ЖИДКИЕ СТАБИЛЬНЫЕ ВАКЦИНЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ВИРУС КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к жидким стабильным вакцинам крупного рогатого скота, которые содержат живой ослабленный вирус крупного рогатого скота. Изобретение также относится к производству указанных вакцин и способам вакцинирования животных.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Существует целый ряд вирусов, которые могут инфицировать крупный рогатый скот. Такие вирусы включают вирус вирусной диареи крупного рогатого скота 1 и 2 типов, (BVDV1 или, альтернативный вариант BVD1; и BVDV2 либо альтернативный вариант BVD2), вирус инфекционного бычьего ринотрахеита (IBR), парагриппа типа 3 (PI3), бычий респираторно-синцитиальный вирус (BRSV), вирус Рифт-Валли (RVFV) и бычий респираторный коронавирус (BRCV). Помимо этого, существует ряд бактерий, которые тоже могут инфицировать крупный рогатый скот, в том числе Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica, Histophilus somni и Mycoplasma bovis.

В настоящее время широко распространено, что лучшим способом профилактики заболевания, вызванного бактериальной или вирусной инфекциями у крупного рогатого скота, является его вакцинирование против данных вирусов. Более того, поливалентные вакцины, содержащие живой ослабленный вирус или бактерию, могут вводиться безболезненно, с тем, чтобы ограничить количество необходимых введений вакцины. В связи с этим, поливалентные живые вирусные вакцины, защищающие от BVDV1 и BVDV2, IBR, PI3 и/или BRSV, являются коммерчески доступными. Несмотря на это, до настоящего момента, ослабленные вирусы крупного рогатого скота являлись нестабильными при хранении в жидких растворах. По этой причине, большинство вакцин, содержащих живой ослабленный вирус крупного рогатого скота, высушивают вакуумом, т.е. лиофилизируют перед их долговременным хранением. Живой ослабленный вирус крупного рогатого скота обычно смешивают с водой в виде суспензии с защитным веществом, замораживают и затем дегидратируют путем сублимации и вторичной сушки в ходе процесса лиофилизации. Низкие температуры замораживания и сушки путем сублимации, в сочетании с небольшой поверхностностью к соотношению содержащегося объема, могут требовать длительные периоды высушивания и тем самым, значительно увеличивать время производства и затраты.

В дополнение к этому, существуют неустранимые несоответствия в больших промышленных сушках вследствие: невозможности регулировать температуру полки, охватывающую всю тепловую нагрузку, обуславливаемую продуктом, непостоянных скоростей заморозки по периметру осушителя, краевых эффектов и воздействий энергии излучения. Повышение температуры сушки, чтобы снизить продолжительность сушки часто не является возможным способом, поскольку температура сушки должна оставаться существенно ниже температуры стеклования защитной белковой матрицы. Помимо этого, длительные непостоянные периоды сушки и/или высокие температуры сушки часто приводят к структурному повреждению живых ослабленных вирусов, наряду со значительной потерей их биологической активности.

Следовательно, для того, чтобы учесть собственные потери в эффективности, лиофилизированные вакцины крупного рогатого скота, которые содержат живые ослабленные вирусы, хранят с увеличенными титрами. Вместе с тем, указанные увеличенные титры могут привести к значительным побочным эффектам, в случае если процесс лиофилизации фактически приводит к менее значительной потере активности, чем ожидалось. Вследствие этого, необходима большая осторожность, чтобы разрабатывать вакцины, содержащие титр вируса, который не только безопасно ниже количества, приводящего к побочным эффектам, но также поддерживает достаточную эффективность с учетом потери титра вируса за счет лиофилизации и последующего хранения.

Кроме того, существует ограничение по размеру флаконов для лиофилизации и/или количества доз, содержащихся в таких флаконах из-за относительно небольших типовых размеров пробок для поверхностей данных флаконов. Вследствие этого, большие объемы жидкости становится трудно высушивать из-за относительно небольших отверстий. Кроме того, большой флакон необходим для того, чтобы пользователь тем или иным образом переносил большой объем разбавителя к лиофилизированной таблетке в стерильных условиях, в то время как регидратация в большинстве более мелких флаконах попросту неудобна. В действительности, любая альтернатива, прежде всего, беспокойна для среды кормовой площадки, в которой находятся получатели вакцин, например, крупный рогатый скот. В связи с этим, существует потребность в новых вакцинах, содержащих живой ослабленный вирус крупного рогатого скота, которые могут надежно поддерживать свои титры вирусов на безопасном и эффективном уровнях.

Ссылку на любой источник в настоящем документе не следует рассматривать как признание того, что такая ссылка доступна в качестве «предшествующего уровня техники» к настоящей заявке.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Для того чтобы преодолеть недостатки существующих вакцин, настоящее изобретение предлагает новые жидкие стабильные вакцины, содержащие живой ослабленный вирус крупного рогатого скота, в том числе их соответствующие иммуногенные композиции. Жидкие стабильные, живые вакцины, содержащие вирус крупного рогатого скота по настоящему изобретению могут оставаться эффективными в течение длительных периодов времени, в частности, 9 месяцев или дольше (например, приблизительно от 1 до 3 лет). Настоящее изобретение также относится к способам введения таких вакцин животному. Настоящее изобретение дополнительно предлагает способы профилактики заболевания у животного путем введения вакцины по настоящему изобретению.

В соответствии с этим, настоящее изобретение предлагает жидкие стабильные вакцины, которые содержат живой ослабленный вирус, в том числе поливалентные вакцины, содержащие живой вирус. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения живой вирус представляет собой ослабленный вирус. В других вариантах осуществления живой вирус является рекомбинантным вирусом. В конкретных вариантах осуществления живой вирус является и ослабленным, и рекомбинантным. Рекомбинантные вирусы по настоящему изобретению также могут кодировать гетерогенный белок. В конкретных вариантах осуществления изобретения по данному способу, гетерогенный белок является вирусом, паразитарным или бактериальным антигеном.

В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения, вакцина содержит добавку сахара, которая является сахарным спиртом. В отдельных вариантах осуществления изобретения вакцина дополнительно содержит аминокислоту. В конкретных вариантах осуществления изобретения вакцина содержит от 5 до 40% (масса/объем) сахарного спирта. В некоторых вариантах осуществления изобретения вакцина содержит от 10 до 30% (масса/объем) сахарного спирта. В конкретных вариантах осуществления изобретения вакцина содержит от 15 до 25% (масса/объем) сахарного спирта. В родственных вариантах осуществления вакцина содержит от 10 до 20% (масса/объем) сахарного спирта. В других вариантах осуществления вакцина содержит от 20 до 25% (масса/объем) сахарного спирта. В более конкретных вариантах осуществления вакцина содержит от 12 до 18% (масса/объем) сахарного спирта. В еще более конкретных вариантах осуществления вакцина содержит примерно 15% (масса/объем) сахарного спирта. В родственных вариантах осуществления изобретения вакцина содержит примерно 23% (масса/объем) сахарного спирта. В некоторых вариантах осуществления жидкие стабильные противовирусные вакцины по данному изобретению содержат два или более сахарных спиртов, с общим количеством сахарного спирта в жидкой стабильной вакцине составляющим 5-40% (масса/объем). В родственных вариантах осуществления жидкие стабильные противовирусные вакцины содержат два или более сахарных спиртов, с общим количеством сахарного спирта в жидкой стабильной вакцине составляющим 10-30% (масса/объем).

В конкретных вариантах осуществления жидких стабильных противовирусных вакцин по настоящему изобретению сахарный спирт представляет собой сорбит. В варианте изобретения по данному способу, добавка сахара представляет собой маннит. В родственных вариантах осуществления, жидкие стабильные вакцины дополнительно содержат добавку сахара, которая представляет собой бесспиртовой сахар, где общее количество сахарного спирта и бесспиртового сахара в жидкой стабильной вакцине составляет 10-40% (масса/объем). В родственных вариантах осуществления вакцина содержит 10-25% (масса/объем) сахарного спирта и 5-20% (масса/объем) бесспиртового сахара. В более конкретных вариантах осуществления вакцина содержит 10-20% (масса/объем) сахарного спирта и 7,5-15% (масса/объем) бесспиртового сахара. В одном из вариантов изобретения, бесспиртовым сахаром, добавкой сахара является трегалоза. В других вариантах осуществления, бесспиртовым сахаром, добавкой сахара является декстроза. В третьих вариантах осуществления, бесспиртовой сахар, добавка сахара представляет собой сахарозу. В конкретном варианте осуществления изобретения по данному способу, добавкой сахара является комбинация сахарозы (бесспиртовой сахар) и сорбита (сахарный спирт). В более конкретном варианте осуществления по данному способу, добавка сахара представляет собой комбинацию 10-20% сорбита и 5-15% сахарозы. В еще более конкретном варианте осуществления по данному способу, добавкой сахара является комбинация 15% сорбита и 10% сахарозы. В конкретных вариантах осуществления изобретения, бесспиртовой сахар, добавка сахара представляет собой, в действительности, комбинацию двух или более бесспиртового сахара, добавок сахара.

Жидкие стабильные вакцины по настоящему изобретению могут варьировать по значению рН от 6,0 до 8,0 рН. В некоторых вариантах осуществления диапазон рН составляет от 6,5 до 7,8 рН. В конкретных вариантах осуществления диапазон рН составляет от 6,8 до 7,5 рН. В более конкретных вариантах осуществления диапазон рН составляет от 7,0 до 7,4 рН. В еще более конкретном варианте рН составляет 7,2.

Жидкие стабильные вакцины по настоящему изобретению могут содержать буферный раствор. В конкретном варианте осуществления по данному способу, буферный раствор содержит от 2,5 до 50 ммоль фосфата, например, фосфата натрия (NaPHOS) или фосфата калия (KPHOS). В родственном варианте осуществления, буферный раствор содержит от 5 до 25 ммоль фосфата. В конкретных вариантах осуществления буферный раствор содержит от 10 до 20 ммоль фосфата.

В других вариантах осуществления изобретения, буфер (например, буферный раствор) может содержать от 0,15 до 0,75 моль аргинина. В конкретных вариантах осуществления, буферный раствор содержит от 2,5 до 50 ммоль фосфата и от 0,15 до 0,75 моль аргинина. В более конкретных вариантах осуществления, буферный раствор содержит от 5 до 25 ммоль фосфата и 0,15 до 0,75 моль аргинина. В еще более конкретных вариантах осуществления, буферный раствор содержит от 10 до 20 ммоль фосфата и от 0,3 до 0,5 моль аргинина. В других вариантах осуществления, буферный раствор содержит от 2,5 до 50 ммоль фосфата. В родственном варианте осуществления, буферный раствор содержит от 5 до 25 ммоль Трис. В конкретных вариантах осуществления, буферный раствор содержит от 10 до 20 ммоль Трис. В родственных вариантах осуществления, Трис-буфер содержит гистидин.

Жидкие стабильные вакцины по настоящему изобретению могут содержать аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления я, как описано выше, аминокислотой является аргинин. В других вариантах осуществления, аминокислотой является метионин. В некоторых вариантах осуществления, аминокислотой является глицин. В третьих вариантах осуществления, аминокислотой является глутаминовая кислота. В родственных вариантах осуществления, жидкие стабильные вакцины содержат и аргинин, и метионин. В других вариантах осуществления, жидкие стабильные вакцины содержат и аргинин, и глицин. В третьих вариантах осуществления, жидкие стабильные вакцины содержат и глицин, и метионин. В родственных вариантах осуществления, жидкие стабильные вакцины содержат и глутаминовую кислоту, и метионин. В некоторых вариантах осуществления, жидкие стабильные вакцины содержат и глутаминовую кислоту, и глицин. В других вариантах осуществления, жидкие стабильные вакцины содержат и глутаминовую кислоту, и аргинин.

