Способ выделения яиц гельминтов флотационным методом

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к ветеринарии и медицине, и предназначено для диагностики гельминтозов с использованием способа выделения яиц гельминтов флотационным методом с использованием калия бромида.

Уровень техники.

Известен способ Фюллеборна. Для этой методики нужен насыщенный раствор поваренной соли, который готовят путем кипячения 400-420 г соли на 1 л воды (флотационный раствор).

Пробу фекалий весом 3-5 г помещают в стакан, заливают небольшим количеством флотационным раствором, тщательно размешивают, затем добавляют 50-100 мл этого раствора и процеживают через металлическое сито или марлю в один слой в сухой, чистый стакан. Взвесь отстаивают 40-60 минут, затем прикосновением петли снимают поверхностную пленку, переносят ее на предметное стекло для микроскопирования.

Этот способ в лабораторной практике может применяться для диагностики неоаскариоза, стронгилятозов стронгилоидоза, мониезиоза и тизаниезиоза крупного рогатого скота, (см. Лутфуллин М.Х., Латыпов Д.Г., Корнишина М.Д. Ветеринарная гельминтология. Казань: «Идел-Пресс». 2007. 232 с.)

Недостатком данного способа является невысокая плотность насыщенного раствора поваренной соли - 1,18-1,20, а, например, удельный вес яиц трихоцефалюса равен 1,16-1,22. В данном случае насыщенный раствор поваренной соли способен флотировать только часть яиц гельминтов, по этой причине диагностическая эффективность данного способа невысокая. Кроме того, раствор на предметном стекле быстро кристаллизуется.

Известен способ Котельникова-Хренова с аммиачной селитрой. Технология этого способа такая же, как и метода Фюллеборна, но в качестве флотационного раствора применяется нитрат аммония. При приготовлении флотационного раствора в 1 литре кипящей воды растворяют 1,5 кг селитры. Плотность раствора - 1,32. Поверхностную пленку можно микроскопировать через 10 минут. Данная методика обладает высокой диагностической эффективностью. В лабораторной практике эта методика широко применяется для выявления яиц неоаскарисов, стронгилят пищеварительного тракта, трихоцефалюсов, авителлин крупного рогатого скота, (см. Котельников Г.А. Гельминтологические исследования животных и окружающей среды. Справочник. М.: Колос.1983. 280 с.).

Недостатком этого способа является то, что флотационный раствор из аммиачной селитры не способен поднять тяжелые яйца трематод (фасциол, парамфистом и др.), так как удельный вес этих яиц больше чем 1,3. Кроме того, раствор быстро кристаллизуется. Гранулированная аммиачная селитра, применяемая для флотационного раствора - не является общедоступной так как используется для изготовления взрывчатых смесей. Помимо этого, данный раствор может оказывать вредное воздействие на персонал проводящих исследование.

Известен способ Котельникова-Хренова с нитратом свинца. Техника проведения этого способа аналогична способу Фюллеборна. В качестве флотационного раствора при этом используется насыщенный раствор нитрата свинца из расчета 0,65 кг на 1 л воды. Плотность этой жидкости достигает 1,5. Применение такого флотационного раствора дает возможность диагностировать широкий круг возбудителей гельминтозов. С его помощью легко выявляются и тяжелые яйца фасциол (удельный вес 1,31-1,35), парамфистомат (1,33-1,38), дикроцелиумов (1,3) и тем более яйца с меньшим удельным весом, к которым относятся яйца аскаридат, стронгилят, трихоцефалят, стронгилоидесов, аноплоцефалят (мониезий), а также капсулы тизаниезий. (см. Котельников Г.А. Гельминтологические исследования животных и окружающей среды. Справочник. М.: Колос.1983. 280 с.).

Недостатком данного способа является дороговизна нитрата свинца. Вместе с тем, при работе данным препаратом петли покрываются белым налетом, (нитрат свинца входит в химическую реакцию с металлами), яйца трематод сильно деформируются, что создает определенные трудности при исследовании. Кроме того, используемый препарат соль тяжелого металла - свинца, который является высокотоксичным веществом, что создает опасность для здоровья исследователей и окружающих, отработанные растворы данного препарата запрещено сливать в канализационные стоки. Используемая соль не доступна, так как используется для изготовления взрывчатых смесей. По совокупности этих причин, указанный способ не нашел широкого применения в практике.

