×
07.02.2019
219.016.b74c

РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pOptiVEC-MBP-Fc, КОДИРУЮЩАЯ КОНСТАНТНЫЙ ФРАГМЕНТ ИММУНОГЛОБУЛИНА ЧЕЛОВЕКА, СЛИТНОГО С ФРАГМЕНТОМ ОСНОВНОГО БЕЛКА МИЕЛИНА, ЛИНИИ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК - ПРОДУЦЕНТОВ УКАЗАННОГО БЕЛКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКА MBP-Fc ДЛЯ ТЕРАПИИ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА

Вид РИД

Изобретение

Юридическая информация Свернуть Развернуть
Краткое описание РИД Свернуть Развернуть
Аннотация: Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению терапевтических белков, и может быть использовано для получения слитого белка MBP-Fc, состоящего из лидерного пептида тяжелой цепи моноклонального антитела FI0, слитого с фрагментом основного белка миелина 84-106 (МВР) и затем с Fc-фрагментом антитела IgG 1 (домены СН2-СН3) человека, в клетках яичника китайского хомячка (СНО). Конструируют рекомбинантный бипромоторный вектор экспрессии pOptiVEC-MBP-Fc, обеспечивающий биосинтез бифункциональной молекулы MBP-Fc в культивируемых клетках СНО. Линию клеток CHO-S18 - продуцента MBP-Fc - получают путем трансфекции клеток линии СНО DG44 вектором pOptiVEC-MBP-Fc. Предложенное изобретение позволяет получить линию клеток СНО, стабильно продуцирующую в культуральную жидкость белок MBP-Fc с выходом 20 мкг в мл кондиционированной среды. 4 н. и 3 з.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл., 4 пр.
Реферат Свернуть Развернуть

Введение

Изобретение относится к биотехнологии, а именно: к способу получения бифункциональной молекулы для терапии рассеянного склероза (PC). Объектом исследования является химерный белок, состоящий из модуля доставки - пептида основного белка миелина МВР84-106, слитного с цитотоксическим модулем - константным доменом иммуноглобулина человека. Аутоантиген - пептид основного белка миелина МВР84-106 является одним из основных биомаркеров патологических лимфоцитов, при этом имеет высокую стабильность к протеолитической деградации. Константный домен иммуноглобулина человека является естественным сигналом иммунной системы для деградации клетки-мишени по механизму комплимент-зависимой цитотоксичности. Объединение перечисленных модулей в единую молекулу позволяет получать бифункцональный цитотоксический белок, направленно элиминирующий специфические патологические лимфоциты при PC.

Известны способы получения прототипов бифункциональных цитотоксических молекул в составе слитного белка на основе специфического пептида и токсических агентов на основе барназы, псевдомонадного токсина и константного Fc-домена антитела человека (Stepanov, А.V., Belogurov, A.A., Ponomarenko, N.A., Stremovskiy, О.A., Kozlov, L.V., Bichucher, А.М., et al. (2011). Design of Targeted В Cell Killing Agents. PloS One, 6(6), e20991. http://doi.org/10.1371/journal.pone.0020991.t001). Прототипы препаратов иммунотоксинов высокоспецифично (с избирательностью до 5000 раз в сравнении с иммунотоксином не содержащим таргетного участка) взаимодействовали с клетками мишенями и вызывали значительный цитотоксический эффект. Вариантов использования слитного белка МВР84-106 и константного домена иммуноглобулина человека на сегодняшний день не известно.

Область техники

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности, предложена рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая слитный белок МВР84-106 и константный домен иммуноглобулина человека. И способ получения белка MBP84-106-Fc для терапии рассеянного склероза.

Уровень техники

Изобретение относится к биотехнологии, а именно: к способу получения бифункционального агента для терапии социально-значимого заболевания - рассеянного склероза (PC).

Объектом разработки является пептид основного белка миелина МВР84-106, слитный с константным доменом иммуноглобулина человека. Аутоантиген - пептид основного белка миелина МВР84-106 является одним из основных биомаркеров патологических лимфоцитов при этом имеет высокую стабильность к протеолитической деградации. Константный домен иммуноглобулина человека является естественным сигналом иммунной системы для деградации клетки-мишени по механизму комплимент-зависимой цитотоксичности. Объединение перечисленных модулей в единую молекулу позволяет получать бифункцональный цитотоксический препарат, направленно элиминирующий специфические патологические лимфоциты при PC.

Известны способы получения прототипов бифункциональных цитотоксических молекул в составе слитного белка на основе специфического пептида и токсических агентов на основе барназы, псевдомонадного токсина и константного Fc-домена антитела человека (Stepanov, А.V., Belogurov, A.A., Ponomarenko, N.A., Stremovskiy, О.A., Kozlov, L.V., Bichucher, А.М., et al. (2011). Design of Targeted В Cell Killing Agents. PloS One, 6(6), e20991. Прототипы препаратов иммунотоксинов высокоспецифично (с избирательностью до 5000 раз в сравнении с иммунотоксином не содержащим таргетный участок) взаимодействовали с клетками мишенями и вызывали значительный цитотоксический эффект. Все представленные методики заключаются в генно-инженерном способе получения бифункциональных молекул, однако, способы получения слитного белка пептида основного белка миелина МВР84-106 с константным доменом иммуноглобулина человека, на настоящий момент не описаны.