В родственных вариантах осуществления изобретения, жидкие стабильные вакцины содержат аргинин, глутаминовую кислоту и метионин. В некоторых вариантах осуществления, жидкие стабильные вакцины содержат аргинин, глутаминовую кислоту и глицин. В других вариантах осуществления, жидкие стабильные вакцины содержат аргинин, глутаминовую кислоту и метионин. В третьих вариантах осуществления, жидкие стабильные вакцины содержат аргинин, глицин и метионин. В других вариантах осуществления, жидкие стабильные вакцины содержат аргинин, глицин и метионин. В конкретных вариантах осуществления, жидкие стабильные вакцины содержат аргинин, глицин, метионин и глутаминовую кислоту.

В конкретных вариантах осуществления изобретения, конечная концентрация аргинина или глутаминовой кислоты, либо глицина в жидкой стабильной вакцине составляет от 0,15 до 0,75 моль. В родственных вариантах осуществления, конечная концентрация аргинина или глутаминовой кислоты, либо глицина в жидкой стабильной вакцине составляет от 0,25 до 0,75 моль. В более конкретных вариантах осуществления, конечная концентрация аргинина или глутаминовой кислоты, либо глицина в жидкой стабильной вакцине составляет от 0,2 до 0,6 моль. В более конкретных вариантах осуществления, конечная концентрация аргинина или глутаминовой кислоты, либо глицина в жидкой стабильной вакцине составляет от 0,2 до 0,5 моль. В третьих вариантах осуществления, конечная концентрация аргинина или глутаминовой кислоты, либо глицина в жидкой стабильной вакцине составляет от 0,25 до 0,45 моль.

В еще более конкретных вариантах осуществления изобретения, конечная концентрация аргинина или глутаминовой кислоты, либо глицина в жидкой стабильной вакцине составляет примерно 0,45 моль. В других конкретных вариантах осуществления, конечная концентрация аргинина или глутаминовой кислоты, либо глицина в жидкой стабильной вакцине составляет примерно 0,3 моль.

В конкретных вариантах осуществления, конечная общая концентрация аргинина в сочетании с глутаминовой кислотой и/или глицином в жидкой стабильной вакцине составляет от 0,15 до 0,75 моль. В родственных вариантах осуществления, конечная концентрация аргинина в сочетании с глутаминовой кислотой и/или глицином в жидкой стабильной вакцине составляет от 0,25 до 0,75 моль. В других вариантах осуществления, конечная общая концентрация аргинина в сочетании с глутаминовой кислотой и/или глицином в жидкой стабильной вакцине составляет от 0,2 до 0,6 моль. В более конкретных вариантах осуществления, конечная общая концентрация аргинина в сочетании с глутаминовой кислотой и/или глицином в жидкой стабильной вакцине составляет от 0,3 до 0,5 моль. В третьих вариантах осуществления, конечная концентрация аргинина и глутаминовой кислоты, либо глицина в жидкой стабильной вакцине составляет от 0,25 до 0,45 моль.

В еще более конкретных вариантах осуществления изобретения, конечная общая концентрация аргинина в сочетании с глутаминовой кислотой и/или глицином в жидкой стабильной вакцине составляет примерно 0,45 моль. В других конкретных вариантах осуществления, конечная концентрация аргинина в сочетании с глутаминовой кислотой и/или глицином в жидкой стабильной вакцине составляет примерно 0,3 моль.

В конкретных вариантах осуществления изобретения, конечная концентрация метионина в жидкой стабильной вакцине составляет от 0,025 до 0,3 моль. В родственных вариантах осуществления, конечная концентрация метионина в жидкой стабильной вакцине составляет от 0,04 до 0,15 моль. В более конкретных вариантах осуществления, конечная концентрация метионина в жидкой стабильной вакцине составляет от 0,06 до 0,09 моль. В еще более конкретных вариантах осуществления, конечная концентрация метионина в жидкой стабильной вакцине составляет примерно 0,07 моль.

Жидкие стабильные вакцины по настоящему изобретению могут также содержать белковый стабилизатор. Белковым стабилизатором может быть интактный белок и/или белковый гидролизат. В конкретных вариантах осуществления белковым стабилизатором является желатин. В более конкретных вариантах осуществления белковый стабилизатор, содержащийся в жидкой стабильной вакцине, по настоящему изобретению составляет от 0,4 до 1,6% желатина. В модификациях изобретения белковым стабилизатором является гидролизат нативного казеина. В конкретных вариантах осуществления по данному способу, белковый стабилизатор, содержащийся в жидкой стабильной вакцине, по настоящему изобретению составляет 0,5-2,0% гидролизата нативного казеина. В некоторых вариантах осуществления гидролизатом нативного казеина является протеолитический гидролизат нативного казеина. В других вариантах осуществления, белковым стабилизатором, содержащимся в жидкой стабильной вакцине, по настоящему изобретению является лактоглобулин или гидролизат молочного альбумина.

В дополнение к этому, жидкие стабильные вакцины по настоящему изобретению могут также дополнительно содержать хелатирующий агент. Такие хелатирующие агенты включают помимо прочего: этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA), цитрат, 1,2-бис(о-аминофенокси)этан-N,N,N',N'-тетрауксусную кислоту (BAPTA), этиленгликоль тетрауксусную кислоту (EGTA), димеркаптосукциновую кислоту (DMSA), диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPA), и 2,3-димеркапто-1-пропансульфоновую кислоту (DMPS). Концентрация указанных хелатирующих агентов в жидких вакцинах по настоящему изобретению может варьировать в пределах от 50 мкмоль до 10 ммоль.

В конкретных вариантах осуществления хелатирующим агентом является этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA). В некоторых вариантах осуществления по данному способу жидкая стабильная вакцина содержит от 0,050 до 1 ммоль EDTA. В конкретных вариантах осуществления жидкая стабильная вакцина содержит от 0,25 до 0,75 ммоль EDTA. В более конкретных вариантах осуществления жидкая стабильная вакцина содержит примерно 0,5 ммоль EDTA.

В некоторых вариантах осуществления жидкие стабильные вакцины по настоящему изобретению дополнительно содержат один или более акцепторов свободных радикалов и/или антиоксиданты в качестве компонента. В конкретном варианте осуществления по данному способу, вакцина по настоящему изобретению, содержит аскорбиновую кислоту. В конкретном варианте изобретения по данному способу, жидкая стабильная вакцина содержит примерно 0,5 ммоль аскорбиновой кислоты. В родственном варианте изобретения вакцина содержит альфа-токоферол. В конкретном варианте осуществления по данному способу, жидкая стабильная вакцина содержит примерно 0,5 ммоль альфа-токоферола. В другом варианте осуществления, вакцина содержит глутатион. В конкретном варианте по данному способу, жидкая стабильная вакцина содержит примерно 3 ммоль глутатиона. В еще одном варианте осуществления, вакцина содержит и альфа-токоферол, и аскорбиновую кислоту. В другом варианте осуществления, вакцина содержит и альфа-токоферол, и глутатион. В третьем варианте осуществления, вакцина содержит и глутатион, и аскорбиновую кислоту. В еще одном варианте осуществления, вакцина содержит аскорбиновую кислоту, альфа-токоферол и глутатион.

В родственных вариантах осуществления изобретения, жидкие стабильные вакцины по настоящему изобретению сохраняются в герметичных контейнерах. В конкретных вариантах по данному способу, жидкие стабильные вакцины по настоящему изобретению, сохраняются в герметичных контейнерах с инертным газом, таким как аргон, азот или гелий, находящихся выше жидкости (например, заполненные инертным газом).

Жидкие стабильные вакцины по настоящему изобретению дополнительно содержат адъювант. В конкретных вариантах изобретения по данному способу, адъювант представляет собой фосфат алюминия. В других таких вариантах осуществления, адъювантом является гидроксид алюминия. В третьих вариантах осуществления адъювантом является низкомолекулярный сополимерный адъювант, который может образовывать поперечные связи в растворе, чтобы преобразоваться в высокомолекулярный гель. В других вариантах осуществления, адъювант собирают из гелевых частиц акрилата натрия в водном растворе. В третьих вариантах осуществления адъювант представляет собой комбинацию двух или более подобных адъювантов.

В конкретных вариантах осуществления жидкие стабильные вакцины по настоящему изобретению дополнительно содержат детергент и/или поверхностно-активное вещество. В некоторых вариантах изобретения по данному способу поверхностно-активным веществом является полиоксиэтилен-полиоксипропиленовый блок-сополимер. В конкретном варианте изобретения по данному способу жидкая стабильная вакцина содержит примерно 0,01% полиоксиэтилен-полиоксипропиленового блок-сополимера. В конкретном варианте осуществления по данному способу полиоксиэтилен-полиоксипропиленовым блок-сополимером является PLURONIC^®F-68.

Жидкие стабильные вакцины по настоящему изобретению могут содержать живой ослабленный вирус крупного рогатого скота. В некоторых вариантах осуществления живой ослабленный вирус крупного рогатого скота представляет собой вирус инфекционного бычьего ринотрахеита (IBR). В других вариантах осуществления живым ослабленным вирусом крупного рогатого скота является вирус вирусной диареи крупного рогатого скота типа 1 (BVDV1). В еще некоторых вариантах осуществления живым ослабленным вирусом крупного рогатого скота является вирус вирусной диареи крупного рогатого скота типа 2 (BVDV2). В третьих вариантах осуществления живой ослабленный вирус крупного рогатого скота представляет собой вирус парагриппа типа 3 (PI3). В еще некоторых вариантах осуществления живым ослабленным вирусом крупного рогатого скота является бычий респираторно-синцитиальный вирус (BRSV). В других вариантах осуществления живой ослабленный вирус крупного рогатого скота представляет собой бычий респираторный коронавирус (BRCV). В еще некоторых вариантах осуществления живым ослабленным вирусом крупного рогатого скота является вирус лихорадки Рифт-Валли (RVFV).

Помимо этого, настоящее изобретение предлагает жидкие стабильные вакцины, которые являются поливалентными вакцинами. Поливалентные вакцины по настоящему изобретению содержат любую комбинацию вирусов крупного рогатого скота. В некоторых вариантах осуществления поливалентные вакцины, по настоящему изобретению, содержат и убитые, и живые ослабленные вирусы крупного рогатого скота. В конкретном варианте изобретения по данному способу, поливалентная вакцина содержит убитые вирусы BVDV1, BVDV2 и IBR в сочетании с живыми ослабленными вирусами PI3 и BRSV. В родственном варианте изобретения, поливалентная вакцина содержит убитые вирусы BVDV1, BVDV2 и IBR в сочетании с живыми ослабленными вирусами PI3, BRSV и BRCV.