Известен способ Дарлинга. Пробу фекалий весом 3-5 г размешивают в стаканчике с водой в количестве 20 мл. Полученную эмульсию фильтруют через марлю, переливают в пробирку, доливают водой до верха и центрифугируются в течение 3 минут. Затем жидкость сливают до осадка, осадок размешивают с жидкостью Дарлинга (насыщенный раствор поваренной соли, смешанной в равных частях с глицерином), центрифугируют 5 минут. Затем прикосновением петли с поверхности жидкости снимают пленку, наносят ее на предметное стекло и исследуют под микроскопом (см. Акбаев М.Ш. и др. Паразитология и инвазионные болезни животных. Москва, «Колос», 1998, 744 с.).

Недостатками этого способа являются его неэффективность так как флотационный раствор из поваренной соли не способен поднять тяжелые яйца гельминтов, а также длительность проведения исследования.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту принятый авторами за прототип является способ диагностики паразитозов птиц, характеризующийся тем, что берут 1-3 г помета, размешивают в 15 мл комбинированного флотационного раствора, состоящего из насыщенного раствора нитрата аммония (1500 г на 1 л кипящей воды) и глицерина, взятых в соотношении 6:1 соответственно, фильтруют, взвесь центрифугируют в течение 1 минуты при 1500 об/мин, после чего микроскопируют поверхностную пленку, (см. пат. RU №2508073 Способ диагностики паразитозов птиц, МПК A61D 99/00, опубл. 27.02.2014, Бюл. №6).

Недостатками этого способа являются то, что флотационный раствор из нитрата натрия способен в данном случае флотировать только часть яиц гельминтов, по этой причине диагностическая эффективность данной методики невысокая, а также длительность выполнения исследования.

Раскрытие изобретения

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа выделения яиц гельминтов флотационным методом с использованием калия бромида, который позволяет флотировать все виды яиц гельминтов и ооцист простейших, а также обладающего способностью консервировать паразитов и понижать мутность исследуемой суспензии, что улучшает диагностическую эффективность предлагаемого способа в результате сокращения времени и повышения точности исследования.

Технический результат, который может быть достигнут с помощью предлагаемого изобретения, сводится к понижению мутности исследуемой суспензии, улучшению диагностической эффективности предлагаемого способа в результате сокращения времени и повышения точности исследования.

Технический результат достигается с помощью способа выделения яиц гельминтов флотационным методом, включающий, использование калия бромида, формалина, алюминия хлорида и воду при температуре 30-35°С, для диагностики гельминтозов животных, заключающийся в том, что берут 1-3 г фекалий, растирают и смешивают их с 10 мл воды, затем проводят фильтрацию полученной смеси, полученный раствор взвеси разливают в пробирки добавляют флотационный раствор состоящего: калия бромида плотностью 1,35 г/см³, формалина, алюминия хлорида, центрифугируют в течение 2-3 минут при 2000 об/мин, затем пробирки медленно переворачивают в количестве 3-х раз, исключая расслоения суспензии, отбирают из центра пробирки жидкость и заполняют ей камеру Макмастера, после чего проводят подсчет яиц гельминтов с использованием счетной шкалы, при этом флотационный раствор берут в следующем соотношении компонентов в мас. %:

- калия бромид - 34,0-40,0;

- формалин - 5,0-6,0;

- алюминия хлорид - 0,1;

- вода - остальное.

Технический результат, достигается тем, что обеспечивается улучшение диагностической точности предлагаемого способа выделения яиц гельминтов флотационным методом, содержащий 1-3 г фекалий, его растирание и смешивание с флотационным раствором, затем проведение фильтрации взвеси с последующими разливанием полученной суспензии в пробирки и центрифугированием, после чего проводят подсчет яиц гельминтов, при этом перед смешиванием с флотационным раствором, 1-3 г фекалий растирают в 10-15 мл воды, а в качестве флотационного раствора используют: калия бромида плотностью 1,30-1,40 г/см³, 5-6% формалина и 0,1% алюминия хлорида и воду при температуре 30-35°С, после чего сливают надосадочную жидкость и добавляют 5-7 мл флотационного раствора, центрифугируют в течение 2-3 минут при 2000 об/мин, затем пробирки медленно переворачивают в количестве 3-х раз, исключая расслоения суспензии, отбирают из центра пробирки жидкость и заполняют ей камеру Макмастера, после чего проводят подсчет яиц гельминтов с использованием счетной шкалы, при этом флотационный раствор берут в следующем соотношении компонентов в мас. %:

- калия бромид - 34,0-40,0;

- формалин - 5,0-6,0;

- алюминия хлорид - 0,1;

- вода - остальное.

