ВАКЦИНА ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ ПРОТИВ СУБКЛИНИЧЕСКОЙ ИНФЕКЦИИ LAWSONIA У СВИНЕЙ

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к вакцине для применения в способе уменьшения отрицательного воздействия на среднесуточный прирост массы (ADWG) у свиней, связанного с субклинической инфекцией Lawsonia intracellularis.

Уровень техники

Пролиферативная энтеропатия, известная также как илеит, является распространенным по всему миру кишечным заболеванием свиней-отъемышей, вызываемым облигатной внутриклеточной бактерией Lawsonia intracellularis. Характерное повреждение представляет собой пролиферацию незрелых энтероцитов в илеальных кишечных криптах; эти клетки обычно содержат бактерии-возбудители в их апикальной цитоплазме. При аутопсии, гистологические повреждения могут подтверждаться как Lawsonia-положительные посредством визуализации имеющих длину 1,5-2,5 мкм бактерий в форме виброидов, в частности, в энтероцитах, но также часто, в макрофагах, расположенных в lamina propria между криптами и в мезентеральных лимфатических узлах. Выведение бактерий из энтероцитов приводит к разрешению ассоциируемых с ними пролиферативных повреждений, показывающих прямое локальное воздействие бактерий на крипты (McOrist et al., Developed and resolving lesions in porcine proliferative enteropathy: possible pathogenetic mechanisms, Journal of Comparative Pathology, 115, 1996, pp 35-45). Присутствие Lawsonia intracellularis в этих повреждениях демонстрируется с использованием PCR (цепной реакции полимеразы), как на животных с признаками заболевания (то есть демонстрирующих диарею или аномальные красно-черные дегтеобразные фекалии, потенциально приводящие к гибели) так и у животных, демонстрирующих только субклиническую инфекцию (не показывающих диареи или аномальных фекалий). Клинические случаи обычно присутствуют в период содержания для заключительного откорма; у некоторых более старших свиней на заключительном откорме регистрируется острая геморрагическая форма.

Соотношение между свиньями сероположительными относительно Lawsonia intracellularis и пропорцией свиней, демонстрирующих клиническую или субклиническую инфекцию, изучалось ранее (Van der Heijden, Prevalence of exposure and infection of Lawsonia intracellularis among slaughter-age pigs., Res Vet Sci, December 2004, 77(3), pp. 197-202). Видно, что некоторые свиньи могут быть носителями, то есть являются инфицированными, но не демонстрируют клинических признаков илеита. В частности, в Европе, животные, которые считаются свободными от заболевания, видимо, имеют субклиническую инфекцию, как показывают остатки бактерий в кишечнике при забое. Объяснение положительных результатов относительно присутствия бактерий Lawsonia intracellularis в стадах свободных от клинического заболевания заключается в том, что эти стада имеют Lawsonia intracellularis, передаваемые через их группы для заключительного откорма. Только в определенных ситуациях, инфекция Lawsonia дает в результате клинические проблемы, включая случаи острой геморрагической энтеропатии.