Известна плазмида pYR-GCEVH, содержащая тяжелую цепь антитела HCAb к раку кишечника человека, и плазмида pYR-GCEVL, содержащая легкую цепь антитела к раку кишечника человека [Xiong Н., Ran Y., Xing J., Yang X., Li Y. and Chen Z. Expression vectors for human-mouse chimeric antibodies // Journal of Biochemistry and Molecular Biology. - 2005. - V. 38 (4). - P. 414-419]. Плазмида pYR-GCEVL включает в себя ген устойчивости к неомицину/генетицину под управлением раннего промотора вируса SV40 с удаленным энхансером. Транскрипция гена легкой цепи находится под контролем CMV на 5' конце и терминатора бычьего гормона роста (BGHT), на 3' конце находится сайт полиаденилирования. Плазмида pYR-GCEVH включает в себя ген dhfr под управлением раннего промотора вируса SV40. Транскрипция гена легкой цепи находится под контролем CMV на 5' конце и терминатора бычьего гормона роста (BGHT), на 3' конце находится сайт полиаденилирования.

Культура клеток dhfr (-) СНО (АТСС, США), дефицитных по дигидрофолатредуктазе (ДГФР), была ко-трансфецирована с использованием равных количеств плазмид pYR-GCEVH, pYR-GCEVL. После проведения нескольких раундов селекции была получена культура, клоны которой продуцировали химерные антитела с выходом от 30 до 100 мкг/мл кондиционированной среды [Xiong и др., 2005].

Известны плазмиды phCMV-VHRhD-g1C-neo и phCMV-VLRhD-KR-neo, кодирующие антитела против RhD антигена. Плазмида phCMV-VHRhD-g1C-neo содержит вариабельную и константную области тяжелой цепи под контролем главного раннего энхансера цитомегаловируса и промотор начала инициации транскрипции рекомбинантных тяжелых химерных цепей антитела, а также бактериальный ген устойчивости к неомицину под контролем раннего промотора SV40. Плазмида phCMV-VLRhDKR-neo содержит вариабельную и константную области легкой цепи под контролем раннего энхансера цитомегаловируса и промотор начала инициации транскрипции рекомбинантных легких химерных цепей антитела. В данной плазмиде ген устойчивости к неомицину под контролем раннего промотора SV40 был заменен геном dhfr из плазмиды pSV2-dhfr (Subramani S., Mulligan R., Berg P. Expression of the mouse dihydrofolatereductase complementary deoxyribonucleic acid in simian virus 40 vectors // Mol Cell Biol - 1981. - V. 1 (9). - P. 854-864). В обе плазмиды были внесены секреторные последовательности перед вариабельными доменами цепей антител, отделяющими их от интронных последовательностей. После проведения трансфекции клеточной линии СНО, дефицитной по гену ДГФР, и нескольких раундов селекции клонов, полученных из трансформированной культуры CHO-mAb с использованием МТХ (до 1000 нМ) и селективного антибиотика G418 (600 мкг/мл) были получены относительно устойчивые клоны с продукцией до 110 мкг/мл химерных антител [Chusainow J., Yang Y.S, Yeo J.H.M., Toh P.C., Asvadi P., Wong N.S.C., Miranda G.S. Yap. A Study of Monoclonal Antibody-Producing CHO Cell Lines: What Makes a Stable High Producer // Biotechnology and Bioengineering. - 2009. - V. 102 (4). - P. 1182-1196].

Раскрытие изобретения

Изобретение решает задачу создания технологии для ускорения и повышения экономичности процесса получения препарата основного белка миелина МВР84-106, слитого с константной областью человеческого антитела F10 (MBP84-106-Fc).

Технический результат достигается за счет увеличения уровня биологического синтеза MBP84-106-Fc клетками-продуцентами при использовании селективного цитостатического препарата (метотрексата).

Поставленная задача решается путем конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК, обозначенной pOptiVEC-MBP84-106-Fc, и содержащей

- фрагмент плазмиды pOptiVEC™-TOPO®, включающий промотор/энхансер ранних генов цитомегаловируса человека (CMV), внутренний сайт связывания (IRIS), ген ДГФР, сигнал полиаденилирования тимидинкиназы вируса герпеса, сайт начала репликации в Е. coli из плазмиды pUC, ген β-лактамазы, а также следующие модификации - единичный сайт узнавания рестриктазы MluI вместо сайта узнавания рестриктазы SalI в положении 23, единичные сайты узнавания рестриктаз NheI и XhoI после промотора CMV для клонирования ДНК МВР84-106-Fc;

- фрагмент ДНК, включающий фланкированную сайтами рестрикции NheI и XhoI кДНК MBP84-106-Fc под контролем промотора/энхансера ранних генов цитомегаловируса человека (CMV);

Также настоящее изобретение представляет способ получения культуры клеток яичника китайского хомячка СНО - продуцента MBP84-106-Fc путем трансфекции клеток упомянутой выше рекомбинантной плазмидной ДНК.

Также настоящее изобретение представляет линию клеток яичника китайского хомячка СНО - продуцента MBP84-106-Fc, называемую далее CHO-S18 и полученную путем трансфекции линии клеток СНО DG44 упомянутой выше рекомбинантной плазмидной

ДНК.