В других вариантах осуществления поливалентные вакцины по настоящему изобретению содержат только живые ослабленные вирусы крупного рогатого скота. В конкретных вариантах осуществления изобретения, поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV1 и BVDV2. В других вариантах осуществления, поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV1 и IBR. В третьих вариантах осуществления, поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV1 и PI3. В еще некоторых вариантах осуществления, поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV1 и BRSV. В третьих вариантах осуществления, поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV1 и BRCV. В других вариантах осуществления, поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV2 и IBR. В третьих вариантах осуществления, поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV2 и PI3. В еще некоторых вариантах осуществления, поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV2 и BRSV. В других вариантах осуществления, поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV2 и BRCV. В еще некоторых вариантах осуществления, поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы IBR и PI3. В третьих вариантах осуществления, поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы IBR и BRSV. В некоторых других вариантах осуществления, поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы IBR и BRCV. В еще других вариантах осуществления, поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы PI3 и BRSV. В третьих вариантах осуществления, поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы PI3 и BRCV. В других вариантах осуществления, поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BRSV и BRCV.

В других вариантах осуществления изобретения, поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы RVFV и BVDV1. В третьих вариантах осуществления, поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы RVFV и BVDV2. В других вариантах осуществления, поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы RVFV и IBR. В третьих вариантах осуществления, поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы RVFV и PI3. В еще некоторых вариантах осуществления, поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы RVFV и BRSV. В других вариантах осуществления, поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы RVFV и BRCV.

В родственных вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV1, BVDV2 и IBR. В других вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV1, BVDV2 и PI3. В еще некоторых вариантах поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV1, BVDV2 и BRSV. В третьих вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV1, BVDV2 и BRCV. В других вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV1, IBR и PI3. В еще некоторых вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV1, IBR и BRSV. В третьих вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV1, IBR и BRCV. В еще других вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV2, IBR и PI3. В некоторых других вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV2, IBR и BRSV. В других вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV2, IBR и BRCV. В еще некоторых вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV1, PI3 и BRSV.

В третьих вариантах осуществления изобретения поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV1, PI3 и BRCV. В еще некоторых вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV2, PI3 и BRSV. В других вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV2, PI3 и BRCV. В некоторых других вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV1, BRSV и BRCV. В третьих вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV2, BRSV и BRCV.

В еще некоторых вариантах осуществления, поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы IBR, PI3 и BRSV. В других вариантах осуществления, поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы IBR, PI3 и BRCV. В третьих вариантах осуществления, поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы IBR, BRSV и BRCV. В некоторых других вариантах осуществления, поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы PI3, BRSV и BRCV.

В других вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV1, BVDV2, IBR и PI3. В некоторых других вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV1, BVDV2, IBR и BRSV. В третьих вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV1, BVDV2, IBR и BRCV. В других вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV1, BVDV2, PI3 и BRSV. В третьих вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV1, BVDV2, PI3 и BRCV. В некоторых других вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV1, BVDV2, BRCV и BRCV.

В других вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV1, IBR, PI3 и BRSV. В третьих вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит вирус BVDV1, живые ослабленные вирусы IBR, PI3 и BRCV. В некоторых других вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит вирус BVDV1, живые ослабленные вирусы PI3, BRSV и BRCV. В третьих вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV2, IBR, PI3 и BRSV. В других вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит вирус BVDV2, живые ослабленные вирусы IBR, PI3 и BRCV. В некоторых других вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит вирус BVDV2, живые ослабленные вирусы PI3, BRSV и BRCV. В других вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы IBR, PI3, BRSV и BRCV.

В некоторых других вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV1, BVDV2, IBR, PI3 и BRSV. В третьих вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV1, BVDV2, IBR, PI3 и BRCV. В других вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV1, BVDV2, IBR, BRSV и BRCV. В третьих вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV1, BVDV2, PI3, BRSV и BRCV. В некоторых других вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV1, IBR, PI3, BRSV и BRCV. В третьих вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV2, IBR, PI3, BRSV и BRCV. В конкретных вариантах изобретения по данному способу, поливалентная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV1, BVDV2, PI3, IBR, BRSV и BRCV.

Жидкие стабильные вакцины по настоящему изобретению дополнительно содержат убитый вирус и/или бактерию (например, бактерин или ослабленную бактерию) и/или субфракцию бактерина.

Таким образом, любая из жидких стабильных вакцин по настоящему изобретению, которая содержит один или несколько живых вирусов, может дополнительно содержать убитый вирус и/или ослабленную, либо убитую бактерию и/или субфракцию бактерина, например, с одним или несколькими ослабленными или убитыми бактериальными антигенами, такими как, Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica, Histophilus somni и Mycoplasma bovis.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способам оказания помощи в защите крупного рогатого скота от клинического заболевания, которое возникает вследствие вирусной инфекции крупного рогатого животного, включающие введение вакцины животному по настоящему изобретению. Таким образом, настоящее изобретение предлагает способы, которые включают введение крупному рогатому скоту любой жидкой стабильной вакцины по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления введение осуществляется через слизистую оболочку (например, интраназально или перорально). В других вариантах осуществления введение осуществляется парентерально. В третьих вариантах осуществления введение осуществляется внутрикожно. В некоторых других вариантах осуществления введение осуществляется трансдермально. В более конкретных вариантах осуществления, вакцину по настоящему изобретению вводят животному подкожно. В других конкретных вариантах осуществления, вакцину по настоящему изобретению вводят животному внутримышечно. Настоящее изобретение также включает применение первичных и/или бустерных вакцин.

В конкретных вариантах осуществления, способ включает введение крупному рогатому скоту жидкой стабильной вакцины по настоящему изобретению, которая содержит живой ослабленный вирус. В некоторых вариантах осуществления, способ вакцинирования крупного рогатого скота от одного или нескольких вирусов, которые включают BVDV1 и/или BVDV2, и/или IBR, и/или PI3, и/или BRSV, и/или RVFV, и/или BRCV, и/или любой их комбинации, и от бактерий Pasteurella multocida, и/или Mannheimia haemolytica, и/или Histophilus somni, и/или Mycoplasma bovis, и/или любой их комбинации, которая включает комбинирование жидкой стабильной вакцины, содержащей BVDV1, и/или BVDV2, и/или IBR, и/или PI3, и/или BRSV, и/или RVFV, и/или BRCV, и/или любую их комбинацию, с бактериальной формой, содержащей Pasteurella multocida, и/или Mannheimia haemolytica, и/или Histophilus somni, и/или Mycoplasma bovis, и/или любую их комбинацию, для составления комбинированной вакцины, а затем ее введение крупному рогатому скоту.

В конкретных вариантах осуществления жидкая стабильная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV1, BVDV2 и IBR. В других вариантах осуществления жидкая стабильная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV1, BVDV2, PI3 и BRSV. В третьих вариантах осуществления, жидкая стабильная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV1, BVDV2, PI3, IBR и BRSV. В некоторых других вариантах, жидкая стабильная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV1, BVDV2, PI3, IBR, BRSV и BRCV.

Любая из жидких стабильных вакцин, содержащих живой ослабленный вирус крупного рогатого скота по настоящему изобретению также может быть скомбинирована с одним или несколькими ослабленными или убитыми бактериальными антигенами, такими как, Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica, Histophilus somni и Mycoplasma bovis. В некоторых вариантах осуществления бактериальный антиген(ы) находится в отдельной форме, например, вакцине, до комбинирования с жидкой стабильной вакциной, содержащей живой ослабленный вирус крупного рогатого скота по настоящему изобретению и последующего введения комбинированной вакцины животному.

В конкретном варианте осуществления жидкая стабильная вакцина содержит живые ослабленные вирусы BVDV1, BVDV2, PI3, IBR и BRSV (плюс-минус живой ослабленный вирус BRCV), которые комбинируются с живыми ослабленными антигенами Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica и Histophilus somni. В конкретных вариантах изобретения по данному способу, жидкая стабильная противовирусная вакцина и бактериальная вакцина, содержащая живой ослабленный вирус хранятся в отдельных контейнерах и объединяются до введения комбинированной вакцины животному.

Настоящее изобретение дополнительно относится к наборам, которые включают первый контейнер, содержащий жидкую стабильную вакцину с живым ослабленным вирусом крупного рогатого скота по настоящему изобретению и второй контейнер, содержащий бактериальную вакцину крупного рогатого скота. В одном из вариантов осуществления, первый контейнер включает жидкую стабильную вакцину с живым ослабленным вирусом крупного рогатого скота, которая содержит один или несколько живых ослабленных вирусов BVDV1, BVDV2, PI3, IBR, BRSV, RVFV, или BRCV, а второй контейнер включает бактериальную вакцину крупного рогатого скота, которая содержит один или несколько антигенов Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica, Mycoplasma bovis и Histophilus somni. В некоторых вариантах осуществления изобретения, бактериальная вакцина крупного рогатого скота хранится в виде лиофилизата. В конкретных вариантах осуществления бактериальная вакцина крупного рогатого скота является живой бактериальной вакциной крупного рогатого скота, в которой все бактериальные антигены представляют собой живые ослабленные антигены. В других вариантах осуществления бактериальная вакцина крупного рогатого скота содержит, по меньшей мере, один убитый бактериальный антиген. В более конкретном варианте изобретения по данному способу все бактериальные антигены крупного рогатого скота являются убитыми бактериальными антигенами. В некоторых вариантах осуществления набор также содержит инструкции по хранению и/или комбинированию и/или введению вакцины в наборе.

Предложены также способы изготовления любых возможных жидких стабильных вакцин по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ включает комбинацию терапевтически эффективного количества живого ослабленного вируса с 5-40% добавкой сахара (например, сахарный спирт, либо сочетание сахарного спирта с бесспиртовым сахаром), аминокислотой, и буферным раствором с рН 6,0 до 8,0, чтобы создать жидкую стабильную вакцину. Аминокислотой может быть аргинин, глицин, глутаминовая кислота, метионин, либо комбинации аргинина, глицина, глутаминовой кислоты и/или метионина. В конкретных вариантах осуществления изобретения аргинин и/или глицин и/или глутаминовая кислота в жидкой стабильной вакцине представлены конечной концентрацией от 0,15 до 0,75 моль. В некоторых вариантах осуществления изобретения вакцина дополнительно содержит метионин в конечной концентрации от 0,025 до 0,3 моль в жидкой стабильной вакцине. В конкретных вариантах осуществления изобретения терапевтически эффективным количеством живого ослабленного вируса является терапевтически эффективное количество живого ослабленного вируса крупного рогатого скота. В конкретных вариантах изобретения по данному способу, терапевтически эффективное количество живого ослабленного вируса крупного рогатого скота включает терапевтически эффективные количества живых ослабленных вирусов BVDV1, BVDV2, PI3, IBR и BRSV. В более конкретном варианте изобретения по данному способу, терапевтически эффективное количество живого ослабленного вируса крупного рогатого скота включает терапевтически эффективные количества живых ослабленных вирусов BVDV1, BVDV2, PI3, IBR, BRSV и BRCV.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способам хранения любой из жидких стабильных вирусных вакцин крупного рогатого скота по настоящему изобретению в течение 9 месяцев, либо 12 месяцев, либо 15 месяцев, либо 18 месяцев, либо 24 месяцев, либо 30 месяцев, или гораздо дольше, включающие использование жидкой стабильной вирусной вакцины крупного рогатого скота по настоящему изобретению и ее хранение при температуре примерно от 0°С до 7°С в течение 9 месяцев, либо 12 месяцев, либо 15 месяцев, либо 18 месяцев, либо 24 месяцев, либо 30 месяцев, или гораздо больше, с жидкой стабильной вирусной вакциной крупного рогатого скота, остающейся эффективной в течение соответствующего времени хранения 9 месяцев, либо 12 месяцев, либо 15 месяцев, либо 18 месяцев, либо 24 месяцев, либо 30 месяцев, или гораздо дольше.