Для групп, свободных от клинического заболевания, вакцинация против инфекции Lawsonia является необычной. Однако, поскольку известно, что субклиническая инфекция может приводить к отрицательному воздействию на среднесуточный прирост массы (ADWG) свиней, некоторые животноводческие фермы для заключительного откорма используют единственную на рынке коммерчески доступную вакцину илеита, то есть Enterisol® Ileitis (доступную от Boehringer Ingelheim), для борьбы с локальной инфекцией в кишечнике. Эта вакцина содержит живые ослабленные бактерии Lawsonia intracellularis и вводится перорально. В самом деле, в настоящее время считается, что локальную инфекцию в кишечнике можно побороть, только вызывая локальный иммунитет. Это отличается от животных, которые демонстрируют клиническое заболевание. Показано (WO 2009/144088, принадлежит Intervet International BV), что эти животные могут успешно защищаться посредством системной вакцинации неживой вакциной. Не ограничиваясь теорией, считается, что причина этого заключается в том, что животные имеют острые желудочно-кишечные повреждения, которые экспонируют инфекцию для системы, это объясняло бы, почему системная иммунная реакция помогла бы побороть инфекцию. Однако когда имеется только субклиническая инфекция, соответствующая только небольшой локальной инфекции кишечника, чтобы побороть инфекцию, как считается, необходима локальная иммунная реакция, включая IgA и клеточный иммунитет. Для этого необходима вакцина, содержащая живые бактерии, вводимые локально. Это подтверждается в статье Mike Roof, названной The Research and Development of Enterisol® Ileitis, представленной на European Enterisol® Ileitis Symposium, October 13-15, 2005, Barcelona, Spain. На странице 2 показано, в Таблице 1.1, что хотя убитая вакцина, вводимая системно, могла бы вызвать ʺгуморальный/системный иммунитетʺ, она не может вызвать ни ʺмукозальный иммунитетʺ, ни ʺклеточно-медиируемый иммунитетʺ. Последние два, как повсеместно известно, необходимы для борьбы с локальной инфекцией кишечника с внутриклеточными патогенами (Ivan Roitt, Essential Immunology, seventh edition, 1991, pages 206 ʺThe secretory immune system protects external mucosal surfacesʺ, 209 ʺDefense is by cell-mediated immunityʺ и 210 ʺActivated macrophages kill intracellular parasitesʺ). В статье Mike Roof 2005 года утверждается, что ʺРанние исследования относительно прототипа убитого бактерина подтверждают… что убитые вакцины не обеспечивают защитной реакции против образования колоний в кишечнике.ʺ (страница 2, левая колонка, второй полный абзац).

Живая вакцина Enterisol® Ileitis, в самом деле, лицензирована с целью уменьшения потерь прироста массы, связанных с инфекцией, и используется для этой цели. Недостатки этой вакцины заключаются в том, что она должна вводиться перорально, а это не является рутинным способом вакцинации свиньей, и что необходимо прекратить использование противомикробных средств для животных в течение шести дней (поскольку иначе бактерии в вакцине могут погибнуть). Другой недостаток заключается в том, что вакцина не лицензирована для уменьшения бессимптомного выведения бактерий. Очевидно, что данные, используемые для авторизации на рынке, не показывают уменьшения бессимптомного выведения бактерий. Недавняя публикация (Riber et al. in Vaccine 33, 2015, 156-162) подтверждает, что Enterisol® Ileitis вообще не обеспечивает защиты против бессимптомного выведения бактерий Lawsonia после инфекции. Это может показывать, что инфекция Lawsonia intracellularis в стаде животных может оставаться, даже если все животные вакцинируются и проблемы с приростом массы и клинические проявления значительно уменьшаются.

Цель изобретения

Главной целью настоящего изобретения является создание улучшенной вакцины, которую можно использовать для уменьшения отрицательного воздействия на ADWG, связанного с субклинической инфекцией Lawsonia intracellularis. Другой целью является создание улучшенной вакцины, которая, в дополнение к этому, обеспечивает уменьшение бессимптомного выведения бактерий у субклинически инфицированных животных.

Сущность изобретения

Для достижения главной цели настоящего изобретения, предназначена фармацевтическая композиция, как описано в разделе Область техники, к которой относится изобретение, выше, где эта композиция содержит неживой антиген Lawsonia intracellularis и фармацевтически приемлемый носитель, и она пригодна для системного введения.

Неожиданно, даже если неживые антигены Lawsonia, которые вводятся системно (например, как различные типы неживых антигенов Lawsonia, как описано в WO2009/144088), обычно, как понимается, не могут вызывать IgA и клеточный иммунитет, позволяя только вызывать локальную иммунную реакцию в кишечнике, обнаружено, что такая композиция может уменьшить отрицательное воздействие на ADWG, связанное с субклинической инфекцией Lawsonia intracellularis. Причина этого является неясной. Преимущества новой композиции по сравнению с живой вакциной, как известно в данной области, очевидны: новая композиция может вводиться системно, например, внутримышечно или интрадермально, и поскольку она содержит только неживые антигены Lawsonia, использование противомикробных средств не должно прерываться.