Флотационный раствор готовят следующим образом:

В 1 литре воды при температуре 30-35°С растворяют компоненты в следующем соотношении: калия бромид плотностью 1,30-1,40 г/см³ - 442,0-588,0 г затем к полученному головному раствору добавляют алюминия хлорида 1 г, после чего добавляют формалин 50-60 г. Таким образом, достигается технический результат - упрощение способа определения яиц гельминтов за счет дополнительного введения выше перечисленных неорганических солей, способных приводит к повышению эффективности действия флотационного раствора, то есть решение технической задачи достигается применением калия бромида дающего необходимую плотность раствора приводящая к всплытию яиц гельминтов, алюминия хлорида, являющегося неорганическим коагулянтом, позволяющим обволакивать и связывать мелкие частицы детрита и грязи, образуя хлопья крупного размера, которые легко оседают на дно или удаляются в процессе фильтрации, вследствие чего флотационный раствор становиться гораздо прозрачнее и чище, а также формалина, предотвращающего распад клеток паразитов, обладая водоотнимающим эффектом, тем самым консервируя их. Выход яиц гельминтов составляет более 95%.

Отличительной особенностью является использование калия бромида, основного компонента получаемого нового состава раствора, хлорид алюминия, являющегося неорганическим коагулянтом, а также формалина, предотвращающего распад клеток паразитов.

Конкурентным преимуществом является улучшение диагностической эффективности предлагаемым способом в результате сокращения времени и повышения точности исследования.

Сущность способа выделения яиц гельминтов флотационным методом заключается в следующем.

Способ выделения яиц гельминтов флотационным методом, содержащий 1-3 г фекалий, его растирание и смешивание с флотационным раствором, затем проведение фильтрации взвеси с последующими разливанием полученной суспензии в пробирки и центрифугированием, после чего проводят подсчет яиц гельминтов, при этом перед смешиванием с флотационным раствором, 1-3 г фекалий растирают в 10-15 мл воды, а в качестве флотационного раствора используют: калия бромид плотностью 1,30-1,40 г/см³, 5-6% формалин, 0,1% хлорид алюминия и воду при температуре 30-35°С, после чего сливают надосадочную жидкость и добавляют 5-7 мл флотационного раствора, центрифугируют в течение 2-3 минут при 2000 об/мин, затем пробирки медленно переворачивают в количестве 3-х раз, исключая расслоения суспензии, отбирают из центра пробирки жидкость и заполняют ей камеру Макмастера, после чего проводят подсчет яиц гельминтов с использованием счетной шкалы, при этом флотационный раствор берут в следующем соотношении компонентов в мас. %:

- калия бромид - 34,0-40,0;

- формалин - 5,0-6,0;

- хлорид алюминия - 0,1;

- вода - остальное.

Осуществление изобретения

Примеры конкретного выполнения способа выделения яиц гельминтов.

Пример 1. К 1-3 грамма естественно инвазированных фекалий, предварительно растертым, добавляют 10-15 мл воды и перемешивают, фильтруют, полученный раствор разливают в центрифужные пробирки и центрифугируют 1 минуту при 1500 об/мин. После чего, сливают надосадочную жидкость и добавляют флотационный раствор в объеме 5 мл состоящий из бромида калия, формалина и хлорида алюминия. Пробу тщательно перемешивают и центрифугируют 2 минуты при 2000 об/мин. Затем пробирку аккуратно переворачивают 3 раза, не допуская расслоения суспензии, из центра пробирки отбирают жидкость и заполняют ею камеру Макмастера, после чего проводят подсчет яиц гельминтов с использованием счетной шкалы.