Данные и другие аспекты по настоящему изобретению будут лучше оценены посредством ссылки на последующее подробное описание.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ0

Учитывая то, что жидкие стабильные вирусные вакцины крупного рогатого скота по настоящему изобретению содержат живые ослабленные вирусы, до настоящего времени было необходимо особое внимание в ходе разработки вакцины для поддержания титра ослабленных вирусов на уровне, который надежно ниже того, что способен привести к значительному побочному эффекту. В действительности, большинство вакцин, содержащих живой ослабленный вирус крупного рогатого скота, лиофилизируют и лиофилизация может приводить к существенному снижению эффективности живых ослабленных вирусных вакцин, как за счет самого процесса лиофилизации, так и продолжительного периода времени при длительном хранении.

Настоящее изобретение преодолело данную проблему посредством предложения жидких стабильных вакцин крупного рогатого скота, которые остаются эффективными, даже во время хранения, без необходимости увеличения первоначального титра живого ослабленного вирусного антигена выше безопасно допустимого уровня. В качестве дополнительного преимущества, настоящее изобретение предлагает возможности для снижения стоимости производства вакцин, обусловленные значительно уменьшенным количеством живых ослабленных вирусов крупного рогатого скота, которое необходимо, чтобы создать такую безопасную и эффективную вакцину. В дополнение к этому, вакцины, содержащие живой ослабленный вирус крупного рогатого скота по настоящему изобретению, являются более удобными в использовании, чем их лиофилизированные аналоги. Таким образом, настоящее изобретение предлагает безопасные и эффективные вакцины, содержащие живой ослабленный вирус крупного рогатого скота, которые могут храниться в виде жидкостей при низких температурах, и остаются стабильными на протяжении от 12 до 18 месяцев, и/или от 18 до 24 месяцев, и/или гораздо дольше.

Вместе с тем неожиданно, что жидкие стабильные вакцины, содержащие живой вирус крупного рогатого скота, по настоящему изобретению могут содержать вирусы крупного рогатого скота любого типа. Таким образом, жидкие стабильные вакцины, содержащие живой вирус, по настоящему изобретению могут содержать вирусы крупного рогатого скота, как в оболочке, так и без нее. В дополнение к этому, жидкие стабильные живые вирусные вакцины по настоящему изобретению могут содержать живые ослабленные вирусы крупного рогатого скота, имеющие одноцепочечные геномы РНК, одноцепочечные или двухцепочечные геномы ДНК. Помимо этого, в отдельных случаях, например, с использованием живого ослабленного вируса RVFV, жидкие стабильные вакцины, содержащие живой вирус крупного рогатого скота, могут также применяться для вакцинации овец и коз.

Использование единичных терминов в описании для удобства никоим образом не предполагает больших ограничений. Так, например, ссылка на «добавку сахара» включает ссылку на одну или несколько подобных добавок сахара, если не указано иное. Использование множественных терминов также не предполагает ограничений, если не указано иное. Аналогичным образом, химическое соединение, которое называется кислотой или ее соответствующим основанием, если не предусмотрено иное, как отмечается в настоящем документе, предполагает, либо способ, либо форму соединения. Следовательно, использование термина глутаминовая кислота означает включение в состав глутамата и наоборот.

В данном контексте, термин «вакцина» представляет собой композицию, которая подходит для применения животному организму (в том числе, в некоторых вариантах осуществления изобретения, человеческим организмам), которая непосредственно после введения животному индуцирует достаточно мощный иммунный ответ, чтобы оказать минимальную помощь в защите от клинических проявлений заболевания, возникающих в результате инфицирования микроорганизмом дикого типа, то есть, достаточно сильным для помощи в профилактике манифестации болезни и/или профилактике, уменьшении интенсивности либо лечении клинических проявлений болезни. Если точно не указано иное, использование термина вакцина включает поливалентные вакцины.

В данном контексте, «поливалентная вакцина» представляет собой вакцину, которая содержит два или несколько различных антигенов. В конкретном варианте изобретения по данному способу, поливалентная вакцина активизирует иммунную систему реципиента в отношении двух или нескольких различных патогенов.

В данном контексте, «жидкая стабильная» вакцина представляет собой вакцину, содержащуюся в виде жидкости (в том числе, жидкой поливалентной вакцины), которая сохраняет эффективность, по крайней мере, в течение одного года в условиях хранения при температуре 7°C или ниже (например, в типовом холодильнике, и/или при 0°С-7°С). В конкретных вариантах осуществления изобретения жидкая стабильная вакцина сохраняет эффективность в условиях хранения при температуре 7°С или ниже, по крайней мере, в течение 1,5 лет. В более конкретных вариантах осуществления изобретения жидкая стабильная вакцина остается эффективной в условиях хранения при температуре 7°С или ниже, по крайней мере, в течение 2 лет. В еще более конкретных вариантах осуществления изобретения жидкая стабильная вакцина сохраняет эффективность в условиях хранения при температуре 7°С или ниже, по крайней мере, в течение от 2,5 до 3 лет.

В данном контексте, термины «защищать», «защита», «обеспечить защиту», «обеспечение защиты» и «помогает в защите» не предусматривают полной защиты от каких-либо признаков инфекции. К примеру, «помогает в защите» может означать, что защита является достаточной, при которой после стимуляции антигеном, признаки скрытой инфекции, по крайней мере, уменьшаются, и/или то, что одна или несколько истинных клеточных, физиологических или биохимических причин или механизмов, обуславливающих симптомы, уменьшаются и/или устраняются. Следует понимать, что «уменьшать», используемое в данном контексте, означает относящийся к состоянию инфицированности, в том числе, молекулярному состоянию инфицированности, а не только физиологическому состоянию инфицированности.

Термин «профилактически эффективное количество» относится к количеству композиции, которое при введении крупному рогатому скоту значительно уменьшает вероятность и/или выраженность инфекции/заражения, обусловленной конкретным патогенным микроорганизмом.

«Метафилактика» представляет собой своевременную массовую лекарственную терапию целой группы животных для устранения или сведения к минимуму ожидаемой вспышки заболевания, например, у одного или нескольких животных с высоким риском инфекции/заражения. В одном конкретном варианте осуществления изобретения, телята высокого риска являются маловесным, смешанным, перевезенным на дальние расстояния крупным рогатым скотом с неизвестными историями болезни.

Термин «химиопрофилактика» относится к введению лекарственного препарата/лечению, например, одной или нескольких профилактических композиций, с целью предотвращения или уменьшения вирусной, бактериальной и/или паразитарных инфекций/заражения; и/или профилактики или уменьшения заболевания и/или признаков болезни, связанных с инфекцией/заражением.

Термин «профилактическая композиция» относится к любому веществу, используемому отдельно или в сочетании с другими веществами, что значительно уменьшает вероятность и/или выраженность инфекции/заражения, обусловленной конкретным патогенным микроорганизмом у крупного рогатого скота. В одном из вариантов осуществления изобретения крупное рогатое животное подвержено высокому риску развития респираторной инфекции крупного рогатого скота, последующему смешению, транспортировке, изменениям погоды, изменениям в питании, и/или другим стресс-факторам, которые могут вызвать признак и/или заболевание, связанные с наличием вирусных, бактериальных или паразитарных патогенных микроорганизмов, в большинстве случаев, относящихся к крупному рогатому скоту, на которого направлено вещество или комбинация веществ.

В данном контексте, термин «терапевтически эффективное количество» означает количество определенного антигена, например, живого ослабленного вируса крупного рогатого скота, которого достаточно для обеспечения защиты и/или помощи в защите от патогенного микроорганизма, когда антиген осуществляет защиту от него, что обеспечивает однократное введение и/или что предназначается, предлагается в качестве начального введения с одним или несколькими последующим вторичным введением(ями).

В данном контексте, «эффективная» вакцина содержит терапевтически эффективное количество определенного антигена. «Эффективная» вакцина сохраняет достаточный титр для определенного антигена, что не противоречит нормативным требованиям для данного антигена в отношении зоны применения куда вводится вакцина, например, введение вакцины в Соединенных Штатах регулируется Департаментом сельского хозяйства Соединенных Штатов (USDA).

В данном контексте, термин «фармацевтически приемлемый» используется как прилагательное, которое означает измененное существительное, подходящее при использовании фармацевтического препарата. При его использовании, например, для описания вспомогательного вещества в фармацевтической вакцине, он определяет вспомогательное вещество как совместимое с другими компонентами композиции и не являющимся неблагоприятно вредным для предполагаемого реципиента.

Термин «носитель» относится к разбавителю, адъюванту, вспомогательному веществу или наполнителю лекарственной формы, с которыми вводится соединение. Фармацевтически приемлемые носители могут быть стерильными жидкостями, такими как вода и/или масла, в том числе, нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как, арахисовое, соевое, минеральное, кунжутное масла и тому подобные. Вода или водные солевые растворы и водный раствор сахара, например, растворы декстрозы и/или глицерина могут применяться в качестве носителей, в частности, растворов для инъекций. В дополнение к этому, носителем может являться и/или содержать гидроколлоид и/или раствор полимера, например, чтобы загустить вакцины крупного рогатого скота, которые должны распыляться на крупный рогатый скот, например, телят.

В данном контексте, «адъювант» представляет собой вещество, которое способствует, либо усиливает каскад иммунологических событий, в конечном итоге приводящий к лучшему иммунологическому ответу, т.е. комплексному системному ответу на антиген. Адъювант, как правило, не требуется для возникновения иммунологического ответа, но способствует, или усиливает этот ответ.

В данном контексте, «систематическое введение» представляет собой введение в кровеносную систему организма (включающую сердечно-сосудистую и лимфатическую системы), влияя, таким образом, на организм в целом, а не отдельный участок, как например, желудочно-кишечный тракт (к примеру, пероральное или ректальное введение) и дыхательная система (к примеру, интраназальное введение). Систематическое введение может осуществляться, например, путем введения в мышечную ткань (внутримышечно), в кожу (внутрикожно, трансдермально или надкожно), под кожу (подкожно), под слизистую (субмукозно) и в вены (внутривенно) и т.д.

«Парентеральное введение» включает подкожные, субмукозные, внутривенные, внутримышечные, внутрикожные инъекции, и инфузии.

В данном контексте, «добавкой сахара» является сахар с 5-12 атомами углерода (например, сахароза, мальтоза, трегалоза, декстроза, лактоза, глюкоза, фруктоза, галактоза) или сахарный спирт/полиол (например, сорбит, маннит, арабит, инозит, мальтит). Если иное не указано более определенно, формулируется в противоположном смысле, процент (%) добавки сахара определяется в качестве массы (w) добавки сахара к объему (v) вакцины, (масса/объем) в вакцине.

В данном контексте, «невосстанавливающий сахар» представляет собой добавку сахара, которая в основной водной среде не образует каких-либо соединений, содержащих альдегидную группу. Примеры невосстанавливающих сахаров по настоящему изобретению, включают сахарозу и трегалозу.

В данном контексте, «несахарный спирт» и «бесспиртовой сахар» используются равнозначно. Добавкой сахара, которая является «несахарным спиртом» (или «бесспиртовым сахаром») как в данном контексте, может быть любая добавка сахара, не являющаяся сахарным спиртом, например, невосстанавливающим сахаром.

В данном контексте, если иное не указано более определенно, формулируется в противоположном смысле, процент (%) твердой добавки, например, добавки сахара или желатина, в вакцине на основе 1% раствора составляет 1г твердой добавки/100 мл объема вакцины (масса/объем).