Определения

Вакцина представляет собой средство, которое защищает от инфекции после вакцинации патогенным микроорганизмом, то есть средство, которое предотвращает или уменьшает инфицирование микроорганизмом или расстройства, которые возникают в результате инфекции, как правило, посредством отрицательного влияния на сам микроорганизм, например, с помощью антител, у вакцинированного хозяина. Таким образом, вакцинация предотвращает или по меньшей мере понижает уровень инфекции и/или предотвращает или по меньшей мере понижает, уровень расстройства, возникающего в результате этой инфекции.

Неживой антиген бактерии дикого типа представляет собой любое вещество или соединение иное, чем живая бактерия как таковая, против которого может вызываться иммунологическая реакция, так что соответствующая вирулентная бактерия или один или несколько факторов вирулентности могут распознаваться иммунной системой хозяина в результате этой иммунной реакции, и они нейтрализуются, по меньшей мере, частично. Типичные примеры неживого антигена бактерии дикого типа представляют сбой убитые цельноклеточные бактерии, субъединицы бактерии, такие как поверхностно экспрессируемые белки и токсины. Последние два могут экспрессироваться или не экспрессироваться рекомбинантно. Относительно Lawsonia intracellularis, в данной области известны несколько типов неживого антигена, и они известны, например, из WO2009/144088 (убитые цельные клетки), W02005/070958 (субъединицы) и WO97/20050 (убитые цельные клетки).

Фармацевтически приемлемый носитель представляет собой биологически совместимую среду, то есть, среду, которая после введения не вызывает значительных отрицательных реакций у субъекта животного, способную презентировать антиген для иммунной системы субъекта животного после введения вакцины. Такой носитель может представлять собой жидкость, содержащую воду и/или любой другой биологически совместимый растворитель, но также может представлять собой твердый продукт, такой как обычно используется для получения высушенных вымораживанием вакцин (на основе сахаров и/или белков).

Субклиническая инфекция Lawsonia intracellularis представляет собой инфекцию, которая является почти бессимптомной или полностью бессимптомной (без признаков или симптомов), в частности, не показывает диареи или аномальных фекалий. Таким образом, субклинически инфицированное животное представляет собой бессимптомного носителя кишечной бактерии Lawsonia intracellularis, но оно может ассоциироваться с уменьшением прироста массы. Наличие субклинической инфекции идентифицируется с помощью микробиологической культуры фекалий или кишечника (для последнего, после забоя), или с помощью методик ДНК, таких как ее цепная реакция полимеразы.

Системное введение антигена означает, что антиген вводится таким образом, что он достигает циркуляторной системы организма (эта система включает сердечно-сосудистую и лимфатическую систему), влияя, таким образом, на организм в целом, а не в конкретную область, такую как желудочно-кишечный тракт. Системное введение может осуществляться, например, посредством введения антигенов в мышечную ткань (внутримышечно), в кожу (интрадермально), под кожу (подкожно), в слизистую (субмукозально) и в вены (внутривенно).

Период заключительного откорма свиней представляет собой период, когда свинья находится в возрасте примерно от 10 недель (имея вес приблизительно 25-30 кг) примерно до возраста 28 недель (имея вес примерно 110-130 кг). Период заключительного откорма представляет собой часть общего животноводческого периода, то есть периода между отлучением от матки (в возрасте приблизительно 3 недели) и возрастом 28 недель, в этом возрасте, большинство свиней забивают.

Композиция, содержащая убитые цельноклеточные бактерии в качестве антигена, содержит антиген, полученный от убийства живых цельноклеточных бактерий. Это не исключает того, что бактериальные клетки, по меньшей мере, частично, разрушаются в процессе убийства или что реально экстракт или гомогенат убитых цельных клеток получается в качестве антигена в ʺвакцине, содержащей убитые цельноклеточные бактерииʺ в смысле настоящего изобретения. Убитые цельноклеточные бактерии Lawsonia intracellularis известны, например, из WO2009/144088 и WO97/20050.

Варианты осуществления

В первом варианте осуществления вакцины, способ ее использования предназначен для уменьшения отрицательного воздействия на ADWG свиней в период заключительного откорма. В период заключительного откорма к организму животного добавляется главная часть его массы. В этот период отрицательное воздействие на ADWG оказывает самое большое отрицательное воздействие на конечную массу. Следовательно, принципиальная возможность уменьшения отрицательного воздействия на ADWG в этот период, как показано в разделе Примеры ниже в настоящем документе, является особенно преимущественной.