Также настоящее изобретение представляет способ получения MBP84-106-Fc, включающий:

- культивирование в питательной среде упомянутой линии клеток культуры СНО-S18,

- выделение полученного целевого белка из культуральной жидкости.

В частном варианте воплощения настоящего изобретения указанная плазмида может представлять собой плазмиду, состоящую из:

фрагмента плазмиды pOptiVEC™-TOPO®, включающего промотор/энхансер ранних генов цитомегаловируса человека (CMV), обеспечивающий высокий уровень экспрессии целевых белков в клетках млекопитающих, внутренний сайт связывания рибосом (IRES), ген ДГФР для ауксотрофной селекции трансфецированных клеток СНО DG44 и геномной амплификации стабильных клеточных линий с использованием метатрексата, сигнал полиаденилирования тимидинкиназы вируса герпеса для правильной терминации и процессинга рекомбинантных транскриптов, сайт начала репликации в Е. coli из плазмиды pUC, ген β-лактамазы, а также следующие модификации - единичный сайт узнавания рестриктазы MluI вместо сайта узнавания рестриктазы SalI в положении 23, единичные сайты узнавания рестриктаз NheI и XhoI после промотора CMV для клонирования кДНК МВР84-106;

NheI/XhoI - фрагмента ДНК, включающего фланкированную сайтами рестрикции NheI и XhoI кДНК лидерного пептида тяжелой цепи моноклонального антитела F10, необходимого для секреции рекомбинантного константного фрагмента иммуноглобулина человека, слитного с фрагментом основного белка миелина 84-106 из клеток-продуцентов СНО в культуральную среду, кДНК фрагмента основного белка миелина МВР84-106, кодирующую фрагмент основного белка миелина, включающий в себя аминокислотные остатки данного белка с 84 по 106 включительно, и кДНК константного фрагмента иммуноглобулина человека, а именно константных доменов СН2, СН3 тяжелой цепи иммуноглобулина изотипа IgG1 человека.

Наличие в плазмиде pOptiVEC-MBP84-106-Fc активного гена ДГФР, находящегося под контролем IRES, позволяет проводить селекцию и амплификацию чужеродных последовательностей, интегрированных в геном клетки СНО DG44 (dhfr-/- вариант линии клеток СНО-K1), в среде, содержащей метотрексат.

Технический эффект изобретения заключается в том, что культура, трансфецированная плазмидой pOptiVEC-MBP884-106-Fc продуцирует бифункциональную молекулу MBP84-106-Fc для терапии рассеянного склероза в среду культивирования.

Экспрессия бифункциональной молекулы MBP84-106-Fc может быть осуществлена в эукариотических клетках. Примером эукариотической клетки, пригодной для продукции слитного белка МВР84-106 с константным доменом иммуноглобулина человека, согласно настоящему изобретению являются, но не ограничиваются ими, клетки яичников Cricetulus griseus (СНО). Примерами клеток яичников Cricetulus griseus (СНО), применимых в рамках настоящего изобретения, являются, но не ограничиваются ими, клетки яичников Cricetulus griseus (СНО) клетки СНО DG44 (Invitrogen).

Способом согласно настоящему изобретению является способ получения МВР84-106-Fc, включающий выращивание трансформированных клеток эукариот в питательной среде и выделение полученных антител из культуральной жидкости.

Выращивание клеток эукариот осуществляют в атмосфере 5% СО2 в режиме культивирования с перемешиванием в синтетических средах, таких как среда OptiCHO, в течение 3-6 суток.

После выращивания твердые компоненты, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрации с использованием мембраны, а затем белок может быть выделен и очищен методом осаждения с солями, с использованием сульфата натрия или сульфата аммония, аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии и т.п.

Предложенные рекомбинантная плазмида pOptiVEC-MBP84-106-Fc и способ получения линии культивируемых клеток СНО, основанный на использовании рекомбинантной плазмиды pOptiVEC-MBP84-106-Fc, впервые получены авторами данного изобретения, в научной и патентной литературе не описаны.

Осуществление изобретения

Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pOptiVEC-MBP84-106-Fc.

Конструирование плазмиды pOptiVEC-MBP84-106-Fc проводят по схеме, изложенной на фигуре 1, с использованием праймеров, приведенных в таблице 1.

Последовательности:

SEQ ID NO: 1

аминокислотная последовательность лидерного пептида тяжелой цепи моноклонального антитела F10

SEQ ID NO: 2

нуклеотидная последовательность, кодирующая лидерный пептид тяжелой цепи моноклонального антитела F10

SEQ ID NO: 3

нуклеотидная последовательность, кодирующая фрагмент основного белка миелина 84-106 (МВР84-106)

SEQ ID NO: 4

аминокислотная последовательность фрагмента основного белка миелина 84-106 (МВР84-106)

SEQ ID NO: 5

нуклеотидная последовательность, кодирующая Fc-фрагмент антитела IgG1 (домены СН2-СН3) человека

SEQ ID NO: 6

аминокислотная последовательность Fc-фрагмента антитела IgG1 (доменов СН2-СН3) человека

Итоговая последовательность:

NheI

XhoI

Жирным шрифтом отмечен сигнальный пептид, подчеркиванием выделена область Fc, между сигнальным пептидом и областью Fc находится последовательность МВР84-106, после области Fc находится нетранслируемая область. На 5'- и 3'-концах курсивом выделены сайты узнавания рестриктаз NheI и XhoI, соответственно. Результирующая генетическая конструкция изображена на фигуре 2.

