патогенных грамотрицательных бактерий. Установлено, что TCP являются не только ключевым фактором патогенности возбудителя холеры, но относятся также к протективным антигенам, ответственным за формирование антиколонизирующего иммунитета при холере. Вследствие иммуногенности этот белок включен в состав многих рекомбинантных холерных вакцин [2, 3]. К настоящему времени известно о конструировании рекомбинантных штаммов Е. coli - продуцентов белка ТсрА рядом зарубежных исследователей для последующего создания на их основе холерных вакцин [2, 3, 4, 5].

В зарубежных лабораториях сконструированы штаммы Escherichia coli продуценты этого иммуногенного белка - «Intranasal immunization with recombinant toxin-coregulated pilus and cholera В subunit protects rabbits against Vibrio cholerae O1 challenges», Juthika Kundu at al., Индия, 2009 г.; «Recombinant toxin-coregulated pilus A (TcpA) as a candidate subunit cholera vaccine», Somayeh Kiaie at al., Иран 2013 г.; immunizing adult female mice with a TcpA-A2-CTB chimera provides a high level of protection for their pups in the infant mouse model of cholera», Gregory A. Price, Randall K. Holmes, США, 2014 г. Эффективность продукции рекомбинантного белка невысокая (Иран, 2009 г.) Более того, в составе рекомбинантной плазмиды был клонирован ген tcpA^Eltor, характерный для типичного возбудителя холеры Эль Тор, который в настоящее время вытеснен на эндемичных территориях генетически измененными штаммами (США, 2014 г.), либо ген tcpA^class, присущий холерным вибрионам классического биовара, которые практически не выделяются на эндемичных территориях (Индия, 2009 г.).

В Российской Федерации в настоящее время отсутствует подобный штамм-продуцент ТсрА, который необходим не только для получения отечественных рекомбинантных холерных вакцин нового поколения, но и для создания иммунодиагностической тест-системы, предназначенной для оценки продукции этого фактора патогенности эпидемически опасными штаммами, поскольку ген tcpA относится к генетическим маркерам таких штаммов. Все это указывает на актуальность исследований, направленных на создание эффективных штаммов-продуцентов протективного белка ТсрА.

Задачей настоящего изобретения является получение штамма клеток Е. coli BL21 Star™ (DE3) pET302/NT-His tcpA - продуцента рекомбинантного белка ТсрА холерного вибриона биовара Эль Тор.

Технический результат заключается в реализации указанного назначения.

Поставленная задача достигается трансформацией компетентных клеток Е. coli BL21 Star™ (DE3) рекомбинантной плазмидой pET302/NT-His tcpA.

Штамм-продуцент рекомбинантного белка ТсрА холерного вибриона получен путем переклонирования гена tcpA из плазмиды pCR2.1 tcpA в экспрессирующую векторную систему рЕТ302. Вначале получили укороченный фрагмент клонированного гена tcpA^CIRS, лишенного лидерного пептида, состоящего из 25 аминокислот и альфа-спирали, характерной для всех пилей адгезии IV типа. Для этого использовали метод ПЦР с рассчитанными нами праймерами (TcpAcirs рЕТ302 F ccgctcgaggattcgcagaatatgactaaggctgc и TcpAcirs рЕТ302 R gctggatccttaactgttaccaaaagctactgtgaat), имеющими сайты для эндонуклеаз рестрикции XhoI и BamHI.. В результате получили ампликон, который соответствовал фрагменту гена tcpA^CIRS размером 534 п.н. Далее ДНК выбранной экспрессирующей плазмиды рЕТ302 и ампликон укороченного гена tcpA^CIRS одновременно расщепляли эндонуклеазами рестрикции XhoI и BamHI (Thermo Fisher Scientific, Germany) в течение 15 мин., рестрикционные фрагменты лигировали и смесью лигированных молекул осуществляли трансформацию методом электропорации компетентных клеток E. coli BL21 Star™ [DE3]. Полученные трансформанты культивировали на LB агаре, содержащем 50 мкг/мл ампициллина при 37°С в течение 18 часов. Нуклеотидная последовательность гена tcpA была секвенирована и имеет следующую последовательность:

Заявляемый штамм Е. coli BL21 Star™ (DE3) pET302/NT-His tcpA характеризуется следующими признаками:

Морфологические признаки: клетки палочковидной формы, грамотрицательные.

Культуральные признаки: при росте на агаризованной среде LB колонии круглые, гладкие, с ровными краями. Рост в жидких средах характеризуется ровным помутнением бульона.

Физиолого-биохимические признаки: температурный оптимум для роста клеток 37°С, оптимум рН 6,8-7,5.