Во втором варианте осуществления вакцины в соответствии с настоящим изобретением, способ, в дополнение к этому, предназначается для уменьшения бессимптомного выведения бактерий Lawsonia intracellularis в результате субклинической инфекции у свиней. Неожиданно, даже бессимптомное выделение бактерий Lawsonia у субклинически инфицированных животных может быть понижено с помощью настоящей вакцины. Таким образом, не только инфекция свиней может подвергаться воздействию, так что имеется уменьшение отрицательного воздействия на ADWG, связанного с субклинической инфекцией Lawsonia, очевидно, что инфекция значительно уменьшается, так что значительно меньше бактерий выделяются бессимптомно субклинически инфицированным животным. Это является важным преимуществом для любого фермера, пытающегося остановить распространении бактерий в стаде животных.

В другом варианте осуществления вакцина вводится только один раз. Однократное введение вакцины, как показано, является эффективным. Вторая доза вакцины, как правило, вводимая через 2-4 недели после первой дозы, может улучшить уровень иммунной реакции.

В другом варианте осуществления вакцина вводится, когда свиньи находится в возрасте 3-10 дней. Посредством вакцинации свиней в таком молодом возрасте, может быть обеспечена ранняя защита, то есть защита непосредственно после отлучения от матки.

Еще в одном варианте осуществления неживой антиген Lawsonia intracellularis содержит углеводы, которые в живых бактериях Lawsonia intracellularis находятся в ассоциации с наружной клеточной мембраной этих бактерий. Эти углеводы, как показано, могут вызывать и вызывают специфичную иммунную реакцию анти-Lawsonia intracellularis (см. WO 2009/144088).

Еще в одном варианте осуществления неживой антиген Lawsonia intracellularis представляет собой антиген, очищенный из композиции, содержащей убитые бактерии Lawsonia intracellularis. Посредством очистки, неспецифичный бактериальный материал может удаляться с реального антигена, например, для уменьшения, если они присутствуют, любых побочных реакций.

В одном из практических вариантов осуществления неживой антиген Lawsonia intracellularis представляет собой убитые цельноклеточные Lawsonia intracellularis.

Примеры

Исследование 1

Схема исследования 1

Исследование осуществляют на стаде свиней голландской породы с инфекцией Lawsonia intracellularis (LI) у старших свиней на заключительном откорме и свинок для скрещивания. Исследование следует рандомизированной, контролируемой и слепой схеме.

Сто пятьдесят восемь поросят в возрасте 3-10 дней (большинство из них находится в возрасте 3-5 дней) распределяются случайным образом, выводками, в исследуемую или контрольную группу. Поросята в исследуемой группе вакцинируются инактивированной вакциной бактерина Lawsonia в эмульсии типа масло в воде (см. WO 2009/144088, Пример 3), при поступлении и снова через 3 недели. Поросята в контрольной группе получают инъекцию плацебо (эмульсии без антигена) в те же дни. Лекарственный препарат из группы антибиотиков, который является эффективным против LI (например, тирозин, линкомицин, тиамулин, тетрациклины), допускается для исследуемых животных.

После отлучения от матки, то есть в фазе доращивания и заключительного откорма, поросята из исследуемой и контрольной групп содержатся вместе. Далее, в течение доращивания и откорма не экспериментальные свиньи содержатся в тех же помещениях что и экспериментальные животные, но в других загонах.

Поросята рутинно проверяются на локальные и системные реакции через 4 часа, 1 день, 3 дня, 1 неделю и 2 недели после каждой вакцинации.

Образцы фекалий ото всех свиней отбирают через одно- или двухнедельные интервалы в течение периода ожидаемого экспонирования для исследуемой инфекции. Для лечебной группы, образцы фекалий от десяти животных собирают и анализируют на присутствие бактерий LI с помощью qPCR (далее называется также ʺPCRʺ). Если образец собранных фекалий показывает присутствие бактерий, оригинальные образцы из этого пула анализируются индивидуально. Сразу после того, как первые образцы становятся положительными, исследуют индивидуальные образцы фекалий. При первой вакцинации, через 10, 16 и 21-23 недели после первой вакцинации, всех животных взвешивают.