В данном контексте, если иное не указано более определенно, формулируется в противоположном смысле, процент (%) жидкой добавки, например, этанола, в вакцине на основе 1% раствора составляет 1 мл жидкой добавки/100 мл объема вакцины (объем/объем).

В данном контексте, термин «приблизительно», используется равнозначно с термином «примерно» и, как правило, означает, что значение находится в пределах двадцати пяти процентов указанной величины, если не указано иное, например, концентрация «примерно» 2 ммоль EDTA может составлять от 1,5 ммоль до 2,5 ммоль EDTA.

В данном контексте, если иное не указано более определенно, формулируется в противоположном смысле, определяемое значение рН является значением рН, которое определяется/измеряется при 25°С.

Поскольку жидкие стабильные вакцины по настоящему изобретению оптимальны в диапазоне значения рН от 6,0 до 8,0, жидкие стабильные вакцины по настоящему изобретению содержат буферный раствор. Буферные растворы для применения в жидких стабильных вакцинах по настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются этим: фосфат калия, фосфат натрия, Трис, Трис-гистидин, Бис-Трис, Бис-Трис-пропан, пирофосфат натрия или калия, имидазол, трубы, PIPES, ACES, MOPS, MOPSO, BES, TES, трицин, глицилглицин и HEPES. Буферные растворы могут быть доведены до необходимого рН с использованием любого подходящего противоиона.

Гидролизат нативного казеина, который может использоваться в жидких стабильных вакцинах по настоящему изобретению, может быть получен при помощи ряда методов, включая, например, также кислотный гидролизат или ферментативный гидролизат. Подобные гидролизаты содержатся в форме смешанных аминокислот и пептидов, имеющих все аминокислоты, первоначально присутствующие в казеине. Один поджелудочной гидролизат нативного казеина, который может использоваться в жидких стабильных вакцинах по настоящему изобретению продается в виде CASEIN HYDROLYSATE ENZYMATIC^® от MP Biomedicals. Сопоставимые продукты продаются под названием NZ-AMINE^®, NZ-AMINE^® А, NZ-AMINE^® AS и NZ-AMINE^® B, и Tryptone от Sigma-Aldrich.

Примеры гидроколлоидов, которые могут составлять вакцины по настоящему изобретению, включают: желатин, полимеры крахмала, и камеди, такие как ксантановая камедь, каррагенин и аравийская камедь (гуммиарабик).

Поливалентные вакцины: Настоящее изобретение предлагает жидкие стабильные поливалентные вакцины. Жидкая стабильная поливалентная вакцина, содержащая вирус крупного рогатого скота по настоящему изобретению может содержать два или несколько антигенов, включая один или более из следующих живых ослабленных вирусов крупного рогатого скота: BVDV1, BVDV2, вирус PI3, вирус IBR, BRSV, RVFV, и/или BRCV. Как уже отмечалось ранее, жидкая стабильная поливалентная вакцина содержащая вирус крупного рогатого скота по настоящему изобретению может также содержать один или более из следующих живых ослабленных вирусов: BVDV1, BVDV2, вирус PI3, вирус IBR, BRSV, RVFV, и/или BRCV, наряду с одним или несколькими убитыми вирусами крупного рогатого скота.

В дополнение к этому, жидкая стабильная вакцина, содержащая живой, ослабленный вирус крупного рогатого скота по настоящему изобретению может включать один или несколько живых ослабленных или убитых бактериальных антигенов. В родственных вариантах осуществления, жидкая стабильная вакцина по настоящему изобретению может быть объединена с одним или несколькими живыми, ослабленными или убитыми бактериальными антигенами в ряде случаев до введения, но после хранения. В конкретных вариантах осуществления изобретения по данному способу, бактериальный антиген(ы) входит в состав вакцины (либо моновалентной, либо поливалентной) и, бактериальной вакцины крупного рогатого скота, которая объединена с жидкой стабильной вакциной, содержащей живой ослабленный вирус крупного рогатого скота, по настоящему изобретению до введения. В более конкретном варианте осуществления, жидкая стабильная вакцина, содержащая живой, ослабленный вирус крупного рогатого скота, может быть использована для разжижения/растворения лиофилизированной бактериальной вакцины крупного рогатого скота до введения комбинированной вакцины животному. В других вариантах осуществления, жидкая стабильная вакцина, содержащая живой, ослабленный вирус крупного рогатого скота, и ослабленную и/или убитую бактериальную вакцину крупного рогатого скота вводят последовательно.

Таким образом, жидкая стабильная вакцина, содержащая живой, ослабленный вирус крупного рогатого скота по настоящему изобретению может быть объединена с одним или несколькими живыми ослабленными или убитыми бактериальными вакцинами, содержащими антиген, как например, Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica, Histophilus somni и Mycoplasma bovis до введения животному. В связи с этим, в некоторых вариантах осуществления, ослабленная бактериальная вакцина содержит ослабленный Mannheimia haemolytica. В конкретных вариантах осуществления изобретения по данному способу, ослабленный Mannheimia haemolytica является выделенным лейкотоксином. В конкретном варианте осуществления изобретения по данному способу, ослабленный Mannheimia haemolytica является авирулентным, живым Mannheimia haemolytica, в котором ген, кодирующий лейкотоксин А, был изменен пропуском нуклеотидной последовательности, которая кодирует аминокислоты 34-378 белка лейкотоксина А [см., U.S. 6331303 В1, полностью включенный в настоящем документе посредством ссылки].

В других вариантах осуществления ослабленная бактериальная вакцина содержит ослабленный Pasteurella multocida. В более конкретных вариантах осуществления Pasteurella multocida содержит делецию в собственном гене hyaE. В конкретном варианте осуществления изобретения по данному способу, ослабленный Pasteurella multocida представляет собой живую, авирулентную, Pasteurella multocida, в которой ген, кодирующий белок hyaE, был изменен пропуском нуклеотидной последовательности, которая кодирует аминокислоты 239-359 белка hyaE, и/или пропуском нуклеотидов 718-1084 [см. U.S. 7351416 B2, полностью включенный в настоящем документе посредством ссылки]. В других вариантах осуществления ослабленная бактериальная вакцина содержит ослабленный Histophilus somni. В более конкретных вариантах осуществления Histophilus somni представляет собой живую, авирулентную Histophilus somni, которая является мутантной aroA.

В конкретных вариантах осуществления по данным способам по настоящему изобретению, ослабленная бактериальная вакцина содержит, как ослабленный Mannheimia hemolytica, так и ослабленный Pasteurella multocida. В более конкретном варианте осуществления, антибактериальная композиция представляет собой ослабленную бактериальную вакцину, содержащую авирулентный, живой Mannheimia haemolytica, в котором ген, кодирующий лейкотоксин А, был изменен пропуском нуклеотидной последовательности, которая кодирует аминокислоты 34-378 белка лейкотоксина А, и авирулентный, живой бактериальный Pasteurella multocida, в котором ген, кодирующий белок hyaE, был изменен отсутствием нуклеотидной последовательности, которая кодирует аминокислоты 239-359 белка hyaE и/или отсутствием нуклеотидов 718-1084. В более конкретных вариантах осуществления по данным способам по настоящему изобретению, ослабленная бактериальная вакцина содержит ослабленный Mannheimia hemolytica, ослабленный Pasteurella multocida и авирулентный Histophilus somni.

Адъюванты: Как было отмечено выше, вакцины по настоящему изобретению могут также содержать адъювант. В конкретных вариантах осуществления, адъювант содержит алюминиевую соль. Использование алюминиевых солей в сочетании с живыми вирусными вакцинами было описано ранее. В конкретных вариантах осуществления алюминиевую соль выбрана из группы, состоящей из фосфата алюминия, алюмокалиевого фосфата и гидроксида алюминия. Другие хорошо известные адъюванты включают углеводородные масла и сапонины. Одним адъювантом фосфата алюминия является REHYDROPHOS^® (General Chemical, Parsippany, New Jersey). Примеры адъювантов гидроксида алюминия включают: REHYDROGEL^®, REHYDROGEL^®HPA или REHYDROGEL^®LV (General Chemical, Parsippany, New Jersey). Другие хорошо известные адъюванты включают углеводородные масла, полимеры, сапонины и/или адъювант, изготовленный из гелевых частиц акрилата натрия в водном растворе, например, MONTANIDE^®PET GELA^® (Seppic, Paris France). Один низкомолекулярный сополимерный адъювант может образовывать поперечные связи в растворе, чтобы преобразоваться в высокомолекулярный гель, например, POLYGEN^® (MVP Laboratories, Omaha). Количество адъюванта при добавлении, как правило, составляет примерно от 1% до 20% (объем/объем) в вакцине. В конкретных вариантах осуществления количество адъюванта находится в пределах примерно от 2% до 10% (объем/объем).

Вакцины по настоящему изобретению также содержат антибактериальный компонент, как например, антибиотик. Примеры таких антибиотиков могут включать: 10-100 мкг/мл гентамицина, 0,5-5,0 мкг/мл амфотерицина В, 10-100 мкг/мл тетрациклина, 10-100 ед./мл нистатина (микостатин), 10-100 ед./мл пенициллина, 10-100 мкг стрептомицина, 10-100мкг полимиксина В и 10-100 мкг неомицина.

Введение вакцины: Жидкие стабильные вирусные вакцины по настоящему изобретению могут вводиться любым обычным способом, например, путем систематического введения, включая, парентеральное введение, такое как, без ограничения, субкутаннное или внутримышечное введение. Жидкие стабильные вирусные вакцины по настоящему изобретению, кроме того, могут вводиться через слизистую оболочку, как например, интраназально, перорально, интратрахеально, ректально и/или путем вутриглазного введения. В качестве альтернативного варианта, вакцины можно вводить через трансдермальный пластырь, путем отсроченного высвобождения имплантата, скарификации или местного введения. Предполагается, что жидкая стабильная вирусная вакцина по настоящему изобретению, может быть также введена с помощью питьевой воды и/или пищи реципиенту крупному рогатому животному.

Вакцины (в том числе поливалентные вакцины) по настоящему изобретению также могут вводиться как часть комплексной терапии, т.е. терапии, которая включает, в дополнение к самой вакцине, введение одного или нескольких дополнительных активнодействующих веществ, препаратов и т.д. Поскольку по примеру, который следует принять во внимание, количество вакцины, представленное «терапевтически эффективным» количеством, может быть больше или меньше, количества вакцины, которое составляет «терапевтически эффективное» количество, в случае, если вакцина была введена в монотерапии. Другие препараты могут включать те, которые известны в данной области техники: такие как, например, анальгетики, жаропонижающие средства, отхаркивающие, противовоспалительные препараты, антигистамины и/или введение растворов.

В некоторых вариантах осуществления по данным способам по настоящему изобретению, вирусная вакцина по настоящему изобретению, которая подходит для введения через слизистую оболочку, содержит ослабленный вирус IBR. В более конкретных вариантах осуществления вирусная вакцина по настоящему изобретению, которая подходит для введения через слизистую оболочку, содержит живой ослабленный вирус IBR, BVDV1, BVDV2, вирус PI3 и BRSV.

Уровень иммуногенности может быть определен экспериментально путем подбора дозы вакцины и научно-исследовательскими методами по стимуляции антигеном, широко известными в данной области техники. Такого рода методы, как правило, включают вакцинацию поголовья животных вакциной в различных дозировках, и затем антигенную стимуляцию животных вирулентным вирусом для определения минимальной защитной дозы.