Пример 2. Получение линии CHO-S18, продуцента MBP84-106-Fc с применением плазмиды pOptiVEC-MBP84-106-Fc.

Для получения линии СНО-18, стабильного продуцента рекомбинантного слитного белка МВР84-106 с константным доменом иммуноглобулина человека проводят трансфекцию клеток яичника китайского хомячка СНО DG44 dhfr - плазмидой pOptiVEC-MBP84-106-Fc. Клетки культивируют в среде CD DG44 (Invitrogen) с добавлением 200 мМ раствора L-Глутамина до конечной концентрации 8 мМ и содержащей 0,18% (v/v) Pluronic F-68 (Invitrogen). Во флаконы Эрленмейера объемом 125 мл засевают 30 мл клеточной суспензии (4,5 млн клеток) при постоянном пемешивании на орбитальном шейкере с частотой 130 об/мин и через 20-24 ч проводят трансфекцию с использованием реагента Freestyle МАХ (Invitrogen) [Freestyle MAX Reagent Protocol, http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/freestyle_max_reagent_man.pdf]. Плазмидную ДНК добавляют к клеткам в виде ДНК-липосомного преципитата. Преципитат готовят следующим образом: при комнатной температуре во флакон А вносят 18 мкг ДНК плазмиды в 1200 мкл среды OptiPRO SFM (Invitrogen), перемешивают, добавляют 15 мкл реагента Freestyle MAX (Invitrogen), инкубируют от 10 до 20 минут при комнатной температуре. После инкубации перемешивают пипетированием и по каплям вносят в культуральный флакон. Культуральный флакон инкубируют при температуре 37°С, 98% влажности, в атмосфере 8% СО2 и непрерывном перемешивании 130 об/мин.

Через 48 ч после трансфекции клетки отмывают и помещают в ростовую среду CD OptiCHO (Invitrogen) (без тимидина и гипоксантина) с добавлением 200 мМ раствора L-Глутамина до конечной концентрации 8 мМ и содержащей 0,18% (v/v) Pluronic F-68 на 48 ч. Клетки инкубируют в селективной среде в течение двух недель, смену среды и поддержание концентрации клеток в среде проводят каждые трое суток.

Через 14 дней после помещения в селективные условия в культуре остаются клетки, способные существовать без добавления в среду тимидина и гипоксантина. При достижении культурой времени удвоения популяции 24 часа производят полную замену среды на среду CD DG44, содержащей 8 мМ L-Глутамина, 0,18% Pluronic F-68, 50 нМ метотрексата.

Через 14 дней после помещения в среду, содержащую метотрексат, остаются только клетки, способные существовать в присутствии 50 нМ метотрексата. При достижении культурой времени удвоения популяции 24 часа производят полную замену среды на среду CD DG44, содержащую 8 мМ L-Глутамина, 0,18% (v/v) Pluronic F-68, 100 нМ метотрексата.

Данную процедуру увеличения концентрации метотрексата проводят до тех пор, пока не будет достигнута устойчивость клеток к концентрации метотрексата равной 500 нМ.

Таким образом, получают культуру CHO-S18, клетки которой стабильно продуцируют MBP84-106-Fc в культуральную жидкость с выходом до 20 мкг/мл среды при культивировании в условиях перемешивания со скоростью 130 об/мин.

Пример 3. Получение, выделение и очистка белкового продукта с помощью линии клеток CHO-S18, продуцирующей MBP84-106-Fc.

Получение белкового продукта с применением линии CHO-S18 производят в колбах Эрленмейера различного объема без рассекателей в ростовой среде CD OptiCHO (без тимидина и гипоксантина) с добавлением 200 мМ раствора L-Глутамина до конечной концентрации 8 мМ и 0,18% (v/v) Pluronic F-68 без добавления дополнительных количеств питательных веществ при постоянном перемешивании с частотой 135 об/мин при температуре 37°С, 98% влажности в атмосфере 8% СО2. Культивирование для получения белкового продукта производят не менее 14 дней.

После окончания культивирования для получения продукта MBP84-106-Fc от культуры CHO-S18 полученную кондиционированную среду от культуры CHO-S18 центрифугируют при 4000 об/мин в течение 30 мин. Супернатант смешивают в соотношении 4:1 с Буфером для нанесения (50 мМ Трис-HCl, рН=7.0) и наносят на подготовленную Белок А-агарозную колонку (Gibco BRL, США). При элюции используют Буфер для элюции (100 мМ глицина, рН 3,0) и Нейтрализующий буфер (1 М Трис-HCl, рН 8,0). Колонку с 2 мл Белок А-агарозы промывают 3 раза по 4 мл Буфером для нанесения. Далее наносят смесь супернатанта кондиционированной среды и Буфера для нанесения. Образец наносят при комнатной температуре с помощью перистальтического насоса. После нанесения образца колонку промывают 3 раза по 20 мл Буфером для нанесения. Смывание белка MBP84-106-Fc с колонки производят с помощью 6 фракций по 2 мл Буфера для элюции. К образцу добавляют Нейтрализующий буфер в соотношении 1 часть буфера на 9 частей прошедшего через колонку Буфера для элюции.