Результаты исследования 1

В течение исследований, инфекция Lawsonia уходит из стада, как показывают данные PCR на фекалиях (см. ниже). Поскольку ни одно из животных, за исключением одного животного в контрольной группе, не имеет никаких клинических симптомов, группа подвергается воздействию субклинической инфекции в результате полевого экспонирования для бактерий (дикого типа).

Бактериальная загрузка на фекалии

Средние результаты PCR приведены в Таблице 1, количество положительных животных и средняя концентрация ДНК LI приведены в Таблице 2.

После недели 13 у ряда контрольных животных обнаруживается ДНК от LI. Процент контрольных животных с положительными образцами фекалий постепенно возрастает от нуля на 12 неделях после первой вакцинации, как 2-8% в неделю, для недель 13-15, примерно до 18% в недели 16-18, после чего он уменьшается до 0% после недели 20.

Таблица 1. Бессимптомное выделение LI в фекалиях (qPCR)

В исследуемой группе (с вакциной) только один PCR- положительный образец фекалий обнаруживается в один день сбора для одного животного (1 положительная из 72 свиней, то есть 1,4%). В контрольной группе 31 из 75 животных имеют, по меньшей мере, один PCR-положительный образец фекалий (41,3%). Различие между группами является статистически значимым (точный критерий Фишера: значение p<0,001).

Таблица 2 Количество (и процент) животных с LI-положительными образцами и средняя концентрация LI в положительных образцах фекалий для группы с вакцинацией и через неделю после первой вакцинации.

Прирост массы тела

Массы тела и среднесуточный прирост массы приведены в Таблицах 3 и 4, ниже. ADWG считается релевантным параметром, который часто используется для измерения эффективности вакцин Lawsonia. Однако этот параметр является неспецифичным, поскольку на него оказывает воздействие несколько различных условий (вторичные инфекции, климат, корм, и тому подобное). Предварительно вычисленный размер выборки для получения статистически значимых значений (p<0,05) при разнице ADWG 25 грамм в день потребовал бы примерно 300 животных на группу. По причинам эффективности, реально используемые группы делают значительно меньше. В этом пилотном исследовании размеры групп составляют только 78 и 80 животных. Так что, даже если разница ADWG составляла бы примерно 25 грамм в день, согласно оценкам, получаемое в результате значение p было бы больше 0,05 в любом случае.

Таблица 3. Средняя масса тела (кг, ±SD), для группы с вакцинацией и периода. КонтрольВакцинаПоступление(3-10дней)1,4±0,3(n=76)1,5±0,3(n=80)Притранспортировкеназаключительныйоткорм(10недель)27,7±4,8(n=74)28,5±4,1(n=73)Третьевзвешивание(возраст±16недель)64,0±9,2(n=73)65,6±9,1(n=71)Последнеевзвешивание(возраст18-24недели)89,4±16,8(n=72)92,3±17,0(n=71)

Сравнение лечебной группы относительно среднесуточного прироста массы в течение фазы заключительного откорма (см. ниже) не приводит, как ожидалось, к статистически значимому различию (значение p=0,2042). При корректировке на фоновые значения, вакцинированная группа показывает более высокий суточный прирост массы в период заключительного откорма, в среднем на 21,4 грамма в день, чем для контрольной группы, с 90% доверительным интервалом в пределах от на 6,4 грамм в день ниже до на 49,2 грамма в день выше. Среднее различие 21,4 грамма в день само по себе является достаточным различием в ADWG. Средние значения по методу наименьших квадратов (LSM) для среднесуточного прироста массы для двух групп составляют 881 грамм в день для вакцинированной группы и 860 грамм в день для контрольной группы. Эти LSM соответствуют подгонке для сравнения групп с помощью ANCOVA, но слегка отличаются от обычных средних значений из Таблицы 3, поскольку они корректируются относительно малых различий в ковариате 'вес при вакцинации' между группами.