Факторы, влияющие на предпочтительный режим дозирования, могут включать, например, виды или породы (например, крупного рогатого животного), возраст, вес, пол, пищевой рацион, активность, объем легкого, и состояние животного; способ введения; эффективность, безопасность и статусы продолжительности иммунитета определенной вакцины, которая применялась; если использовалась система доставки; и вводилась ли вакцина в составе лекарственного средства и/или комбинированной вакцины. Таким образом, фактически используемая дозировка, может изменяться для конкретных животных, и, следовательно, отклоняться от обычных доз, упомянутых выше.

Установление такого рода корректирующих дозировок находится, как правило, в компетенции специалистов в данной области разработки вакцин с использованием традиционных средств.

Подобным образом, объем, с которым можно вводить такого рода дозу, в основном, находится в пределах от 0,1 мл (характерный для внутрикожного или трансдермального введения) до 5,0 мл. Стандартный диапазон для вводимого объема составляет от 0,2 и 2,0 мл, и примерно от 1,0 до 2,0 мл для внутримышечного или субкутанного введения.

Предполагается, что вакцина может вводиться реципиенту вакцины за один раз или, в другом варианте, два или более раз за несколько дней, недель, месяцев, или лет. В некоторых вариантах осуществления изобретения, вакцину вводят, по меньшей мере, два раза. В некоторых определенных вариантах осуществления, например, вакцину вводят дважды, со второй дозы (к примеру, ревакцинирующая доза), осуществляют введение, по меньшей мере, 2 недели после первой дозы. В конкретных вариантах осуществления, вакцину вводят дважды, со второй дозы осуществляют введение не более 8 недель после первой дозы. В других вариантах осуществления, вторая доза вводится с 1 недели до 2-х лет после первой дозы, с 1,5 до 8 недель после первой дозы, или с 2 до 4 недель после введения первой дозы. В других вариантах осуществления, вторая доза вводится около 3 недель после первой дозы.

В приведенных выше вариантах осуществления изобретения, первая и последующие дозы могут изменяться, в том числе, по количеству и/или форме. Зачастую, тем не менее, дозы схожи по количеству и форме. В тех случаях, когда вводится только одна доза, количество вакцины в такой дозе в монотерапии, как правило, содержит терапевтически эффективное количество данной вакцины. В тех случаях когда, при этом, вводят более одной дозы, количество вакцины в таких дозах в сочетании может составить терапевтически эффективное количество. В дополнение к этому, вакцина может быть введена на начальном этапе, а затем ревакцинацию можно осуществлять с 2 до 12 недель после этого, как было указано выше. Однако, последующие введения вакцины должны осуществляться ежегодно (1 год) или два раза в год (2 год), вне зависимости от того, проводилась ревакцинация или нет.

Настоящее изобретение может быть лучше объяснено посредством ссылки на следующий Пример, не имеющий ограничительного характера, который предлагается в качестве иллюстрирующего изобретение. Следующий Пример представлен в целях более полной иллюстрации вариантов осуществления настоящего изобретения. Это, никоим образом, не должно рассматриваться, при этом, в качестве ограничения широкого объема изобретения.

ПРИМЕР

ПРИМЕР 1

СТАБИЛЬНОСТЬ ЖИДКИХ ВАКЦИН, СОДЕРЖАЩИХ ВИРУС КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

ВВЕДЕНИЕ

Вакцины являются крайне необходимыми для профилактики заболеваний, вызываемых патогенными микроорганизмами у людей и животных. Вполне закономерно, вместе с тем, сосредоточить внимание на типе вакцины, которая применяется для организма человека, отличающаяся от таковой для животных. По этой причине, для человеческого организма, многие вакцины являются моновалентными вакцинами, то есть, содержащими одно иммунизирующее вещество, которое обеспечивает защиту от одного патогенного фактора. С другой стороны, поливалентные вакцины широко распространены в ветеринарии. Это, прежде всего, справедливо для вакцин, применяемых в скотоводстве на промышленной основе, например, производителям крупного рогатого скота, для которых стоимость многократных вакцинаций становится существенной проблемой. Кроме того, сбор крупного рогатого скота на вакцинацию, посредством их проведения через ограничительное устройство и концентрирование животных на небольшой территории в непосредственной близости от людей, создает стрессовую окружающую обстановку для животных, которая, зачастую, может приводить к подавлению иммунной системы, отсутствию аппетита, и/или механическому травмированию крупного рогатого скота. Более того, каждое введение вакцины может потенциально оказывать воздействие на местные ткани, которые окружают соответствующий участок в месте инъекции.

Соответственно, в ветеринарии, во многих случаях является целесообразным объединение большинства антигенов, в качестве возможных, в одной поливалентной вакцине. Тем не менее, разработка такого рода поливалентных вакцин является не такой простой, как можно предположить. Например, антигены, используемые для приготовления вакцины, в определенной лекарственной форме могут оказаться несовместимыми. Кроме того, лекарственные формы, которые приводят к повреждению местных тканей, в большинстве случаев, не приемлемы.

В дополнение, препараты вакцин, которые могут, в иных случаях, превосходить жидкие стабильные, как правило, имеют тенденцию к более высокому содержанию растворенных веществ. Препараты вакцин с более высоким содержанием растворенных веществ (более чем, от 30 до 40%), как правило, рассматриваются в качестве гипертонических. Подкожное введение гипертонического раствора может вызвать местную припухлость, отек и, возможно, привести к повреждению тканей. К этому можно добавить, что даже в отсутствие тканевого повреждения, местная припухлость или отек в месте инъекции зрительно могут быть нежелательны для заказчика. Гипертонические препараты действительно становятся не так актуальны, по отношению к поливалентным вакцинам, которые доставляются интраназально или перорально. Однако, более востребованным препаратом все еще может быть тот, который имеет более низкое содержание твердого вещества, поскольку, это, как правило, находится в зависимости с более низкой стоимостью изделий.

Материалы и методы

Приготовление нерасфасованного антигена: Были изготовлены два набора каждого вирусного антигена (BVDV1, BVDV2, PI3 и IBR). Один набор был культивирован в среде, свободной от продуктов животного происхождения, а другой набор культивировали в среде, содержащей компоненты животного происхождения. Данные в таблицах 2А и 2В, указанные ниже, получены с использованием вирусов, культивированных в среде, содержащей компоненты животного происхождения.

А. Исходные реагенты:

В. Регулирование значения рН: Нерасфасованным лекарственным формам давали возможность смешаться в течение 2-3 часов, затем разделяли: 3,5 л разделяли на 4°С (низкий диапазон), а 4,5 л на 25°C (повышенный диапазон).

Низкий диапазон: лекарственную форму охлаждали до 4°C (при этом перемешивая, если возможно) и доводили рН до 7,25. Затем лекарственную форму оставляли на ночь при 4°C и на следующее утро, вновь измеряли рН, чтобы гарантировать, что рН остается стабильным при 7,25. В случае если было необходимо незначительное регулирование при каком-либо значении, использовали соответствующую кислоту/основание (К2НРО4 или КН2РО4).

Повышенный диапазон: лекарственную форму нагревали до 25°С (при этом перемешивая, если возможно) и доводили рН до 7,25. Затем лекарственную форму оставляли на ночь при 25°C и на следующее утро, вновь измеряли рН, чтобы гарантировать, что значение рН остается стабильным при 7,25. В случае если было необходимо незначительное регулирование при каком-либо значении, использовали соответствующую кислоту/основание (К2НРО4 или КН2РО4). Значение рН, изменяющееся между 15°С, 25°С и 37°C являлось допустимым, поэтому лекарственная форма была активной и сохранялась при каждой из 3 температур.

Прибор для измерения рН: рН измеряли с использованием в значительной степени чувствительного датчика рН и измерительного прибора. Измерительный прибор отображает рН до 3 значащих цифр справа от десятичного знака. Существует отдельный датчик температуры с измерительным прибором, и оба они должны находиться в растворе и быть стабильными. Регулировка занимает оптимальное количество времени, рН является решающим для эксперимента. Данный рН-метр выполнен с возможностью калибровочной кривой по 5 точкам, в пределах которой 3 точки находятся в абсолютном минимуме.

С. Стерилизация посредством фильтрации и барботирование аргоном: После того, как было проведено предварительное регулирование значения рН, все 7 лекарственных форм стерилизовали посредством фильтрации с использованием 0,2 мкм фильтра (предпочтительная матрица фильтров = полиэфирсульфон PES только за счет улучшенной пропускной способности фильтра). Как правило, фильтрация выполняется при помощи вакуума, вторичной выгодой вакуумной фильтрации является дополнительная дегазация лекарственной формы.

После того, как лекарственную форму простерилизовали посредством фильтрации, ее барботируют газообразным аргоном для увеличения истощения O_2, что благоприятно скажется на снижении реакционной способности лекарственной формы в течение продолжительного периода. Как только барботирование будет полностью обеспечено, в объект перед началом хранения осуществляется подача слоя аргона (для гарантии такого герметичного уплотнения, насколько возможно для хранения).

D. На следующее утро изготавливают лекарственную форму, рН проверяют/доводят до 7,25 при нужной температуре (4°С или 25°C). Если лекарственная форма и предшествующие исследования были выполнены правильно, рН должно быть близко к 7,25. С инкубацией в течение ночи рН будет немного изменяться, вследствие завершения химических реакций, связанных с раннее проведенным регулированием рН и последующей дегазацией.

Е. Размораживание вируса: Оптимальные условия, которые должны быть использованы для размораживания вируса, как правило, быстрое оттаивание на теплой водяной бане при частом перемешивании, чтобы предотвратить большое количество жидкости из-за нагрева, в случае если необходимо размораживание. Процесс считается завершенным, когда в лекарственной форме остается небольшое количество льда, чтобы поддерживать компоненты холодными, пока она не будет готова к использованию и, чтобы устранить остаточное тепловыделение от жидкой порции.

F. Добавление вируса к нерасфасованным лекарственным формам: Приготовление вакцинной смеси: 250 мл 4°С лекарственной формы и 750 мл 25°С лекарственной формы отбирают из основной массы каждой из лекарственных форм (все 7 лекарственных форм) и помещают в соответствующую емкость (флаконы с завинчивающимися крышками Nalgene). Если вирус добавляют в очень короткий временной интервал (несколько минут), тогда он может быть добавлен без дальнейших проблем. Если вирус добавляют не сразу, то следует применить подачу слоя аргона к объекту, чтобы вытеснить остаточный О₂. После того, как добавили вирус, следует применить подачу свежего слоя аргона в объект перед смешиванием. Газообразный аргон следует добавлять к флакону, используя низкий уровень расхода газа.

G. Расфасовка вакцин: Исполнение заказа лекарственной формы: 4°C лекарственная форма всегда должна быть расфасована перед 25°C родственной лекарственной формой.

Аналитические методы

Все методы анализа клеточных культур проводились в стерильных условиях. Процедуры, разведения и добавление сред выполнялись в боксе биологической безопасности II класса в асептических условиях. Все чашки, флаконы, культуральные матрасы, пипетки, наконечники для пипеток и пробирки для разведения должны быть простерилизованы перед использованием. Все среды и соответствующие компоненты должны быть стерильными.