Полученные образцы выделенного белка MBP84-106-Fc диализуют против ФСБ (фосфатно-солевой буфер, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4, 1,76 мМ KH2PO4, рН 7,4) и хранят при температуре +4°С.

Оценку гомогенности и степени очистки препарата проводят как с использованием электрофоретического метода, так и аналитической гель-проникающей ВЭЖХ.

Препараты рекомбинантных белка MBP84-106-Fc, полученные в ходе выделения с помощью аффинной хроматографии на Белок А-агарозе, анализируют на хроматографической ВЭЖХ системе Knauer (Германия), оснащенной колонкой Супердекс-200-10/300GL. Исследование проводят в протекающем буфере А (100 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, рН 7,5). Детекцию осуществляют при длине волны 230 нм УФ-детектором 2600 (UV detector 2600).

Элюция MBP84-106-Fc с колонки происходит в интервале 31-34 мин от момента старта проведения хроматографического анализа. Данные хроматографического анализа свидетельствуют о более чем 98%-ной чистоте полученного препарата рекомбинантных антител.

Электрофорез проводят в 10%-ном полиакриламидном геле. В качестве контроля используют неокрашенный белковый маркер молекулярных весов (Fermentas, Великобритания). Перед внесением к 15 мкл образца антител добавляют 5 мкл Буфера для нанесения с 2-меркаптоэтанолом (2-МЭ) (200 мМ Трис-HCl, рН 6,8, 400 мМ 2-МЭ, 4% натрия додецилсульфат, 0,01% бромофеноловый синий, 40%-ный глицерин). Образцы для внесения на гель инкубируют при температуре 95°С в течение 5 мин.

Полученные образцы продукта MBP84-106-Fc (Фиг. 3) характеризуются следующими показателями:

- гомогенность препарата не менее 98% (по данным гель-электрофореза в 10%-ном полиакриламидном геле с денситометрией);

- молекулярная масса - 28119 Да (по данным гель-электрофореза с белковыми маркерами молекулярных весов);

Пример 4. Получение, выделение и очистка MBP84-106-Fc с применением гель-проникающей хроматографии

После окончания культивирования для получения препарата рекомбинантного MBP84-106-Fc полученную кондиционированную среду от культуры CHO-S18 центрифугируют при 4000 об/мин в течение 30 мин. Супернатант смешивают в соотношении 4:1 с Буфером для нанесения (50 мМ Трис-HCl, рН 7,0) и наносят на подготовленную Белок А-агарозную колонку (Gibco BRL, США). При элюции используют Буфер для элюции (100 мМ глицина, рН 3,0) и Нейтрализующий буфер (1 М Трис-HCl, рН 8,0). Колонку с 2 мл Белок А-агарозы промывают 3 раза по 4 мл Буфером для нанесения. Далее наносят смесь супернатанта кондиционированной среды и Буфера для нанесения. Образец наносят при комнатной температуре с помощью перистальтического насоса. После нанесения образца колонку промывают 3 раза по 20 мл Буфером для нанесения. Смывание препарата рекомбинантного Fc-MBP с колонки производят с помощью 6 фракций по 2 мл Буфера для элюции. К образцу добавляют Нейтрализующий буфер в соотношении 1 часть буфера Полученные образцы выделенных антител диализуют против ФСБ (фосфатно-солевой буфер, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4, 1,76 мМ KH2PO4, рН 7,4), концентрируют с помощью Amicon Ultracel (10000NMWL) до 4 мл (15 мин 4°С, 5000g) и хранят при температуре +4°С. Проводят гель-фильтрационную хроматографию с использованием хроматографической колонки Superdex 75 16/600 GL (GE Healthcare Life Sciences). Буфер нанесения: ФСБ (фосфатно-солевой буфер, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4, 1,76 мМ KH2PO4, рН 7,4). Скорость потока: 2,5 мл/мин. Очищенная фракция препарата рекомбинантного Fc-MBP выходит с 0,4 по 0,47 объем колонки. Типичная хроматограмма процесса очистки представлена на фигуре 4.

Оценку гомогенности и степени очистки препарата проводят как с использованием электрофоретического метода, так и иммуноферментного анализа. Элюция препарата рекомбинантного MBP84-106-Fc с колонки происходит в интервале 0,4-0,47 объема колонки от момента старта проведения хроматографической очистки.

Электрофорез проводят в 12%-ном полиакриламидном геле. В качестве контроля используют неокрашенный белковый маркер молекулярных весов (Fermentas, Великобритания). Перед внесением к 15 мкл образца антител добавляют 5 мкл Буфера для нанесения с 2-меркаптоэтанолом (2-МЭ) (200 мМ Трис-HCl, рН 6,8, 400 мМ 2-МЭ, 4% натрия додецилсульфат, 0,01% бромофеноловый синий, 40%-ный глицерин). Образцы для внесения на гель инкубируют при температуре 95°С в течение 5 мин.