Таблица 4. Средний среднесуточный прирост массы тела в граммах*, для группы вакцинации и периода.

*: Средний ADWG регулируется для выводка, загрузки и массы при поступлении ± стандартная ошибка среднего значения (SEM) и 90% доверительного интервала.

Значение p для воздействия лечения на общий среднесуточный прирост массы составляет 0,2804. При корректировке на фоновые значения, вакцинированная группа показывает среднесуточный прирост массы, который на 12,5 г/день выше чем для контрольной группы. 90% доверительный интервал для этой оценки находится в пределах от роста, который на 6,6 г/день ниже, до роста, который на 31,5 г/день выше в вакцинированной группе, чем в контрольной группе.

Исследование 2

Схема исследования 2

Целью настоящего исследования является оценка эффективности такой же вакцины, как использовалась в первом исследовании для свиней на заключительном откорме в полевых условиях, но в качестве вакцины, вводимой однократно. Исследование осуществляют как рандомизированное, слепое, контролируемое солевым раствором исследование клинической эффективности. Примерно 750 поросят в возрасте 3-4 недели распределяют случайным образом в выводках в исследуемую или в контрольную группу. Поросята исследуемой группы вакцинируются один раз внутримышечно 2 мл вакцины, а поросятам контрольной группы вводят инъекцию 2 мл солевого раствора.

В возрасте 10 (±1) недель, 648 исследуемых поросят, 324 от каждой лечебной группы, транспортируют на ферму для заключительного откорма. С этого момента контрольных свиней содержат в загонах, отдельных от вакцинированных свиней, в том же помещении (8 загонов для 8-11 животных на лечебную группу на помещение) до забоя (в возрасте 25 недель)

Первый оцениваемый параметр представляет собой среднесуточный прирост массы (ADWG) для свиней между разными взвешиваниями: при поступлении, после транспортировки на ферму для заключительного откорма и непосредственно перед забоем. Второй оцениваемый параметр представляет собой бессимптомное выделение Lawsonia: после транспортировки на ферму для заключительного откорма, в возрасте 15 и 20 недель и непосредственно перед забоем.

Результаты исследования 2

В течение этого второго исследования, инфекция Lawsonia уходит через стадо, как показывают данные PCR на фекалиях. Только одно животное в контрольной группе имеет слабые клинические симптомы (как подтверждено, являющиеся результатом инфекции Lawsonia, как определено после некропсии). Таким образом, можно подтвердить, что группа подвергается субклинической инфекции в результате полевого экспонирования для бактерий (дикого типа).

Воздействие на ADWG показано в Таблице 5. Как можно увидеть, среднесуточный прирост массы в течение периода доращивания составляет 319 грамм, в день в исследуемой группе, и 307 грамм в день для контрольной группы. Различия в среднесуточном приросте массы (ADWG) в течение периода доращивания являются статистически значимо различными между контрольной и исследуемой группой (ANOVA: p=0,0203). ADWG в период заключительного откорма и общее значение ADWG также выше в исследуемой группе. Хотя различия в 7 грамм в день между контрольной и исследуемой группой являются коммерчески релевантными (они приводят к различию в конечном весе приблизительно 1,4 кг), они не являются статистически значимыми.

Таблица 5. Среднесуточный прирост массы (г/день), для группы вакцинации и периода

^ab Смешанная модель ANCOVA, p=0,0203

^cd Смешанная модель ANCOVA, p=0,6356

^ef Смешанная модель ANCOVA, p=0,4229

Относительно бессимптомного выделения Lawsonia, видно, что на неделю 6 исследований все образцы фекалий являются отрицательными относительно Lawsonia intracellularis. На неделю 11, семь образцов (19%) от контрольной группы являются положительными, а из исследуемой группы, ни одного. На неделе 16 семь образцов (19%) из контрольной группы и один из исследуемой группы являются положительными. На неделю 21 все животные опять являются отрицательными. Количество загонов с образцами фекалий положительными относительно Lawsonia согласно PCR (в течение 1 или 2 последовательных недель) в течение исследований значительно ниже в исследуемой группе (точный критерий Фишера, p<0,001) по сравнению с контрольной группой.