Компоненты берут при следующем соотношении в мас. %:

- калия бромид - 32,0;

- формалин - 5,0;

- хлорид алюминия - 0,1;

- вода - остальное.

Взято 30 проб естественно инвазированных фекалий собак по 2 г. Из них 10 проб первого контроля исследуют с использованием насыщенного раствора поваренной соли, во временном аспекте это самый долгий способ, составляющий на подготовку проб 8 минут. 10 проб второго контроля исследуют с насыщенным раствором гранулированной аммиачной селитры, во временном аспекте это самый быстрый способ, составляющий на подготовку проб 2 минуты. 10 проб исследуют по предлагаемому нами способу с использованием калия бромида это способ, занимает на подготовку проб 3 минуты.

При этом чувствительность способа первого контроля (насыщенный раствор поваренной соли) оказалась 71%, что связано с низкой плотностью флотационного раствора и не позволяющего полностью извлечь яйца гельминтов. Чувствительность второго способа контроля (раствором гранулированной аммиачной селитры) составила 82%, что так же связано с низкой плотностью флотационного раствора и не позволяющего полностью извлечь яйца гельминтов. По предлагаемому соотношению компонентов флотационного раствора выход яиц гельминтов составил 68%, что тоже связано с низкой плотностью флотационного раствора.

Пример 2. Технологию выполнения способа выделения яиц гельминтов проводят аналогично примеру 1, но при этом компоненты берут при следующем соотношении в мас. %:

- калия бромид - 34,0;

- формалин - 6,0;

- хлорид алюминия - 0,1;

- вода - остальное.

Взято 30 проб естественно инвазированных фекалий собак по 2 г. Из них 10 проб первого контроля исследуют с использованием насыщенного раствора поваренной соли, во временном аспекте это самый долгий способ, составляющий на подготовку проб 8 минут. 10 проб второго контроля исследуют с насыщенным раствором гранулированной аммиачной селитры, во временном аспекте это самый быстрый способ, составляющий на подготовку проб 2 минуты. 10 опытных проб исследуют по предлагаемому способу, время, затрачиваемое на подготовку проб составляет 3 минуты.

При этом чувствительность способа первого контроля (насыщенный раствор поваренной соли) оказалась 71%, что связано с низкой плотностью флотационного раствора и не позволяющего полностью извлечь яйца гельминтов. Чувствительность второго способа контроля (раствором гранулированной аммиачной селитры) составила 82%, что так же связано с низкой плотностью флотационного раствора и не позволяющего полностью извлечь яйца гельминтов. По предлагаемому соотношению компонентов флотационного раствора выход яиц гельминтов составил 84% т.е. на 13% по сравнению с первым способом выше, преимущество связано с плотностью флотационного раствора, позволяющего в большем количестве извлекать яйца гельминтов. При этом поле зрения опытного образца было более светлым и свободным от посторонних примесей.

Пример 3. Технологию выполнения способа выделения яиц гельминтов проводят аналогично примеру 1, но при этом компоненты берут при следующем соотношении в мас. %:

- калия бромид - 38,0;

- формалин - 6,0;

- хлорид алюминия - 0,1;

- вода - остальное.

Взято 30 проб естественно инвазированных фекалий собак по 2 г. Из них 10 проб первого контроля исследуют с использованием насыщенного раствора поваренной соли, во временном аспекте это самый долгий способ, составляющий на подготовку проб 8 минут. 10 проб второго контроля исследуют с насыщенным раствором гранулированной аммиачной селитры, во временном аспекте это самый быстрый способ, составляющий на подготовку проб 2 минуты. 10 опытных проб исследуют по предлагаемому способу, время, затрачиваемое на подготовку проб составляет 3 минуты.

При этом чувствительность способа первого контроля (насыщенный раствор поваренной соли) оказалась 71%, что связано с низкой плотностью флотационного раствора и не позволяющего полностью извлечь яйца гельминтов. Чувствительность второго способа контроля (раствором гранулированной аммиачной селитры) составила 82%, что так же связано с низкой плотностью флотационного раствора и не позволяющего полностью извлечь яйца гельминтов. По предлагаемому соотношению компонентов флотационного раствора выход яиц гельминтов составил 95% т.е. на 13-24% выше. Связано это с тем, что данное соотношении компонентов у флотационного раствора получается более оптимальным.