Иммуноферментный анализ препарата рекомбинатного MBP84-106-Fc, приведенный на фигуре 5, проводили с использованием антивидовых антител анти-Fc (anti-human anti-Fc hrp Sigma Aldrich). Препарат рекомбинатного MBP84-106-Fc анализировали в двукратных разведениях от 6 до 50 нг/мл (в соответсвии с оптической плотностью белка). В качестве калибровки и положительного контроля использовалась титровка препарата поликлональных очищенных антител человека из сыворотки крови (hAb) при концентрации от 6 до 50 нг/мл.

Полученные образцы препарата рекомбинантного MBP84-106-Fc характеризуются следующими показателями:

- гомогенность препарата не менее 98% (по данным гель-электрофореза в 12%-ном полиакриламидном геле с денситометрией);

- молекулярная масса - 28000 Да (по данным гель-электрофореза с белковыми маркерами молекулярных весов);

Изобретение иллюстрируют следующие графические материалы:

Фиг. 1. Схема конструирования экспрессионной плазмиды pOptiVEC-MBP84-106-Fc. PCMV - CMV промотор; EMCV IRES - независимый сайт инициирования рибосомы; NheI, XhoI - эндонуклеазы рестрикции

Фиг. 2. Физическая карта рекомбинантной плазмиды pOptiVEC-MBP84-106-Fc со следующими обозначениями: bla promoter - промотор гена β-лактамазы, CMV promoter -промотор/энхансер ранних генов цитомегаловируса человека, CMV Forward priming site -сайт отжига праймера CMV Forward, МВР84-106 - пептид основного белка миелина, Fc -константный домен тяжелой цепи антитела F10 человека, EMCV IRES reverse primer binding site - сайт отжига праймера EMCV IRES reverse primer, EMCV IRES - внутренний сайт связывания рибосом (IRES) вируса энцефаломиокардита, DHFR - ген дигидрофолатредуктазы, TK polyA - сигнал полиаденилирования тимидинкиназы вируса герпеса, pUC origin - последовательность, отвечающая за репликацию плазмиды pUC, Ampicillin (bla) resistance gene - ген устойчивости к антибиотику ампициллину. MluI, SphI, XhoI, SacII, NheI, NdeI, XbaI, SalI, BglII, PvuI - сайты эндонуклеаз рестрикции.

Фиг. 3. Электрофореграмма с денситометрией рекомбинантного препарата MBP84-106-Fc со следующими обозначениями: кДа - белковые стандарты молекулярного веса; Е1 - объединенная фракция препарата MBP84-106-Fc; kDa - единица молекулярного веса, килодальтон.

Фиг. 4. Профиль гель-фильтрационной хроматографии с использованием колонки Superdex75 для финальной очистки препарата рекомбинатного MBP84-106-Fc

Фиг. 5. Иммуноферментный анализ по специфическому узнаванию антител анти-Fc (anti-human) с препаратом рекомбинатного Fc-MBP. В качестве калибровки и положительного контроля использовалась титровка препарата поликлональных очищенных антител человека из сыворотки крови (hAb) при концентрации от 6 до 50 нг/мл.

Таблица 1. Структура использованных олигонуклеотидов.

Заявка № 2016152258/10(083704) (дата подачи 29.12.2016, заявитель Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической зимии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук(ИБХ РАН), RU)

РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pOptiVEC-MBP84-106-Fc, КОДИРУЮЩАЯ КОНСТАНТНЫЙ ФРАГМЕНТ ИММУНОГЛОБУЛИНА ЧЕЛОВЕКА, СЛИТНОГО С ФРАГМЕНТОМ ОСНОВНОГО БЕЛКА МИЕЛИНА, ЛИНИИ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК – ПРОДУЦЕНТОВ УКАЗАННОГО БЕЛКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКА MBP84-106-Fc ДЛЯ ТЕРАПИИ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА

Последовательности:

SEQ ID NO:1

аминокислотная последовательность лидерного пептида тяжелой цепи моноклонального антитела F10

MAWVWTLLFLMAAAQSAQA

SEQ ID NO:2

нуклеотидная последовательность, кодирующая лидерный пептид тяжелой цепи моноклонального антитела F10

ATGGCTTGGGTGTGGACCTTGCTATTCCTGATGGCAGCTGCCCAAAGTGCCCAAGCA

SEQ ID NO:3

нуклеотидная последовательность, кодирующая фрагмент основного белка миелина 84-106 (MBP84-106)

GAAAACCCGGTAGTCCACTTCTTCAAGAATATTGTGACGCCGCGTACTCCGCCGCCATCTCAGGGCAAA

SEQ ID NO:4

аминокислотная последовательность фрагмента основного белка миелина 84-106 (MBP84-106)

ENPVVHFFKNIVTPRTPPPSQGK

SEQ ID NO:5

нуклеотидная последовательность, кодирующая Fc-фрагмент антитела IgG1 (домены CH2-CH3) человека

GACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA

SEQ ID NO:6

аминокислотная последовательность Fc-фрагмента антитела IgG1 (доменов CH2-CH3) человека