Генетические признаки: F- ompT hsdSB(rBmB) gal dcm rne131 (DE3)

Устойчивость штамма к антибиотикам: клетки устойчивы к ампициллину, что обусловлено наличием в плазмиде pET302/NT-His гена ampR.

Условия хранения штамма: среда LB с 15% содержанием глицерина, t=-70°С в криовиалках.

Штамм Е. coli BL21 Star™ (DE3) pET302/NT-His tcpA депонирован в ГКПБ РосНИПЧИ «Микроб», регистрационный номер КМ2046.

Преимуществом заявленного штамма является накопление рекомбинантного белка в клетках, как в виде телец включения, так и в растворимой форме, что обусловлено наличием оптимальных регуляторных элементов в применяемой экспрессионной системе: Т7-1ac-промотора для предотвращения экспрессии гена до момента начала индукции и высокого уровня транскрипции соответствующей мРНК при индукции, высокоэффективного терминатора транскрипции Т7; введение в состав полипептидной цепи 6 остатков гистидина значительно упрощает выделение рекомбинантного белка. Также преимущество заявляемого штамма КМ2046 заключается в использовании бактерий с пониженным уровнем протеолитического расщепления рекомбинантного белка.

Заявляемый штамм КМ2046, содержащий рекомбинантную плазмиду со встройкой участка гена tcpA холерного вибриона биовара Эль Тор, кодирующий рекомбинантный белок ТсрА размером 178 аминокислот с молекулярной массой 20,5 кДа, очищенный методом металл-аффинной хроматографии на колонках с никель-хелатным сорбентом, может быть использован для дальнейшей разработки на его основе иммунодиагностических препаратов с целью оценки уровня продукции ТсрА у различных штаммов V. cholerae и определения антигенного состава холерных вакцинных препаратов.

Пример: Способ получения рекомбинантного белка ТсрА пригодного для дальнейшего использования.

Способ получения рекомбинантного белка ТсрА осуществляли следующим образом: Клетки штамма КМ2046 выращивали на агаре LB в присутствии ампициллина (50 мкг/мл) при 37°С. Затем две петли ночной культуры ресуспензировали в 2,0 мл бульона LB, культивировали до OD₆₀₀=0.6 и вносили в колбы с 50,0 мл LB бульона, затем вносили индуктор IPTG в концентрации 0,1 мМ, культивировали в течение 2 ч. При индукции IPTG происходит эффективный биосинтез рекомбинантного ТсрА, который накапливается в клетках, как в растворимой форме, так и в виде телец включения. Получение из клеток продуцента рекомбинантного ТсрА включает несколько стадий. Бактерии отделяют от культуральной среды и разрушают. Центрифугированием отделяют растворимую клеточную фракцию от телец включения. Последние отмывают буферным раствором от водорастворимых компонентов клетки, проводят солюбилизацию, восстановление и рефолдинг рекомбинантного белка. Окончательную очистку целевого белка проводят методом металло-хелатной хроматографии. Выход полученного рекомбинантного белка ТсрА составляет примерно 60 мкг/мл. Использование предложенного изобретения позволяет получить рекомбинантный белок ТсрА с высоким выходом и упростить его выделение и очистку.

Список литературы

1. Смирнова Н.И., Горяев А.А., Кутырев В.В. Эволюция генома возбудителя холеры в современный период. Мол. генет. микробиол. и вирусол. 2010; 4: 11-19.

2. Rollenhagen J.E., Kalsy A., Cerda F., Manohar J., Harris J.B., LaRocque R.C., Qadri F., Calderwood S.B., Taylor R.K., Ryan E.T. Transcutaneous immunization with toxin-coregulated pilin A induces protective immunity against Vibrio cholerae O1 El Tor challenge in mice. Infection and Immunity. 2006; 74: 5834-5839. DOI: 10.1128/IAI.00438-06.

3. Price G.A., Holmes R.K. Immunizing adult female mice with a TcpA-A2-CTB chimera provides a high level of protection for their pups in the infant mouse model of cholera. PLoS Neglected Tropical Diseases. 2014; 8(12); e3356. DOI: 10.1371/journal.pntd.0003356.

4. Kiaie S., Abtahi H., Mosayebi G., Alikhani M. Y., Pakzad I. Recombinant toxin-coregulated pilus A (TcpA) as a candidate subunit cholera vaccine. Iranian Journal of Microbiolody. 2013; 6(2): 68-73.

5. Molaee N., Mosayebi G., Amozande-Nobaveh A., Soleyman M.R., Abtahi H. Evolution of the immune response against recombinant proteins (TcpA, TcpB, and FlaA) as a candidate subunit cholera vaccine. Journal of Immunology Research. 2017; art ID: 2412747. DOI: 10.1155/2017/2412747.