Активность вируса BVDV1: Клеточная линия, пригодная для культивирования BVDV, используется для данного анализа титра. Например, клетки линии клеток бычьих почек Madin-Darby (MDBK) культивируют до конфлюентности на матрасе или роллерном флаконе с использованием модифицированной эссенциальной среды Хэнкса (HMEM) с добавлением 5-10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (FBS), L-глутамина и антибиотика (гентамицин (12-25 мкг/мл)). Среду из матраса/роллерного флакона от здоровых культивируемых клеток MDBK сливают приблизительно за 24 часа до необходимого времени титрования вируса. Промывают сывороткой, содержащей среду из матраса/роллерного флакона с использованием фосфатно-солевого буферного раствора, рН 7,2 (PBS). Сливают и заменяют раствором, содержащим соответствующее количество трипсина/EDTA, чтобы клетки аккуратно отслоились от поверхности матраса/роллерного флакона. Количество трипсина должно быть подобрано соответственно размеру поверхности матраса или роллерного флакона. Помещают матрас/роллерный флакон, содержащий клетки, обработанные трипсином, в инкубатор при 37°C на достаточное количество времени, чтобы обеспечить клеткам отслоение. Когда клетки оказываются на подходящем уровне отслаивания, добавляют 5-20 мл модифицированной эссенциальной среды Игла, содержащей L-глутамин и гентамицин (EMEM). 5% FBS добавляют к ЕМЕМ для нейтрализации трипсина. Пипетируют клетки, чтобы разбить скопление. Плотность клеток определяют с помощью гемоцитометра. Жизнеспособность клеток может быть определена с использованием 4%-ного раствора трипанового синего. Клетки разводят до количества 1×10⁵ клеток на мл в ЕМЕМ с 5% FCS и добавляют по 100 мкл на каждую лунку 96-луночного культурального планшета. Для предотвращения испарения среды, планшет накрывают и клетки помещают в инкубатор с увлажняющей камерой, установленный на 37°С с 5% СО₂. Подготавливают пробирки, которые должны быть использованы для 10-кратных разведений при титровании вируса путем добавления соответствующего количества EMEM/5% сыворотки в каждую пробирку. Отдельную пробирку наполняют ЕМЕМ для отрицательного контроля. Проводят 10-кратные разведения образца вируса в подготовленных пробирках. Подготовленный в качестве стандартного образца BVDV типа 1 с известным титром также разводят в ЕМЕМ и используют как положительный контроль. Удостоверившись, что в 96-луночном планшете произошла конфлюентность монослоя здоровых клеток MDBK, добавляют по 100 мкл каждого из разведенных образцов вируса в соответствующие лунки 96-луночного планшета с клетками MDBK, включая отрицательный и положительный контроли. Возвращают обратно крышку на планшет и помещают примерно на 4 дня в инкубатор с увлажняющей камерой, установленный на 37°С с 5% СО₂. По истечении 4-х дней, планшеты могут быть проанализированы с помощью инвертированного микроскопа и исследован цитопатический эффект (CPE) вируса на клетки. В случае, если штамм BVDV является не цитопатическим штаммом, может быть использована следующая методика определения титра вируса. По истечении 4-х дней, из инкубатора вынимают инфицированные планшеты и сливают среду в соответствующий контейнер для отходов. Дважды промывают монослой PBS. После второй промывки, удаляют излишки влаги с планшета путем осторожного промакивания фильтровальной бумагой. Клеточные субстраты фиксируют в вытяжном шкафу с использованием 50-200 мкл/на лунку холодного фиксатора 70% ацетона/30% метанола и оставляют планшет фиксироваться при комнатной температуре в течение 10 минут. Сливают использованный фиксатор в соответствующий резервуар. Удаляют излишки влаги, путем осторожного промакивания планшета фильтровальной бумагой, и оставляют планшет высыхать на воздухе. Фиксированные планшеты могут храниться при 2-7°C в течение 30 дней до окрашивания. Для того чтобы окрасить планшеты, промывают каждый однократно PBS и удаляют излишки влаги промакиванием. Добавляют по 50-75 мкл на лунку антитела, которое направлено специфично по отношению к BVDV1. Возвращают обратно крышку на планшеты и инкубируют в увлажняющей камере, установленной на 37°С с 5% СО₂ в течение 30-60 минут. Вынимают планшеты из инкубатора и сливают жидкость, содержащую несвязанное антитело. Промывают планшет, как минимум, двукратно, чтобы удалить несвязанное антитело. Добавляют по 50-75 мкл флуоресцентно меченого изотиоцианатом (FITC) вторичного антитела, разведенного до соответствующего уровня, в каждую лунку планшета, используя мультиканальную пипетку. Возвращают обратно крышку и инкубируют планшеты в инкубаторе с увлажняющей камерой, установленном на 37°С с 5% СО₂ в течение примерно 30 минут. Вынимают планшеты из инкубатора, снимают крышку и сливают несвязанное антитело, меченное FITC. Промывают планшеты дважды PBS и промакивают планшеты фильтровальной бумагой для удаления излишков влаги. Планшеты могут быть сразу проанализированы с помощью флуоресцентного микроскопа с соответствующими фильтрами для FITC конъюгата. Инфицированный субстрат будет содержать клетки с цитоплазмой, которая проявляется в виде зеленого яблока и ядрами, которые остаются темными (неокрашенными). Для цитопатического штамма BVDV1, в качестве положительных, рассматриваются лунки, обнаруживающие очевидный цитопатический эффект. Все лунки с отрицательным контролем остаются отрицательными, и не проявляющими цитопатического эффекта или положительно окрашенными. Расчет титра вируса проводят по методу Spearman-Karber и представляют в виде log₁₀ TCID₅₀/мл. Измерение считается достоверным, в случае если отрицательные контроли являются отрицательными, а положительный контроль попадает в ожидаемый диапазон титра для образца.

Активность вируса BVDV2: Проверка активности BVDV2 осуществляется точно так же, как и для BVDV1. В случае, если штамм не является цитопатическим штаммом, то следует использовать антитело, направленное против штамма типа 2. Положительным вирусным контролем будет BVDV2.

Активность IBR: Клеточная линия, пригодная для культивирования IBR, используется для данного анализа титра. Например, клетки линии клеток бычьих почек Madin-Darby (MDBK) культивируют до конфлюентности на матрасе или роллерном флаконе с использованием модифицированной эссенциальной среды Хэнкса (HMEM) с добавлением 5-10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (FBS), L-глутамина и антибиотика (гентамицин (12-25 мкг/мл)). Среду из матраса/роллерного флакона от здоровых культивируемых клеток MDBK сливают приблизительно за 24 часа до необходимого времени титрования вируса. Промывают сывороткой, содержащей среду из матраса/роллерного флакона с использованием фосфатно-солевого буферного раствора, рН 7,2 (PBS). Сливают и заменяют раствором, содержащим соответствующее количество трипсина/EDTA, чтобы клетки аккуратно отслоились от поверхности матраса/роллерного флакона. Количество трипсина должно быть подобрано соответственно размеру поверхности матраса или роллерного флакона. Помещают матрас/роллерный флакон, содержащий клетки, обработанные трипсином, в инкубатор при 37°C на достаточное количество времени, чтобы обеспечить клеткам отслоение (5-10 минут). Когда клетки оказываются на подходящем уровне отслаивания, добавляют 5-20 мл модифицированной эссенциальной среды Игла, содержащей L-глутамин и гентамицин (EMEM). 5% FBS добавляют к ЕМЕМ для нейтрализации трипсина. Пипетируют клетки, чтобы разбить скопление. Плотность клеток определяют с помощью гемоцитометра. Жизнеспособность клеток может быть определена с использованием 4%-ного раствора трипанового синего. Клетки разводят до концентрации 2,4×10⁵ клеток на мл в ЕМЕМ с 5% FCS и добавляют по 5 мл на каждую лунку 60 мм культуральных планшетов. Для предотвращения испарения среды, планшет накрывают и клетки помещают в инкубатор с увлажняющей камерой, установленный на 37°С с 5% СО₂. Подготавливают пробирки, которые должны быть использованы для 10-кратных разведений при титровании вируса путем добавления соответствующего количества EMEM/5% сыворотки в каждую пробирку. Отдельную пробирку наполняют ЕМЕМ для отрицательного контроля. Проводят 10-кратные разведения образца вируса в подготовленных пробирках. Подготовленный в качестве стандартного образца IBR с известным титром также разводят в ЕМЕМ и используют как положительный контроль. Убеждаются, что в 60мм культуральных планшетах произошла конфлюентность монослоя здоровых клеток MDBK. Маркируют каждый планшет с описанием образца и разведений при посеве. Затем среду с каждого 60 мм культурального планшета сливают. Засевают каждый из культуральных планшетов 100 мкл тестируемого образца, включая отрицательный и положительный контроли. Планшеты переворачивают вперед и назад, чтобы распределить инокулят. Возвращают обратно крышку на культуральный планшет и помещают в инкубатор с увлажняющей камерой, установленный на 37°С с 5% СО₂ примерно на 60 минут для абсорбции. После абсорбции вируса, добавляют 5 мл покровной среды, состоящей из минимальной питательной среды Dulbecco (DMEM), с 5% FCS, L-глутамином, гентамицином и карбоксиметилцеллюлозы в каждый 60 мм культуральный планшет. По истечении 4 дней, сливают покровную среду с карбоксиметилцеллюлозой с каждого планшета. Каждый планшет промывают водой и сливают. Добавляют 2 мл (или достаточно, чтобы покрывало дно) кристаллического фиолетового красителя в каждый культуральный планшет или лунку, и инкубируют при комнатной температуре (15-30°) в течение 20-30 минут. Осторожно смывают краситель с каждого планшета холодной водой. Планшеты переворачивают и дают высохнуть. После того, как культуральные планшеты высыхают, визуально подсчитывают бляшки на планшетах с помощью инвертированного микроскопа. Используют только те разведения, для которых характерно среднее количество бляшек между 10 и 150 для определения титра. Вычисляют бляшкообразующую единицу (БОЕ) титра вируса/0,1 мл с последующим проведением расчета: титр БОЕ/0,1 мл = Log₁₀ (среднее значение бляшек, подсчитанных для каждого разведения каждого индивидуального титра) + Log₁₀ (кратность разведения). Титры представляют в виде Log₁₀ TCID₅₀/мл. Измерение считается достоверным, в случае если в отрицательном контроле не обнаруживаются признаков бляшек в лунках, а положительный контрольный титр попадает в ожидаемый диапазон.

Активность вируса BRSV: Клеточная линия, пригодная для культивирования BRSV, используется для данного анализа титра. Например, клетки Vero культивируют до конфлюентности на матрасе или роллерном флаконе. Клетки Vero могут быть культивированы в модифицированной питательной среде Dulbecco (DMEM) с добавлением антибиотиков (гентамицин (12-50 мкг/мл), эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (5% FBS) и L-глутамина (2 мМ). Титрование планшетов проводят примерно за 24 часа, до того, как это было необходимо. Среду от здорового монослоя клеток Vero сливают. Клетки промывают PBS. Добавляют небольшое количество трипсина/EDTA на матрас/роллерный флакон, чтобы отслоить клетки от поверхности. Затем матрас/роллерный флакон инкубируют при 37°С в течение 5-10 минут, за которое они отслаиваются от поверхности. Модифицированную эссенциальную среду Игла с антибиотиками, L-глутамином, незаменимыми аминокислотами, гидролизатом лактальбумина (LAH 0,05%) и глюкозой (0,3%), добавляют в матрас (5-20 мл), содержащий трипсин/EDTA и клетки, которые пипетировали, чтобы разбить их скопление. Гемоцитометр, используется для определения количества клеток, с помощью окрашивания для подсчета клеток, чтобы определить индекс жизнеспособности клеток. Клетки разводят до конечной концентрации 1×10⁵, с использованием EMEM в качестве разбавителя. Используя многоканальную пипетку, добавляют 100 мкл разбавленных клеток в каждую лунку 96-луночного планшета. Помещают инокулированные планшеты в инкубатор с увлажняющей камерой, установленный на 37°С с 5% СО₂, чтобы клетки могли прикрепиться и культивироваться. Подготавливают пробирки, которые будут использованы для 10-кратных разведений при титровании вируса путем добавления соответствующего количества ЕМЕМ в каждую пробирку. Отдельную пробирку заполняют ЕМЕМ для отрицательного контроля. Проводят 10-кратные разведения образца вируса в подготовленных пробирках. Подготовленный в качестве стандартного образца BRSV с известным титром также разводят в ЕМЕМ и используют как положительный контроль.