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK


РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pOptiVEC-MBP-Fc, КОДИРУЮЩАЯ КОНСТАНТНЫЙ ФРАГМЕНТ ИММУНОГЛОБУЛИНА ЧЕЛОВЕКА, СЛИТНОГО С ФРАГМЕНТОМ ОСНОВНОГО БЕЛКА МИЕЛИНА, ЛИНИИ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК - ПРОДУЦЕНТОВ УКАЗАННОГО БЕЛКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКА MBP-Fc ДЛЯ ТЕРАПИИ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pOptiVEC-MBP-Fc, КОДИРУЮЩАЯ КОНСТАНТНЫЙ ФРАГМЕНТ ИММУНОГЛОБУЛИНА ЧЕЛОВЕКА, СЛИТНОГО С ФРАГМЕНТОМ ОСНОВНОГО БЕЛКА МИЕЛИНА, ЛИНИИ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК - ПРОДУЦЕНТОВ УКАЗАННОГО БЕЛКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКА MBP-Fc ДЛЯ ТЕРАПИИ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pOptiVEC-MBP-Fc, КОДИРУЮЩАЯ КОНСТАНТНЫЙ ФРАГМЕНТ ИММУНОГЛОБУЛИНА ЧЕЛОВЕКА, СЛИТНОГО С ФРАГМЕНТОМ ОСНОВНОГО БЕЛКА МИЕЛИНА, ЛИНИИ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК - ПРОДУЦЕНТОВ УКАЗАННОГО БЕЛКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКА MBP-Fc ДЛЯ ТЕРАПИИ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА
Источник поступления информации: Роспатент

Showing 1-10 of 111 items.
20.02.2013
№216.012.26f9

Полипептид из морской анемоны heteractis crispa, обладающий анальгетическим действием

Изобретение относится к области биохимии, а именно к биологически активным полипептидам, обладающим анальгетическим действием. Предложен полипептид π-AnmTX Her 1b-1, обладающий анальгетическим действием и имеющий следующую аминокислотную последовательность:...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002475497
Дата охранного документа: 20.02.2013
10.09.2013
№216.012.66bf

Лигнан, обладающий анальгетическим действием

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к биологически активному соединению, обладающему анальгетическим действием. Лигнан, обладающий анальгетическим действием, структура которого описывается как...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002491950
Дата охранного документа: 10.09.2013
10.03.2014
№216.012.a94e

Способ включения квантовых точек методом соосаждения в пористые частицы карбоната кальция

Изобретение может быть использовано в биологических и медицинских исследованиях. Пористые частицы карбоната кальция формируют в результате реакции CaCl+2NaHCO→CaCO↓+2NaCl+2H, причем водный раствор квантовых точек, модифицированных избыточным количеством меркаптоуксусной кислоты, имеющей...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002509057
Дата охранного документа: 10.03.2014
27.05.2014
№216.012.cb0c

Флуоресцентный зонд и тест-система для определения активности фосфолипазы а2

Настоящее изобретение относится к области генной инженерии, конкретно к созданию тест-систем на основе флуоресцентных зондов, которые могут быть использованы в качестве субстратов для фосфолипаз А1 и А2. Зонд с наименованием...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002517746
Дата охранного документа: 27.05.2014
10.06.2014
№216.012.ccfe

Способ определения неспецифической устойчивости патогенных микроогранизмов к антибиотикам на основании измерения каталитической активности фосфодиэстераз, расщепляющих циклический дигуанозинмонофосфат

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой способ определения неспецифической устойчивости патогенных микроорганизмов к антибиотикам и факта присутствия бактериальных биопленок на основании измерения каталитической активности фосфодиэстераз, расщепляющих циклический...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002518249
Дата охранного документа: 10.06.2014
20.07.2014
№216.012.decd

Способ длительного хранения in vitro растений осины

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Изобретение представляет собой способ хранения растений осины в условиях in vitro, включающий культивирование микропобегов осины на питательной среде WPM с добавлением сахарозы 10-20 г/л, агар-агара 9 г/л и витаминов MS 1 мл/л, сорбитола...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002522823
Дата охранного документа: 20.07.2014
27.08.2014
№216.012.efa8

Рекомбинантные плазмидные днк, кодирующие гибридные полипептиды со свойствами красного флуоресцентного белка mcherry, для продуцирования гибридных флуоресцентных белков в escherichia coli

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой рекомбинантные плазмидные ДНК, кодирующие гибридные полипептиды со свойствами красного флуоресцентного белка mCherry. Рекомбинантная плазмидная ДНК pChFN3 кодирует гибридный белок ChFN3, который имеет свойства красного флуоресцентного...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002527171
Дата охранного документа: 27.08.2014
10.09.2014
№216.012.f3d8

Способ оценки чувствительности клеток рака легкого к доксорубицину на основании уровней экспрессии маркерных генов и набор для его осуществления

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ оценки чувствительности клеток рака легкого к доксорубицину (IC50), а также набор для осуществления данного способа. Способ основан на сравнении уровней экспрессии маркерных генов АВСС1, ERCC1, FTL, GSTP1, МТ2А, RRM1, TUBB3 в...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002528247
Дата охранного документа: 10.09.2014
10.11.2014
№216.013.0489

Способ формирования многофункциональных микросистем

Изобретение относится к области химии высокомолекулярных соединений, в частности к способам получения полимерных носителей путем химической модификации исходных полимерных микросфер на основе сополимера акролеина-стирола, полученных безэмульгаторной радикальной полимеризацией. Способ включает...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002532559
Дата охранного документа: 10.11.2014
10.04.2015
№216.013.3eea