Пример 4. Технологию выполнения способа выделения яиц гельминтов проводят аналогично примеру 1, но при этом компоненты берут при следующем соотношении в мас. %:

- калия бромид - 40,0;

- формалин - 6,0;

- хлорид алюминия - 0,1;

- вода - остальное.

Взято 30 проб естественно инвазированных фекалий собак по 2 г. Из них 10 проб первого контроля исследуют с использованием насыщенного раствора поваренной соли, во временном аспекте это самый долгий способ, составляющий на подготовку проб 8 минут. 10 проб второго контроля исследуют с насыщенным раствором гранулированной аммиачной селитры, во временном аспекте это самый быстрый способ, составляющий на подготовку проб 2 минуты. 10 опытных проб исследуют по предлагаемому способу, время, затрачиваемое на подготовку проб составляет 3 минуты.

При этом чувствительность способа первого контроля (насыщенный раствор поваренной соли) оказалась 71%, что связано с низкой плотностью флотационного раствора и не позволяющего полностью извлечь яйца гельминтов. Чувствительность второго способа контроля (раствором гранулированной аммиачной селитры) составила 82%, что так же связано с низкой плотностью флотационного раствора и не позволяющего полностью извлечь яйца гельминтов. По предлагаемому соотношению компонентов флотационного раствора выход яиц гельминтов составил 92% т.е. на 10-21% выше, но по сравнению с примером 3 на 3% меньше.

Предложенный способ диагностирования яиц гельминтов по примеру №2 является оптимальным. Предлагаемый способ повышает диагностическую эффективность за счет меньшего времени исследования, увеличения количества обнаруженных яиц гельминтов и ооцист простейших у лошадей в 1,2-1,6 раза, овец - 1,4-2,3 раза за счет оптимальной плотности флотационного раствора. Возможность консервировать паразитов и понижать мутность исследуемой суспензии, при этом не установлено деформации яйцевых элементов, а поле зрения становится более светлым и свободным от посторонних примесей.

Пример 5. Технологию выполнения способа выделения яиц гельминтов проводят аналогично примеру 1, но при этом компоненты берут при следующем соотношении в мас. %:

- калия бромид - 42,0;

- формалин - 5,0;

- хлорид алюминия - 0,1;

- вода - остальное.

Взято 30 проб естественно инвазированных фекалий собак по 2 г. Из них 10 проб первого контроля исследуют с использованием насыщенного раствора поваренной соли, во временном аспекте это самый долгий способ, составляющий на подготовку проб 8 минут. 10 проб второго контроля исследуют с насыщенным раствором гранулированной аммиачной селитры, во временном аспекте это самый быстрый способ, составляющий на подготовку проб 2 минуты. 10 опытных проб исследуют по предлагаемому способу, время, затрачиваемое на подготовку проб составляет 3 минуты.

При этом чувствительность способа первого контроля (насыщенный раствор поваренной соли) оказалась 71%, что связано с низкой плотностью флотационного раствора и не позволяющего полностью извлечь яйца гельминтов. Чувствительность второго способа контроля (раствором гранулированной аммиачной селитры) составила 82%, что так же связано с низкой плотностью флотационного раствора и не позволяющего полностью извлечь яйца гельминтов. По предлагаемому соотношению компонентов флотационного раствора выход яиц гельминтов составил 82% т.е. на 11% выше, но по сравнению с примером 3 на 13% меньше. Связано это с тем, что при данном соотношении компонентов у флотационного раствора получается большая плотность при этом некоторые яйца гельминтов сильно деформируются, что создает определенные трудности при исследовании.

Таким образом, предложенный способ диагностирования яиц гельминтов по примерам №2, 3 и 4 являются наиболее оптимальными, так как способ повышает диагностическую эффективность за счет меньшего времени исследования, увеличения количества обнаруженных яиц гельминтов и ооцист простейших у лошадей в 1,2-1,6 раза, овец - 1,4-2,3 раза за счет оптимальной плотности флотационного раствора. Возможность консервировать паразитов и понижать мутность исследуемой суспензии При этом не установлено деформации яйцевых элементов, а поле зрения становится более светлым и свободным от посторонних примесей.