Удостоверившись, что в 96-луночном планшете произошла конфлюентность монослоя здоровых клеток Vero, добавляют 100 мкл каждого из разведенных вирусных образцов в соответствующие лунки 96-луночного планшета с клетками Vero, включая отрицательный и положительный контроли. Возвращают крышку обратно на планшет и помещают в инкубатор с увлажняющей камерой, установленный на 37°С с 5% СО₂ примерно на 8 дней до анализа. На восьмой день, используют инвертированный микроскоп, чтобы проанализировать каждую лунку 96-луночного планшета на предмет цитопатического эффекта (CPE). Сначала рассматривается отрицательный контроль, чтобы определить количество фонового дебриса, который является базовой линией для каждой лунки. Регистрируют количество CPE-положительных лунок для каждого разведения. Проводят расчет титра вируса по методу Spearman-Karber и представляют в виде Log₁₀ TCID₅₀/мл. Измерение считается достоверным, в случае если отрицательный контроль не обнаруживает признаков CPE в лунках, а положительный контрольный титр попадает в ожидаемый диапазон.

Активность PI3: Клеточная линия, пригодная для культивирования PI3, используется для данного анализа титра. Например, клетки Vero культивируют до конфлюентности на матрасе или роллерном флаконе. Клетки Vero могут быть культивированы в модифицированной питательной среде Dulbecco (DMEM) с добавлением антибиотиков (гентамицин (12-50 мкг/мл), эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (5% FBS) и L-глутамина (2 мМ). Среду от здорового монослоя клеток Vero сливают. Клетки промывают PBS. Добавляют небольшое количество трипсина/EDTA на матрас/роллерный флакон, чтобы отслоить клетки от поверхности. Затем матрас/роллерный флакон инкубируют при 37°С в течение 5-10 минут, при котором они отслаиваются от поверхности. Модифицированную эссенциальную среду Игла с гентамицином, L-глутамином и 5% FCS, добавляют в матрас (5-20 мл), содержащий трипсин/EDTA и клетки, которые пипетировали, чтобы разбить их скопление. Гемоцитометр, используется для определения количества клеток, с помощью окрашивания (Трипановый синий) для подсчета клеток, чтобы определить индекс жизнеспособности клеток. Клетки разводят до конечной концентрации 1×10⁵, с использованием ЕМЕМ в качестве разбавителя. С помощью многоканальной пипетки, добавляют 100 мкл разведенных клеток в каждую лунку 96-луночного планшета.

Помещают инокулированные планшеты в инкубатор с увлажняющей камерой, установленный на 37°С с 5% СО₂, чтобы клетки могли прикрепиться и культивироваться. Подготавливают пробирки, которые будут использованы для 10-кратных разведений при титровании вируса путем добавления соответствующего количества ЕМЕМ в каждую пробирку. Отдельную пробирку заполняют ЕМЕМ для отрицательного контроля. Проводят 10-кратные разведения образца вируса в подготовленных пробирках. Подготовленный в качестве стандартного образца PI3 с известным титром также разводят в ЕМЕМ и используют как положительный контроль.

Удостоверившись, что в 96-луночном планшете произошла конфлюентность монослоя здоровых клеток Vero, добавляют 100 мкл каждого из разведенных вирусных образцов в соответствующие лунки 96-луночного планшета с клетками Vero, включая отрицательный и положительный контроли. Возвращают крышку обратно на планшет и помещают в инкубатор с увлажняющей камерой, установленный на 37°С с 5% СО₂ примерно на 7 дней до анализа. На седьмой день, используют инвертированный микроскоп, чтобы проанализировать каждую лунку 96-луночного планшета на предмет цитопатического эффекта (CPE). Сначала рассматривается отрицательный контроль, чтобы определить количество фонового дебриса, который является базовой линией для каждой лунки. Регистрируют количество CPE-положительных лунок для каждого разведения. Проводят расчет титра вируса по методу Spearman-Karber и представляют в виде Log₁₀ TCID₅₀/мл. Измерение считается достоверным, в случае если отрицательный контроль не обнаруживает признаков CPE в лунках, а положительный контрольный титр попадает в ожидаемый диапазон.

Активность BRCV: Клетки MDBK культивируют, используя DMEM с L-глутамином, эмбриональной сывороткой крупного рогатого скота и антибиотиками (Питательная Среда) в матрасе или роллерном флаконе до тех пор, пока не будет достигнута конфлюентость монослоя здоровых клеток. Сливают матрас/флакон и промывают фосфатно-солевым буферным раствором (PBS). Сливают PBS и добавляют достаточное количество раствора, содержащего трипсин, чтобы отслоить клетки от поверхности. Помещают культуру обратно в инкубатор на 37°С, чтобы дать время клеткам для отслоения. Как только клетки отслоились от поверхности, добавляют количество среды, соответствующее 2-х кратному количеству трипсина, который использовали для добавления к клеткам. Клетки пипетируют несколько раз, чтобы разбить их скопление. Количество жизнеспособных клеток определяют с помощью гемоцитометра или другим подходящим способом, используя трипановый синий, чтобы оценить процент нежизнеспособных клеток в суспензии. Затем клеточную суспензию разводят Питательной Средой до концентрации 2×10⁵ клеток/мл. Используя многоканальную пипетку, добавляют по 100 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночного планшета для культуры ткани. Планшеты, засеянные культурой, инкубируют при 37°С, 5% СО₂ в условиях высокой увлажненности до формирования монослоя примерно с 90-100% конфлюентностью. Образцы, содержащие живые вирусы разводят в 10 раз в Питательной Среде для посева (DMEM, L-глютамин, антибиотики и трипсин типа IX). BRCV является трипсин-зависимым вирусом, и, следовательно, трипсин должен быть добавлен к питательной среде для посева для того, чтобы вирусы инфицировали клетки. Нельзя добавлять FBS в среду для разведения для трипсин-зависимых вирусов. Когда 96-луночные планшеты будут подготовлены, сливают Питательную Среду и промывают планшет PBS. Отбирают PBS из 96-луночного планшета, содержащего монослой клеток MDBK, и сразу же наносят разведенные образцы вируса на планшет. Серию разведений положительного контроля, содержащую известное количество вируса, также добавляют в планшет. Серию отрицательного контроля, содержащую только среду, также добавляют в планшет. Инкубируют планшеты при 37°С, 5% СО₂ в течение пяти дней. Через 5 дней, планшеты вынимают из инкубатора и проводят исследование клеток с помощью микроскопа на предмет цитопатического эффекта вируса (CPE). Лунки, обнаруживающие CPE, отмечают как положительные, лунки с интактными клетками считаются отрицательными. Проводят расчет титров положительного контроля и образцов по методу Spearman-Karber и представляют в виде Log₁₀ TCID₅₀/мл. Измерение считается достоверным, в случае если отрицательный контроль не обнаруживает признаков цитопатического эффекта в лунках, а положительный контроль попадает в ожидаемый диапазон.

Результаты/Выводы

Были созданы стабилизирующие лекарственные формы для вакцин, содержащих вирус крупного рогатого скота, и в дальнейшем барботированы газообразным аргоном, стерилизованы посредством фильтрации с использованием 0,2 мкм фильтров-насадок PES и перед хранением осуществлялась подача слоя аргона. В день наполнения добавляли вирус и перемешивали, затем распределяли по 1 мл вакцины в 2,2 мл стеклянную ампулу, заполняли газообразным аргоном, герметизировали на пламени горелки и инкубировали. Моновалентные вакцины BRSV, BVDV1 и IBR были произведены для каждой стабилизирующей комбинации и инкубированы либо при 15°С, либо при 25°C. PI3 исключили по причине того, что раннее полученные результаты указали на то, что этот вирус ведет себя аналогично BRSV. Данный предварительный эксперимент неожиданно обнаружил, что оптимизированные уровни положительных результатов могут быть получены при использовании сочетания сорбита и аргинина, также как тенденция к более упрощенным стабилизаторам, чтобы показать более хороший результат по всему ряду исследуемых вирусов.

Следующим шагом, ускоренное (25°C) и в режиме реального времени (4°C) исследование стабильности было проведено для того, чтобы сравнить многосоставные лекарственные формы, исходя из отбора вспомогательного вещества, подробно описанное выше (см. таблица 1). Были созданы стабилизирующие лекарственные формы, затем барботированы газообразным аргоном, стерилизованы посредством фильтрации с использованием 0,2 мкм фильтров-насадок PES и перед хранением осуществлялась подача слоя аргона. В день наполнения добавляли вирус и перемешивали, затем распределяли по 1 мл вакцины в 2,2 мл стеклянную ампулу, заполняли газообразным аргоном, герметизировали на пламени горелки и инкубировали. Комбинированные образцы ~ 10 мл также заливали в стеклянные и пластиковые флаконы для вакцины, покрывали газообразным аргоном, закрывали пробкой и герметично закручивали.

В общей сложности, одиннадцать различных лекарственных форм оказались возможными кандидатами на жидкие стабильные лекарственные формы поливалентной вакцины крупного рогатого скота (Таблица 1). Исследования в режиме реального времени, например, при 4°С, проводились на поливалентных вакцинных препаратах, содержащих BVDV1, BVDV2, IBR, PI3 и BRSV, и моновалентных вакцинных препаратах из BRCV. Результаты данных исследований представлены ниже в таблицах 2А и 2В.

Испытания на стабильность была выполнены в течение трех месяцев. В течение девяти месяцев, была проведена оценка на лекарственных формах, чтобы ограничить исследования. Наиболее затрудительными вакцинными антигенами в плане стабилизации, оказались BVDV1 и IBR. Прекращение исследования данной лекарственной формы было основано, как минимум, в том числе на том, что: произошла потеря более одного log в титре для любых из 5 вакцинных антигенов в течение 9 месяцев; получены равнозначные результаты для другой лекарственной формы, в составе которой были те же самые компоненты, но в более высоких концентрациях; и/или получены подобные лекарственные формы, но в составе которых, имелись дополнительные компоненты, не проявившие какого-либо эффекта. Любую лекарственную форму, которая показала резкое падение в титре за момент времени, проводили за дополнительное время, чтобы определить, было ли это фактическое отсутствие стабильности или вариабельность анализа (кроме случаев, если не встретился любой из критериев исключения, указанных выше).

Настоящее изобретение не ограничивается по сфере применения конкретными вариантами осуществления, описанными в настоящем документе. В действительности, различные варианты изобретения в дополнение к описанным в данном документе, станут очевидными специалистам в данной области техники из вышеприведенного описания. Указанные варианты предназначены для включения в объем прилагаемых пунктов формулы изобретения.