Способ выявления белков в разных типах клеток млекопитающих и человека с помощью флуоресцеин-5-изотиоцианата на микроскопическом уровне

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для анализа локализации и содержания белкового компонента в клетках млекопитающих с различным уровнем синтетических процессов. Предлагается способ выявления внутриклеточных белков с помощью флуоресцеин-5-изотиоционата (ФИТЦ) в...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002547594
Дата охранного документа: 10.04.2015
Showing 1-10 of 66 items.
10.06.2013
№216.012.4729

Биогибридный материал для сорбции и деградации нефти и нефтепродуктов

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при безотходной очистке от аварийных разливов нефти и нефтепродуктов водных и твердых поверхностей. Предложен биогибридный материал для сорбции и деградации нефти и нефтепродуктов поверхностных и донных отложений. Материал включает...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002483797
Дата охранного документа: 10.06.2013
20.11.2013
№216.012.8260

Способ выделения рекомбинантных белков

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано при получении рекомбинантных форм представляющих практический интерес белков. Предложен способ получения рекомбинантного белка через его гибридный предшественник с природным сайтом расщепления энтеропептидазой, который...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002499052
Дата охранного документа: 20.11.2013
10.12.2013
№216.012.88ba

Способ ренатурации мембранных белков

Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии. Предложен способ получения ренатурированных мембранных белков. Способ включает получение гомогенного раствора, содержащего денатурированный мембранный белок, смесь детергентов, фосфолипид или смесь фосфолипидов и аполипопротеин или...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002500684
Дата охранного документа: 10.12.2013
20.02.2014
№216.012.a240

Способ получения биомассы зеленых микроводорослей, обогащенной жирными кислотами

Изобретение относится к фотобиотехнологии и микробиологии. Инокулят миуроводоросли Desmodesmus sp.штамм 2С166Е вносят в минеральную среду BG-11 до конечной концентрации хлорофилла в смеси 4-6 мкг/мл. Культивируют при постоянном освещении и барботировании среды атмосферным воздухом в течение...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002507251
Дата охранного документа: 20.02.2014
27.03.2014
№216.012.ae11

Способ получения клеток для заместительной клеточной терапии патологий печени

Изобретение относится к области клеточной биологии и медицины. Предложен способ получения клеток для заместительной клеточной терапии печени, заключающийся в выделении из подчелюстной слюнной железы популяции стволовых клеток, экспрессирующей маркеры CD49f и EpCAM, инкубировании ее с...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002510276
Дата охранного документа: 27.03.2014
20.08.2014
№216.012.ebf5

Рекомбинантная плазмидная днк pest877, детерминирующая экспрессию полипептида с активностью эстеразы psychrobacter cryohalolentis к5 на поверхности клеток escherichia coli, и штамм бактерий escherichia coli bl21(de3)plyss/pest877-продуцент полипептида с активностью эстеразы psychrobacter cryohalolentis к5 на поверхности клеток

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и касается рекомбинантной плазмидной ДНК pEst877, детерминирующей экспрессию полипептида с активностью эстеразы P. cryohalolentis К5Т на поверхности клеток, с мол. массой 3,64 Md (5,519 т.п.о.), состоящей из NcoI/XhoI - фрагмента ДНК...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002526213
Дата охранного документа: 20.08.2014
27.08.2014
№216.012.efa8

Рекомбинантные плазмидные днк, кодирующие гибридные полипептиды со свойствами красного флуоресцентного белка mcherry, для продуцирования гибридных флуоресцентных белков в escherichia coli

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой рекомбинантные плазмидные ДНК, кодирующие гибридные полипептиды со свойствами красного флуоресцентного белка mCherry. Рекомбинантная плазмидная ДНК pChFN3 кодирует гибридный белок ChFN3, который имеет свойства красного флуоресцентного...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002527171
Дата охранного документа: 27.08.2014
20.09.2014
№216.012.f636

Биоразлагаемый композиционный сорбент нефти и нефтепродуктов

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен биоразлагаемый композиционный сорбент нефти и нефтепродуктов. Сорбент содержит термопластичный полимер с волокнообразующими свойствами, полученный методом аэродинамического формования, и нестерильные растения рода Сфагнум (Sphagnum),...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002528863
Дата охранного документа: 20.09.2014
20.10.2014
№216.013.009b

Рекомбинантная плазмидная днк рет3.54, кодирующая полипептид fn3.54, взаимодействующий с фактором некроза опухолей человека, и штамм бактерий escherichia coli - продуцент полипептида fn3.54, взаимодействующего с фактором некроза опухолей человека

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК pET3.54, кодирующую полипептид FN3.54, взаимодействующий с фактором некроза опухолей человека. Настоящее изобретение раскрывает также рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli BL21(DE3)/pET3.54 -...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002531547
Дата охранного документа: 20.10.2014
10.12.2014
№216.013.0ee2

Биогибридный композиционный материал

Изобретение относится к безотходной очистке от аварийных разливов нефти и нефтепродуктов природных и искусственных водоемов, сточных вод, жидких отходов производств, твердых поверхностей, а также в качестве превентивной меры. Сорбент включает термопластичный полимер с волокнообразующими...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002535227
Дата охранного документа: 10.12.2014
+ добавить свой РИД